材料和试剂

1. 100在去离子（DI）水毫摩尔ATP储备溶液缓冲至pH 7.5（一个liquoted并储存在-80 ℃下）（西格玛- Aldrich公司，Ç atalog号：A7699）
2.云母（SPI Chem Mica Grade V-1 50 × 25 mm × 0.15 mm，目录号：12001-26-2）（图1）

图URE 1 。SPI Chem Mica 用于原子力显微镜 (AFM) 实验

3.氨丙基硅油 (APS)（Shlyakhtenko等人，2013 年）
4. HEPES（Fisher Bioreagent，目录号：7365-45-9）
5.钠Ç hloride（氯化钠）（西格玛- Aldrich公司，目录号：7647-14-5）
6.镁Ç hloride氯化镁（MgCl 2 ）（Fisher化学公司，目录号：7791-18-6）
7.甘油（EMD Millipore，目录号：356350）
8. Nonidet P-40（NP-40）（ThermoFisher Scientific，目录号：85124）
9. Nt.BstNBI（NEB，目录号：R0607S）
10. Amicon超滤（Millipore，目录号：C82301，MW 100K）
11. ScaI 限制酶（NEB，目录号：R3122S）
12. pscwo1 质粒（Addgene ，目录号：72300）
13.解旋酶成像缓冲液（见配方）
14. APS 工作解决方案（见配方）
15.缓冲液 3.1：1 ×缓冲液成分：NEB （见配方）

设备

纳米d ROP 2000C（Thermoscientific，Ç atalog号：ND-2000C ）
用于空气成像的 AFM 提示 – Pointprobe PPP-FMR 探头（纳米传感器，弹簧常数k = 2.8 N/m，共振频率 f r = 70 kHz）。
缓冲液成像的 AFM 提示 – BL-AC40TS（Biolever Mini）探针（Asylum Research，弹簧常数 k = 0.09 N/m，共振频率 f r = 110 kHz）
离心机（适合 Eppendorf 1.5 ml 试管）
带有压力调节器和喷嘴的氮气钢瓶。
Eppendorf 管（1.5 ml）（Eppendorf，目录号：022431081）
透明胶带
多功能一体机-3D –生物原子力显微镜（图s 2 - 4）（庇护研究，牛津仪器）

图URE 2 。AFM我nstrument d etails表示与AC2控制器AFM噪声消除室内部基本AFM部件

图URE 3 。带有标记控件的 AFM 头

软件

IGOR Pro 6 ( https://www.wavemetrics.com/software/igor-pro-802 , WaveMetrics, Portland, OR , USA )
2. MFP3D AFM 成像软件或 Gwydiion 软件 ( http://gwyddion.net/ ) ( Nečas and Klapetek , 2012)

程序小号

用于展开分析的蛋白质
具有 C 端 His6 亲和标签的重组人 Twinkle 解旋酶在大肠杆菌BL21 (DE3) Codon Plus-RIPL (Stratagene) 中过表达。使用连续的镍亲和层析、阴离子交换层析和肝素亲和层析将 Twinkle 解旋酶纯化至 >95% 的纯度（Longley等人，2010 年；Kaur等人，2020 年）。闪烁使用考马斯解旋酶蛋白质浓度评价-用BSA标准染色的SDS-PAGE凝胶（克里格等人，2005 ;他，2011 ）。有关详细的纯化协议，请参阅 Longley等人。（2010 年）。人 mtSSB 蛋白在大肠杆菌中过表达并如前所述进行纯化（Longley等，2009）。

用于展开分析的 DNA 底物
DNA 底物- 有缺口的环状 DNA 底物（4 , 060 bp）-通过使用 Nt.BstNBI 在 pscwo1 质粒（Addgene：质粒 #72300）的一条链中引入两个由四个紧密间隔的切口组成的簇来制备。这些圆形底物与互补寡核苷酸（Integrated DNA Technologies, IDT）（寡核苷酸：质粒- 10:1 比率）在 68 ° C保持 30 分钟，然后缓慢冷却至室温。Amicon 超滤用于去除多余的寡核苷酸和短的双链 DNA。诊断限制性消化来评价的开气隙效率（85 - 95％）。用于 AFM 研究的线性缺口 DNA 底物是通过使用缓冲液 3.1用ScaI 限制酶消化环状缺口 DNA 产生的（Countryman等人，2018 年；Kaur等人，2018 年；Kaur等人，2020 年）。

