材料和试剂

无菌注射器3 ml，鲁尔锁（MedHarmony ，目录号181110）
细胞过滤网尼龙，PP框架，孔径70 μ米，无菌（SPL生命科学，目录号：93070）
Monoject TM 18 G钝插管（Covidien，目录号：8881202348）
高精度显微镜盖玻片18 x 18 mm，1.5H（Marienfeld ，目录号：0107032）
25 x 75 mm x 1 mm厚的喷砂单磨砂预清洁显微镜载玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：421-004T）
UBC PA-GFP小鼠（杰克逊实验室，目录号：022486）
该小鼠品系在组成型表达的人泛素C（UBC）启动子的调控下携带GFP蛋白可光活化变体的转基因。因此，它能够快速，稳定地对活细胞进行荧光标记。

不含钙和镁的磷酸盐缓冲盐水（PBS -/- ）（Biological Industries，目录号：02-023-1A）
乙二胺四乙酸溶液（EDTA）（Sigma - Aldrich，目录号：03690）
胎牛血清，去除木炭（Thermo Fisher Scientific，目录号：12676029）
硅脂（可以在五金店找到）
双蒸馏水（DDW）
TruStain FcX TM （抗小鼠CD16 / 32）抗体（Biolegend ，克隆：93，目录号：101319）
艳紫色605抗小鼠B220（CD45R）抗体（Biolegend ，克隆：RA3-6B2，目录号：103243）
APC-Alexa Fluor 750抗小鼠CD4抗体（Thermo Fisher Scientific，克隆：S3.5，目录号：MHCD0427）
PE抗小鼠CD44抗体（Biolegend ，克隆：IM7，目录号：103023）
Alexa Fluor 700抗小鼠CD62L抗体（Thermo Fisher Scientific，克隆：MEL-14，目录号：56-0621-82）
PE / Cy7抗小鼠CD279（PD-1）抗体（Biolegend ，克隆：RMP1-30，目录号：109109）
生物素抗小鼠CD185（CXCR5）抗体（Biolegend ，克隆：L138D7，目录号：145509）
Alexa Fluor 647链霉亲和素（Biolegend ，目录号：405237）
FACS缓冲区（s 配方）

设备

可调光子激光扫描显微镜（TPLSM），配备20倍水透镜（Zeiss LSM 880垂直显微镜，配备相干变色龙视觉激光）
CytoFlex 流式细胞仪（贝克曼库尔特公司）

程序

注意：光活化是一个耗时的过程，因此建议评估所有必需位的光活化所需的时间，并分析样品大小，样品在接下来的染色步骤中等待时间不会超过3小时。组织处理中的较长延迟可能会增加死细胞的频率，因此不会有助于分析细胞的聚集。在SED光激活的情况下，每只小鼠中约30个SED区域被光激活，每天最多分析两只小鼠。此外，可以在完整的PA-GFP小鼠，转移的细胞或用PA-GFP骨髓制备的嵌合体中进行光激活。杂合PA-GFP小鼠也可用于该方案，但纯合PA-GFP小鼠产生更强的GFP信号。在与此协议相关的研究中，我们生成了由90％纯合PA-GFP骨髓和10％AID-GFP骨髓组成的嵌合小鼠。AID由SED和GC B细胞表达，因此AID-GFP被用作这些区室的标志。

通过颈脱位或CO 2 吸入使小鼠安乐死（该技术不会影响以下步骤）。
打开腹腔，将盲肠的小肠移至胃中，放入含有培养皿的PBS（约15 ml PBS）中。
使用装有18 G Monoject TM 钝头套管的30 ml注射器，用40 ml PBS冲洗肠道。避免将肠内容物冲洗掉而与组织接触。
切下一个带有Peyer贴片的小肠，然后纵向切割它，而不会损坏PP。
将薄纸放在盖玻片上，并在薄纸周围添加硅脂。确保硅胶层不厚于薄纸。
加入PBS（〜30 μ 升）以水合组织和盖有附加盖玻片玻璃（图1）。

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图1. Peyer的贴片玻片制备。A. 切下含有派伊尔氏淋巴集结的肠组织（黑色虚线），并进行另外的纵向切割（黄色虚线）以暴露SED隔室。B. 钍Ë PP放置在盖玻片和水合，用PBS结合硅脂。

将组织放在一张幻灯片上，使所需的光激活面朝上。
在组织上滴一滴DDW，然后将晶状体放在目标区域。
在940 nm波长处聚焦并成像组织（这还将确保发生非特异性的光激活）。
在所需光激活区域内的组织内，定义一个5 µm间隔的Z-stack。
在940 nm进行光激活之前，对高质量的Z堆栈图像进行成像（图2）。
通过在ZEN设置中添加区域来定义光激活区域，并确保标记该区域以进行采集。
将激光参数更改为830 nm和图像。这应包括在830 nm处使用Z堆栈对特定的特定区域成像。
将激光返回940 nm，然后移动标记的区域。
在940 nm处重复图像采集（图2）。这应该包括带有Z堆栈的整个字段。根据定义的区域边界，光激活区域将显示为绿色。

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图2.嵌合PA-GFP小鼠PP中SED区域的光活化。图像显示了在光激活之前，在830 nm的光激活期间以及在光激活之后的SED，以指示标记的群体。

