Multi-protein Quantitative Analysis in Human Urine Using Surface Plasmon Resonance

材料与试剂

1. CM5芯片
2. PBS-P+ buffer,10× 缓冲液 (0.2 M phosphate buffer, 27 mM KCl and 1.37 M NaCl, 0.5% Surfactant P20, pH 7.4, Cytiva Company)
3. 人血清清蛋白及其特异性抗体 (Bio-Rad Company)
4. beta-2微球蛋白及其特异性抗体 (Sino Biological Inc,China)
5. kappa轻链蛋白及其特异性抗体 (Bio-Rad Company)
6. lambda轻链蛋白 (Bio-Rad Company)，其特异抗体 (Exbio Praha)
7. N-hydroxysuccinimide (NHS) (Cytiva Company)
8. N-(3-dimethylaminopropyl)-N′ -ethyl carbodiimide hydrochloride (EDC) (Cytiva Company)
9. 10 mM醋酸钠 (Cytiva Company)
10. 乙醇胺（GE Healthcare）(Cytiva Company)
11. 甘氨酸盐酸pH1.5 (Cytiva Company)
12. 牛血清白蛋白 (BSA)
13. NaCl, NaOH, 甘油以及其他试剂 （北京华泰昕生物医疗技术有限公司）
    
14. Running buffer（见溶液配方）
    

仪器设备

1. Biacore T100 (Cytiva Company)
2. SORVALL LEGEND MICRO 17R Centrifuge (Thermo scientific)
3. Millipore超纯水仪
   

实验步骤

以B2M轻链蛋白为例具体说明实验步骤，其他三种蛋白检测步骤相同。

一、实验前的准备
running buffer的准备：10× PBS-P buffer加入450 mL超纯水，现用现配。使用前对光肉眼仔细观察，有无杂质；如果有，需用0.22 μm膜过滤。（以下简称buffer）。
仪器准备：将处于standby状态的仪器stop standby。Unlock chip，取出维护芯片，更换成本次使用的CM5芯片，注意芯片上箭头方向朝内，dock芯片。将维护用水更换成running buffer，prime。
配体的准备：B2M轻链蛋白抗体，buffer完全溶解至 1 mg/mL ，4 °C，13,000转离心3分钟，转管备用。
分析物的准备：B2M轻链蛋白标准品，buffer完全溶解至 1 mg/mL，4 °C，13,000转离心3分钟，转管备用。
以上配体与分析物需要现用现配。
人尿液样本4 °C，13,000转离心8分钟。取上清用0.22 μm过滤膜过滤备用。

二、配体的偶联：配体偶联条件及预实验条件摸索
预实验：运行一个新实验，选择Fc4，流速20 μL/分钟。
1. 考察分析物B2M轻链蛋白标准品与芯片表面是否存在非特异性结合：1 mg/mL B2M轻链蛋白标准品，buffer稀释至0.1 μM和1 μM（B2M分子量为13.5KD，1 μM约为13.5 μg/ml），手动进样60 s，50 mM NaOH再生。图1A。结论：没有非特异结合，适合作为分析物。
2. 考察分析物人尿液样品与芯片表面是否存在非特异性结合，前述处理人尿液样品用buffer稀释2倍，手动进样120 s，50 mM NaOH再生。图1B。无非特异性结合，可以作为分析物。
3. 配体偶联pH选择：将1 mg/mL的B2M轻链蛋白抗体用pH 4.0，pH 4.5，pH 5.0 (p H3.5＜pH＜PI) 10 mM醋酸钠分别配制为10 μg/mL，进样60 s，50 mM NaOH再生。溶解时，先在EP管中加入醋酸钠buffer，随后加入B2M轻链蛋白抗体的瞬间，观察是否有沉淀。有沉淀的pH条件，无法继续实验。选择斜率大，进样结束接近基线的pH，同等条件选择缓和pH。这个实验中三个pH均可偶联，选择最温和5.0的实验条件。图3。根据目标偶联量确定偶联时配体浓度为4 μg/mL。图1C。