AFM i在空气中成像以研究 Twinkle 解旋酶解旋的 DNA
在空气中使用 AFM 成像，蛋白质-DNA 样品被孵化并沉积在样品表面。这些样品然后在空气中成像，并且扫描AFM针尖捕捉的在孵育时间的蛋白质-DNA静态结构-功能信息的快照。此外，蛋白质-DNA 样品的时间滴定可以提供有关蛋白质-DNA 相互作用如何随孵育时间变化的信息。
使用透明胶带剥下一层云母，准备新切割的云母表面。
测量使用纳米纯化跳空DNA的浓度d ROP分光光度计。通过使用分光光度计在 260 nm (A 260 )波长处测量吸光度来估计 DNA 浓度。浓度为 50 µg/ml 的双链 DNA 的吸光度为 1，与浓度呈线性关系。使用这种关系，我们可以将未知 DNA 浓度公式化为：

DNA 浓度（以 µg/ml 为单位测量）= 50 µg/ml × A 260

在室温下将 Twinkle 解旋酶（71.2 nM 六聚体）与环状间隙 DNA（3.6 nM）在解旋酶成像缓冲液中孵育 1 分钟。增加一闪解旋酶：圆形缺口的DNA比可以导致一个增加的每株DNA分子一闪的摩尔比，从而导致更多的一闪解旋酶的六聚体放松相同的DNA分子。根据所需的解绕程度和解绕部位的数量，可以调整比例和孵育时间。
在 Helicase Imaging Buffer（最终体积 20 µl）中将孵育的样品稀释 10 倍，然后将样品直接沉积在新切割的云母表面上。还有就是样品的体积没有限制，但对样品的浓度限制为您执行单分子研究。过度拥挤的样本无法提供清晰的信息，因为很难观察到单个分子的轨迹。因此，应相应调整样品在表面的浓度，使单个分子清晰可辨。
洗沉积样品3次用解旋酶成像缓冲器（300 - 500微升），接着3用DI水倍（300 - 500微升）和干燥用N的流中的样品2 AFM成像之前的气体。
打开 MFP3D 软件，然后从模式主选项卡中选择标准选项卡 > AC 空气地形模式（图 3）。
加载AFM探针（Pointprobe PPP-FMR探针）上的悬臂架（图4）和调整激光绘图的位置以获得最大的SUM信号（升亚设我ntensity）和零偏转。将 AFM 尖端安装在悬臂支架上时，不要向后推得太远，因为这会导致 AFM 尖端未对准。

图 4.选择了 AC 空气地形模式的 Mode Master 选项卡（红色方块）

将安装的探头自动调谐到共振频率（具有最大振荡幅度的频率），目标幅度为 1 V 自由空气幅度电压，以便在 AAC 模式下运行。调整在主面板>高级扫描PARMS反馈滤波器1 ，500赫兹（图小号3，5 ，6 ，和7 ）。

图 5.带有已安装 AFM 尖端的贴有标签的悬臂支架部件

图6 。主面板的悬臂调谐和调谐面板选项卡显示选定的 1 V目标幅度（红色方块）

图URE 7 。主面板的主选项卡和高级扫描参数选项卡显示 AAC 空气成像模式下 1.5 kHz（红色方块）的反馈滤波器

通过将目标百分比调整为自由空气振幅的 -5%-10%，使用排斥模式对沉积在云母表面的样品进行成像，在扫描表面时强制尖端保持在排斥状态（相位信号 < 90 ° ）。
以 1-2 Hz 的扫描速率和 512 × 512 像素的分辨率捕获图像。

