材料和试剂

纸巾纸（斯台普斯MMP ® ，目录号：DUSPA350RKL ）
孔板-6（Nunc公司® ，目录号：140675）
管微量1.5毫升（爱思进康宁® ，目录号的：MCT-0.99-C）
HeLa细胞（ATCC ® CCL-2）
肝细胞生长因子，HGF（Genentech，Inc.）
LISA-G ® RhoA活化测定（细胞骨架公司，目录号：BK124 ）（图1）
DMEM - Dulbecco改良的Eagle培养基（Gibco ® ，目录号：11966025）
尾胶原我鼠（罗氏® ，目录号：11179179001）
胎儿牛血清（FBS）（GIBCO ® ，目录号：26140079）
RhoB特异性抗体（Santa Cruz Biotechnology，sc-8048）
蛋白质测定布拉德福德（Bio-Rad公司® ，目录号：5000006）
X-100的Triton（Sigma-Aldrich公司® ，目录号：93443）
三（野牛之公司。，目录号：600-125-IK）
的HCl（Sigma-Aldrich公司® ，目录号：320331）
的NaCl（野牛之公司。，目录号：600-082-IK）
的MgCl 2 （Sigma-Aldrich公司® ，目录号：M1028）
脱氧胆酸（Sigma-Aldrich公司® ，目录号：D6750）
SDS（十二烷基硫酸钠）（野牛之公司。，目录号：800-100-LG）
甘油（Sigma-Aldrich公司® ，目录号：G7893）
二硫苏糖醇（DTT）（Bio-Rad公司® ，目录号：1610611）
抑制剂鸡尾酒蛋白酶（罗氏完成® ，目录号：11697498001）
缓冲盐水磷酸盐（PBS）（野牛之公司。，目录号：311-012-LL）
裂解缓冲液（请参见食谱）

图1. 用于比色RhoB GTPase活性测定的试剂。洗涤缓冲液，结合缓冲液，抗原呈递缓冲液，RhoB一抗，HRP标记的二抗，Rho-GTP亲和孔（条和试纸条固定器），Rho对照和BK 124组分从G-LISA ® RhoA活化测定（ç Ytoskeleton 公司）。

配套设备

保持条（骨架® ，目录号：BK124 ）
刮板细胞（萨尔斯塔特® ，目录号：83.1832 ）
培养箱细胞免缝-CYCLE CO 2 （热Fisher Scientific公司® ，目录号：51030303 ）
Varioskan 闪光光谱扫描多模阅读器在490纳米（赛默飞世尔科技® ，目录号：5250030 ）
离心机仪（Eppendorf ® ，目录号：5424 / 5424R）
振动筛轨道（优莱博® ，型号：优莱博3508双摇床行动）
GENESYS TM 10S可见分光光度计在595nm处（赛默飞世尔科技® ，目录号：840-208200）
道移液器的多（的Eppendorf ® ，目录号：3122000060）

软体类

微软的Excel ®

程序

胶原蛋白I涂层和细胞接种
涂层的6孔板用1ml鼠尾I型胶原在PBS中稀释（25 Myug / ml）中。
在37 °C下孵育1毫升I胶原蛋白包被的6孔板1小时。
用1 ml PBS 洗涤6孔板两次，并吸去PBS缓冲液。
1个穿戴X 10个6 的HeLa细胞/孔在3毫升含10 Pasento FBS和孵化的6孔板中于37 ℃下对于至少24 H.
用1 ml PBS 洗涤两次，吸出并加入3 ml培养基（0％血清），然后在37 °C 下孵育过夜。
加入0.5 nM HGF （或任何其他生长因子）以在不同时间刺激细胞并测量RhoB激活的动力学。
注意事项：Ⅰ型胶原蛋白和HGF必须保持在冰上转染的细胞组成型活性形式RhoB的（RhoB的V14 ）可以作为阳性对照和未刺激的条件为所有的分析实验，需要作为一个阴性对照。

细胞清洗
文化板块从检索的孵化器，立即置于冰上，吸出媒体和洗两次澡细胞每用1 毫升冰冷的PBS。
吸出所有PBS缓冲液。

细胞裂解
细胞裂解15分钟，冰冷的细胞裂解液，50 MYU大号每孔。
用细胞刮刀收获细胞裂解物。
将裂解液转移到在冰上预冷的1.5 ml微量离心管中。
在10,000 xg ，4 °C下离心细胞裂解液10分钟。
将滤液（细胞裂解物级分）转移到冰上的新的预先标记和预冷的1.5 ml微量离心管中。
注意：所有这些步骤必须在冰上或在4°C的冷藏室内进行。

定量总蛋白浓度
布拉德福德蛋白测定进行稀释2 Myueru细胞裂解物，未稀释的裂解我们获得埃德通过该协议通常约为5 Myug / Myueru 。蛋白质溶液通常是分析一式两份。
测量595 nm处的吸光度。

G-LISA小试验的P- 赔偿
按照《 G-LISA活化测定技术指南》表2所示，重新配制Small G-LISA测定试剂盒中提供的所有冻干成分。
涡旋15 s混合结合缓冲溶液。保持冰。