图1 预实验（A）分析物B2M轻链蛋白标准品与芯片表面的非特异性结合（B）分析物人尿液样品与芯片表面的非特异性结合（C）配体B2M轻链蛋白抗体偶联pH选择

三、实验方法的建立
1. 偶联：配体偶联量：这个实验目的是定量尿液样品中的B2M轻链蛋白的含量，所以选择中高偶联。运行一个新循环，选择Fc4，流速10 μL/分钟。EDC/NHS避光解冻，10,000转离心1分钟，各取60 μL完全混合，进样420 s活化，活化高度100-200RU；1 mg/mL的B2M轻链蛋白抗体用pH 5.0醋酸钠稀释到4 μg/mL，进样300 s，乙醇胺盐酸封闭420 s。图2A。
2. 分析物测试条件摸索：运行一个新循环，选择Fc4-3，流速20 μL/分钟。将1 mg/ml B2M轻链蛋白标准品用buffer稀释成0.1, 1 μM，手动进样60 s，pH1.8甘氨酸再生30 s。初步考察B2M轻链蛋白与抗体的结合情况。图2B。


图2（A）配体B2M轻链蛋白抗体偶联示意图（B）B2M轻链蛋白标准品测试条件摸索

3. 建立标准曲线&检测样品：运行一个新实验，选择Fc3，4，流速30 μL/分钟。将1 mg/mL B2M轻链蛋白标准品用buffer稀释成0、0.008438、0.01688、0.03375、0.0675、0.135、0.27、0.54、1.08 μg/mL 9个浓度梯度，以buffer为0浓度；将准备好的尿液样品，用buffer分别稀释2倍，5倍，10倍。运行自动化实验，方法如下：进样120 s，解离90 s，pH1.8甘氨酸再生30 s。
图3以时间为横坐标，Fc4-3 SPR信号RU为纵坐标，获得B2M和样品的SPR曲线图。图4以浓度为横坐标，Fc4-3 SPR信号RU为纵坐标，在Evaluation软件中获得B2M轻链蛋白的标准曲线和各尿液样品中B2M含量。


图3 标准曲线和人尿液样品分析自动化实验方法


图4（A）B2M SPR曲线图（B）各尿液样品SPR曲线图

4. 实验步骤示意图（图5）


图5 实验步骤示意图

四、数据分析与数据解析
以浓度为横坐标，Fc4 SPR信号RU为纵坐标，在Evaluation软件中获得B2M轻链蛋白的标准曲线和各尿液样品中B2M含量，图6。在T200 Evaluation Software中，选择Concentration Analysis,Using calibration,软件自动给出得出标准曲线和B2M蛋白含量。选择Calibration tab 下的Calibration curve,左侧为各个标准品的具体反应值，右侧为标准曲线。其中，0浓度的反应值为4.1，非常接近0点；9个浓度梯度呈递增关系；最高浓度1.08 μg/mL,反应值为486.9，从整个曲线形状看，已接近饱和。标准曲线校正后的浓度与使用的每个标准品浓度非常接近。综上表明，这条标准曲线浓度范围区间跨度大且合理。Control Samples tab下PBST反应值3.5非常接近0。Samples tab下，右侧为人尿液样品中B2M的反应值落在标准曲线中的位置，均落在标准曲线内；结合左侧表格，可以精确定量所有人尿液样品中B2M的含量。


图6 T200 Evaluation Software分析标准曲线和人尿液样品

实验注意要点

处理人尿液样品时，必须离心，过滤，防止堵塞IFC。

结果与数据分析

在A、B、C、D、E、F六份人尿液样品中，D-Urine中B2M的含量明显高于其他样品。D-Urine为病人样品，其他为正常人样品。表明B2M可以作为肾病诊断的蛋白标记物。

溶液配方

1. Running buffer
   10× 商品化PBS-P 50 ml加入450 mL超纯水，现用现配。使用前需确定无杂质（以下简称buffer）。
   

致谢

感谢以下资金项目支持：国家自然科学基金项目（No.61971026, 81871505），北京市自然科学基金项目 (No.4202053)，北化-中日联合项目 (XK2020–15)。

参考文献

1. Zhang, L., Wang, H., Zhang, H., Zhang, N., Zheng, X., Li, W., Qiu, X. and Yu, D. (2022). Development of a portable multiplexed instrument for multi-proteins detection in human urine using surface plasmon resonance. Sens Actuators, B. 369: 132272. https://doi.org/10.1016/j.snb.2022.132272
2. Zhang, L., Zhang, H., Huang, Y., Zhang, J., Chen, X., Chen, Y., Miao, G., Liu, L., Yu, D., Qiu, X., et al. (2019). Detection of Kappa Light Chain Protein in Human Urine by Surface Plasmon Resonance. Nanoscience and Nanotechnology Letters 11(12): 1666–1670. https://doi.org/10.1166/nnl.2019.3052