由 mtSSB 促进的 Twinkle 解旋酶解旋 DNA 的 AFM 成像
在室温下将 Twinkle 解旋酶（71.2 nM六聚体）和增加浓度的 mtSSB 四聚体（17.8 nM、35 nM、54 nM和142 nM）与圆形间隙 DNA（3.6 nM）在解旋酶成像缓冲液中孵育 1 分钟。按照以下添加到孵育样品的顺序：Helicase Imaging Buffer、环状缺口 DNA以及Twinkle 和 mtSSB 同时加入。观察到更高浓度的 mtSSB 有助于展开反应。
稀释在解旋酶成像缓冲器样品10倍（˚F伊纳勒体积20微升），并直接上沉积到所述新鲜剥离云母表面。
与解旋酶成像缓冲液洗涤沉积的样品（300 - 500微升）3 ，随后用去离子水倍（300 - 500微升）3次，并干燥以N的流中的样品2种气体AFM成像之前。
使用MFP-3D-Bio AFM 上的AC 模式和 Pointprobe PPP-FMR 探针（纳米传感器，k = 2.8 N/m，f r = 70 kHz）对沉积在云母表面上的样品进行成像，如上一节所述（图s 1-3）。
以1:1的扫描速率捕获图像- 2赫兹和512个的分辨率× 512像素。

液体中的 AFM 成像以捕获环状间隙 DNA 上 Twinkle 解旋酶的实时动态
为了阐明蛋白质-DNA 相互作用的动力学，完成了蛋白质-DNA 的延时缓冲成像。在这种 AFM 成像模式中，蛋白质和 DNA 不会与表面强烈结合，并且在通过 AFM 尖端在一层相应的缓冲液 (100 - 200 µl)中对样品进行成像时，移动自由受到限制。这有助于以visualiz é在作为尖端在样品表面上在天然状态扫描实时蛋白-DNA相互作用的动态。
通过从透明胶带上剥下一层云母，准备一个新切割的云母表面。
存入 30 µl APS 工作溶液并孵育 15 分钟。
洗用DI的APS溶液用水（300 - 500微升） 3次，并干燥以N的流2分的气体。
检查使用纳米纯化跳空DNA的浓度d ROP分光光度计。
将 0.7 nM 圆形间隙 DNA 孵化到 APS 处理的云母表面 15 分钟。用 Helicase Imaging Buffer (300 - 500 µl)清洗沉积的 DNA 。将 100 - 200 µl Helicase Imaging Buffer 添加到洗涤过的样品中。
选择用于在液体中成像的低弹簧常数 AFM 成像探头（本实验中使用的 AFM 探头- BL-AC40TS，Asylum Research，弹簧常数 k = 0.09 N/m，共振频率 f r = 110 kHz）。
打开 MFP3D 软件并选择标准 > 地形 > AC 水地形模式（图8 ）。

图URE 8 。选择了交流水地形模式的模式主选项卡（红色方块）

添加2 -的AFM头安装到基座上之前，对AFM探针3的液滴解旋酶成像缓冲液中。
对齐用悬臂的最大SUM信号的激光光点（升亚设我ntensity）和零偏转。观察到在液体中获得的 SUM 信号低于空气中相同 AFM 探针的 SUM 信号。
在 Master 面板中，选择 capture Thermal Data 和 Do Thermal。放大宽峰并拟合它。右键单击拟合以将拟合移动到调谐（将频率和相位移动到调谐）。（图 9）。
注意：在液体中的谐振频率为1/3次其在空气中的价值。