对所有需要的位置重复上述步骤。
操作盖上盖玻片，并用70 µm细胞过滤器和3 ml FACS缓冲液将组织轻轻转移到培养皿中。
使用3毫升注射器的活塞捣碎PP，以产生PP衍生细胞的单细胞悬液。
将细胞悬液转移到带有细胞滤网盖的FACS管中。
用另外的1 ml FACS缓冲液洗涤培养皿，并将溶液收集到同一FACS管中以最大程度地收集细胞。样品包含所有PP细胞，范围为3-10 M细胞。
在4°C下以300 RCF旋转细胞7分钟。
丢弃上清液，并用残留的缓冲液（约100 µl）重悬细胞。
加入1 µl Fc阻断剂抗体（TruStain FcX TM ），涡旋并置于冰上。
在冰上孵育5分钟。
加入在FACS缓冲液中制备的100 µl染色混合物。在与此协议相关的论文中，使用Tfh 细胞标记物对SED衍生的T细胞（B220 - CD4 + CD44 + CD62L - PD-1 + CXCR5 + ）进行染色。在使用生物素结合抗体的情况下，首先用生物素结合抗体与其他结合抗体一起对细胞进行染色，然后在第二步中用链霉亲和素抗体对细胞进行染色。由于在下面的阻挡管中的剩余体积为约100 μ 升，抗体混合物被制备成2倍浓度，以实现最终稀释度为指示Ť 能够1 。

表1. 用于光活化PP中T细胞染色的抗体列表

记号笔

最终稀释

原料浓度[mg / ml]

μ 克/ 100 μ 升混合物（2×）

BV605 B220

1：400

0.2

0.1

APC-AF750 CD4

1：400

0.2

0.1

PE CD44

1：400

0.2

0.1

AF700 CD62L

1：400

0.5

0.25

PE \ Cy7 PD-1

1：600

0.2

0.067

生物素CXCR5

1：100

0.5

1个

涡旋并在黑暗中于冰上孵育30分钟，以使表面标记物染色。
用2 ml FACS缓冲液洗涤细胞，并在300 RCF和4°C下旋转细胞7分钟。
加入在FACS缓冲液中制备的含有1：400 AF647链霉亲和素抗体（储备浓度：0.5 mg / ml）的100 µl染色混合物。
涡旋并在黑暗中于冰上孵育30分钟，以使表面标记物染色。
用2 ml FACS缓冲液洗涤细胞，并在300 RCF和4°C下旋转细胞7分钟。
用500 µl FACS缓冲液重悬细胞，并使用CytoFlex 流式细胞仪（Beckman Coulter）分析细胞。

笔记

由于光活化细胞的频率非常低（约占单个活细胞总数的1-5％），因此请记录尽可能多的事件，以获取可靠数目的细胞用于进一步分析。
在每个实验中，提取和染色来自未光活化作为阴性对照的小鼠的PPs 。这种控制对于正确激活光活化细胞群至关重要。
在单个活细胞上进行门操作，并在V500 + GFP + 细胞群体上进行此门操作。V500 + 代表整个可光激活的细胞群，而GFP + 的细胞则是由双光子显微镜标记的细胞。可以分析该人群的特定目标标记。在与该方案相关的论文中，我们按照先前的描述对Tfh 细胞进行了染色（Liu，2012）。

菜谱

FACS缓冲区
不含钙和镁的PBS（-/-）

2％胎牛血清（FBS）

1毫米EDTA

向500 ml PBS中加入10 ml PBS和1 ml 0.5 M EDTA

注意：FACS缓冲液在4 °C下最多可保存一个月。

数据分析

如前所述，在与这项研究相关的工作中（Biram et al。，2019），使用嵌合小鼠标记SED和GC间隔。原始论文提供了T细胞群体的全流式细胞术分析。如图3中的代表性图所示，将光活化细胞选出单个淋巴细胞，并根据目标标记进行分析。如果是非嵌合小鼠（例如UBC-PA GFP小鼠）的光激活，则该图中将出现两个种群：所有细胞均为V500 + ，只有光激活的细胞显示为V500 + GFP + 。当光活化转移细胞的一个样品，V500 - 人口将代表内源性的细胞群。光活化细胞的频率相对较低（〜1-2％），为了进行适当的统计分析，建议记录总共约2 M个细胞。

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图3 。小鼠PP中光活化细胞的门控策略。代表性的流式细胞术图显示了Biram 等人在PA-GFP AID-GFP骨髓嵌合体中PA-GFP细胞群体的门控策略。（2019）。A. 现场淋巴细胞门如图所示。B. d oublets使用的FSA-A / FSC-宽度分布去除。C. V500用于标记所有PA-GFP衍生的细胞。非光活化细胞（V500 + GFP - ），AID-GFP - 细胞，AID-GFP + 细胞，和光活化的细胞被表示为显示在曲线图。

致谢

ZS是由欧洲研究委员会（批准号：677713），科学计划的人类前沿的支持（批准号：CDA-00023/2016），以色列科学基金会（批准号：一零九零年至1018年），阿兹列里基金会，涨潮基金会莫里斯·卡恩人体免疫研究所。ZS是欧洲分子生物学组织年轻研究者计划的成员，并获得了来自Benoziyo 科学促进基金会，查尔斯· 克洛爵士爵士研究奖，科米萨罗夫家庭信托基金，艾玛与雅克· 伯勒姆斯多夫基金会，杰拉尔德·奥的资助。曼恩慈善基金会和大卫· 波伦慈善信托基金。

如先前所述（Biram et al。，2019），该协议提供了有关Peyer斑的光激活和流式细胞仪分析的详细信息。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

所有实验程序均已获得魏茨曼研究所动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，并遵循所有相关的道德法规（IACUC编号00960118-4）。

参考文献

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