小型G-LISA分析方案（图2 ）

C：\ Users \ Bio-Dandan \ Dropbox \ Refomatting \ 2020-5-05 \ 3609--1903013--1387StéphanieDuhamel 837802 \ Figures JPG \图3 new.jpg

图2 。比色法RhoB的GTP酶活性测定法概述。阿。实验步骤。步骤1：种子细胞在I型胶原包被的6孔板刺激细胞用HGF（或任何其它生长因子）在不同时间点。步骤2 :.。裂解细胞用裂解缓冲液，收获细胞裂解液用细胞刮刀和转移细胞裂解液进入预冷的离心管，进行量化的总蛋白浓度。第3步：准备试剂，并培育细胞裂解液在一个的Rho-GTP亲和力板第4步：为比色免疫检测，加入RhoB一抗，冲洗，然后加入HRP二抗，然后冲洗。步骤5：要测量GTPase活性，请加入HRP检测试剂，并使用微孔板分光光度计测量490 nm的吸光度来读取信号。分析数据。ü 硒裂解液井作为参考空白。三次重复，每个样本都要进行。读出的信号通过测量吸光度490 Nm的使用微孔板分光光度计。当数据“雷瑟 s减去“缓冲区”，将其导入到简单的图形软件（如Excel）中。

空白的缓冲准备通过混合60 Myueru 裂解液用60 Myueru 冰冷的结合缓冲雪藏。
①乘坐人数须罗镇板带材和地方在一个条夹，并且然后放在冰上。
将板保持在冰上，并在每个孔中加入100μl 冰冷的水以溶解粉末涂层，覆盖孔的底部。在重悬之前，将沉淀物轻拍到孔的底部。
细胞裂解液分装复制（60 Myueru ）或三次（90 Myueru ）测定到新鲜冰冷的离心管。
在每个试管中加入等体积的冰冷的结合缓冲液，在高设置下涡旋每个试管3-5秒，然后将试管放回冰中。
轻轻甩动，从微孔板孔中彻底清除水，然后在纸巾上进行一系列5次拍打。
将板放回冰中，立即向孔中加入50μl 均衡的细胞裂解液。
移取50μl 缓冲液空白对照至重复孔中。
50移液器Myueru 中RhoA的阳性对照进入复孔。
立即将板放置在4°C的轨道微孔板振荡器上（250 rpm）30分钟。
抗RhoB的稀主Antibo 的Dy 向{分数（1/10）} 0在抗体稀释缓冲液中。
30分钟后，滤去溶液从孔中，并洗两次每次用200 Myueru 洗涤液在室温下使用多道移液器。不要离开该板块无人值守在这个时候。除去洗涤缓冲液完全后，每次洗作为描述步骤F6。
移液器立即200 Myueru室温抗原呈递缓冲到每口井使用多通道移液器，室温下放置了整整2分钟。
出了大力的轻拂抗原呈递缓冲液和洗涤孔三次每随着200的Myueru室温洗涤缓冲液如所描述的，在步骤F6 （图3 ）。

图3 。轻拂程序。所描述的步骤F6，该板块应大力争取弹到纸巾上彻底删除解决方案中的井。轻弹应该重复5次。

向每个孔中添加50 µl稀释的抗RhoB一抗，并在室温下将板置于轨道微孔板振荡器（250 rpm）上45分钟。
二级HRP稀释标记Antibo 镝1/6 2.5在抗稀释液。
如步骤F6所述，剧烈甩出抗RhoB一抗。
按照步骤F6所述，用200 µl室温洗涤缓冲液洗涤孔，每次3次。
向每个孔中加入50 µl稀释的二抗，然后在室温下将板置于微孔板振荡器（250 rpm）上45分钟。
准备一份等份的HRP检测试剂A和B。请勿混合。
滤出二抗并按照步骤F6所述，用200 µl室温洗涤缓冲液分别洗涤孔3次。
移取50 µl混合HRP检测试剂到每个孔中，并在37°C下孵育10分钟。
向每个孔中加入50 µl HRP终止缓冲液，并检查孔中是否有气泡。
用酶标仪在490 nm处测量吸光度来读取信号，建议至少读取三个读数以捕获最大吸光度信号。

资料分析

测量结果，以转移的Microsoft Excel ® 软件。
平均吸光度减去获得了与空白样品的吸光度，获得每个测量样品，以获得正确的值。细胞刺激的HGF（或任何行吟- [R生长因子）可以被使用d作为阳性对照。

菜谱

缓冲裂解（可制成提前商店d 在4°C）
海卫一X-100，1％

Tris-HCl，pH 7.5，50 mM

氯化钠，150毫米

的MgCl 2 ，10mM的

脱氧胆酸盐0.5％

SDS，0.1％

甘油10％

必须将2 mM二硫苏糖醇（可预先制备并在-20°C 储存），必须新鲜加入裂解缓冲液中

抑制剂鸡尾酒蛋白酶（原液25X 2毫升水），可商店d 在-20 ℃，对于长达4个月所推荐的制造商

注意：裂解缓冲液应在使用前使其新鲜。

致谢

这项工作是Zaoui 等人（2019）宣传工作的一部分，并得到了Susan G.Komen的支持，以治疗K.Zaoui的博士后奖学金（KG11 1467）。

竞争利益

作者宣称没有任何竞争的经济利益。

参考文献

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