图URE 9 。主面板的主选项卡和高级扫描参数选项卡显示 AAC 水成像模式下 0.5 kHz（红色方块）的热选项卡和反馈过滤器

在 Master 面板中选择 Tune 选项卡并打开“Append Thermal ” 。将扫描宽度设置为 30 kHz。单击“一首曲子” 。选择与热重叠最多的峰值并将其设置为驱动频率。
中心相共振，以90 °通过点击ING上的“中心一期”按钮。
将主面板 > 高级扫描参数上的反馈过滤器调整为 500 Hz （图 5）。
增加驱动振幅得到0.5 -自由的空气振荡幅度在0.7伏。
对于生物样品成像，通常使用 80% 的自由振幅作为设定点。设定点大约在 0.4 - 0.55 V之间调整。
图像是在2的扫描速率捕获- 4赫兹和512个的分辨率× 512像素。典型的样品 DNA 覆盖范围包括 8 - 10 个 DNA 分子，扫描尺寸为 1 µm × 1 µm。
在室温下将 Twinkle 解旋酶（71.2 nM六聚体，10 µl）在解旋酶成像缓冲液中孵育5 分钟。
在 Twinkle Helicase Buffer 中将 Twinkle helicase 稀释 10 倍，并在 AFM 尖端扫描时，使用移液器尖端非常缓慢地将稀释的 Twinkle helicase (50-70 µl) 添加到沉积的 DNA 顶部的液体中。

数据分析

从从干燥样品收集的图像中测量解旋 DNA 长度
使用 MFP-3D AFM 成像软件中的横截面分析测量 ssDNA（200 ± 104 pm，高斯峰）和 dsDNA（371 ± 116 pm，高斯峰）的高度，以识别dsDNA 和 ssDNA 产品（Kaur等人， 2020 年）（图 10）。
测量 dsDNA 高度的步骤：
打开分析面板窗口，然后选择与模式画-免费手（[R EFER到图URES 10和11）。
跟踪线垂直于成像 DNA 的轮廓。
将一个指针调整到 DNA 横截面的峰值，将第二个指针调整到云母表面。
dZ 值表示被测量 DNA 的高度。

图URE 10 。(A) DNA AFM 图像 (B) 的高度测量步骤及其横截面分析显示在 (C) 分析面板 (dZ) 中测量的高度（红色方块）

测量展开的 ssDNA 的轮廓长度，用 ssDNA 的高度对其进行表征，并制作直方图以绘制平均展开长度。平均开卷率是平均DNA退绕长度除以所述沉积之前样品的温育时间到云母表面（考尔等人，2020 ）（图11）。
测量任何 DNA 轮廓长度的步骤：
打开分析面板窗口，然后选择与模式画-免费手（[R EFER到图URES 10和11 ）。
跟踪线重叠成像 DNA 的轮廓。
将一个指针调整到 DNA 的起点，将第二个指针调整到横截面中 DNA 的末端。
dXY 值给出了被测量 DNA 的轮廓长度。
注意：在测量解开 DNA 的长度之前，测量 DNA 的高度以确保它是 ssDNA。第h ssDNA的8比双链DNA的高度低，如上所述。

图URE 11 。轮廓升A（的ength测量步骤甲）追踪DNA AFM图像（乙）具有其横截面分析示出了在（测量的高度Ç ）分析面板（DXY）（红色正方形）

食谱

Helicase Imaging Buffer ( Kaur et al. , 2020 )
20 mM HEPES (pH 7.5)
100 毫米氯化钠
7.5 毫米氯化镁2
7% 甘油
0.2% NP-40
4.5 毫米三磷酸腺苷
APS 工作解决方案（Shlyakhtenko等人，2013 年）
通过在 5 ml 去离子水中溶解 58 mg 制备 50 mM APS 溶液。
将原液稀释到 1:300 的比例，制成工作溶液。
用封口膜将原液密封在 Eppendorf 管中，并在室温下储存。
缓冲区 3.1：1 ×缓冲区组件：NEB
100 毫米氯化钠
50 mM Tris-HCl (pH 7.9)
10 毫米氯化镁2
100 微克/毫升 BSA

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院( R01GM107559 到 HW ) 、北卡罗来纳州立大学人类健康与环境试点项目中心 (PK) 的赠款 P30ES025128 和 NIEHS 校内研究计划的赠款 ES065078 的支持，美国国立卫生研究院（WCC）。该协议改编自Kaur P., Longley, MJ, Pan, H., Wang, W., Countryman, P., Wang, H. 和 Copeland, W. C. (2020) 。人类线粒体 Twinkle 解旋酶解旋 DNA 的单分子水平结构动力学。J Biol Chem 295(17): 5564-5576。

利益争夺

作者声明没有相互竞争的经济利益。

参考

Bhatti, JS, Bhatti, GK 和 Reddy, PH (2017)。代谢紊乱中的线粒体功能障碍和氧化应激——迈向基于线粒体的治疗策略的一步。Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis 1863(5): 1066-1077。
Bogenhagen, DF、Rousseau, D. 和 Burke, S.（2008 年）。人类线粒体 DNA 核仁的分层结构。J Biol Chem 283(6): 3665-3675。
Countryman, P., Fan, Y., Gorthi, A., Pan, H., Strickland, J., Kaur, P., Wang, X., Lin, J., Lei, X., White, C.,等。(2018) 。Cohesin SA2 是一种独立于序列的 DNA 结合蛋白，可识别 DNA 复制和修复中间体。J Biol Chem 293(3):1054-1069。
Goffart, S.、Cooper, HM、Tyynismaa, H.、Wanrooij, S.、Suomalainen, A. 和 Spelbrink, JN (2009)。与常染色体显性进行性外眼肌麻痹相关的闪烁突变导致解旋酶功能受损和体内 mtDNA 复制停滞。Hum Mol Genet 18(2): 328-340。
他，F.（2011）。布拉德福德蛋白质测定。生物 101 ：e45。
Kaur, P.、Longley, MJ、Pan, H.、Wang, H. 和 Copeland, WC (2018)单分子 DREEM 成像显示 DNA 包裹在人类线粒体单链 DNA 结合蛋白周围。核酸研究46(21):11287-11302。
Kaur, P.、Longley, MJ、Pan, H.、Wang, W.、Countryman, P.、Wang, H. 和 Copeland, WC（2020 年）。人类线粒体 Twinkle 解旋酶解旋 DNA 的单分子水平结构动力学。J Biol Chem 295(17): 5564-5576。
Korhonen, JA、Pham, XH、Pellegrini, M. 和 Falkenberg, M. (2004)。在体外重建最小的 mtDNA 复制体。EMBO J 23（12）：2423-2429。
Krieg, RC, Dong, Y., Schwamborn, K. 和 Knuechel, R. (2005)。使用 BCA 方法对 2D SDS PAGE 进行蛋白质定量及其对不同干扰试剂的耐受性。J Biochem Biophys Methods 65(1): 13-19。
Longley, MJ, Humble, MM, Sharief, FS 和 Copeland, WC (2010)。由 C10orf2 编码的人类线粒体 DNA 解旋酶的疾病变异体不同地改变蛋白质稳定性、核苷酸水解和解旋酶活性。J Biol Chem 285(39)：29690-29702。
Longley , MJ, Smith, LA 和 Copeland, WC (2009)人类线粒体单链 DNA 结合蛋白的制备。方法 Mol Biol 554:73-85。
内卡斯，D 。和 Klapetek , P. (2012) 。Gwyddion：用于 SPM 数据分析的开源软件。Cent Eur J Phys 10 (1): 181-188。
Sen, D.、Nandakumar, D.、Tang、GQ 和 Patel, SS（2012 年）。人类线粒体 DNA 解旋酶 TWINKLE 是一种解旋和退火解旋酶。J Biol Chem 287(18): 14545-14556。
Suomalainen, A. 和 Battersby, BJ (2018)。线粒体疾病：细胞器应激反应对病理学的贡献。Nat Rev Mol Cell Biol 19(2): 77-92。
Tyynismaa, H., Mjosund, KP, Wanrooij, S., Lappalainen, I., Ylikallio, E., Jalanko, A., Spelbrink, JN, Paetau, A. 和 Suomalainen, A. (2005)。突变线粒体解旋酶 Twinkle 在小鼠中导致多个 mtDNA 缺失和迟发性线粒体疾病。Proc Natl Acad Sci USA 102(49): 17687-17692。
Ylikallio, E. 和 Suomalainen, A. (2012)。线粒体疾病的机制。安医学44（1）：41-59。
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