材料和试剂

标准材料和试剂
1. 1.5或2.0 ml无菌微量离心管

2. 微量移液器吸头：10、200、1,000 µl

3. Miracloth （Calbiochem ，例如，VWR，目录号：475585-1）

4. 植物或真菌样品

5. 纯化（RO，DI，M IlliQ ，Nanopure ）和消毒水

6. 100 Bp DNA阶梯（Jena Bioscience，目录号：M-214S）

7. 1 Kb DNA梯子（新英格兰生物实验室，目录号：N0552）

8. 氯化钠

9. 氯化钾

10. EDTA

11. 安全数据表

12. Tris（pH 7.5）

13. 聚乙烯吡咯烷酮（PVP，CAS 900-39-8，FW 40,000，ē 。G. ，沉箱实验室，目录号：P071-100GM）

14. 异丙醇

15. 乙醇（EtOH）

16. 提取缓冲液（请参见配方）

17. 洗涤缓冲液（请参阅配方）

用于不同组织均质化选择的特殊材料和试剂
叶片软组织和菌丝体的选择1：无特殊材料或试剂
各种植物组织和菌丝体的选择2，大于100 mg：液氮
3对于各种选项植物组织和菌丝体，小于100的Mg：珠打浆机管（ê 。G. ，裂解矩阵I，MP Biomedicals公司，目录号：116918050-CF ）
注意：为减少塑料浪费并节省成本，可对珠子搅拌器管进行清洗和重新使用（请参阅“注释” ）。

设备

标准装备
手术刀
镊子
铲子
秤（例如，Metler -Toledo，型号：ML54T）
微量移液器：1，10，100，1,000 µl
加热块（例如，VWR，目录号：12621-096）
涡流（例如，VWR，目录号：10153-838）
微量离心机（例如，Eppendorf，型号：5424）
加热水的下列方法之一：微波，水浴（例如，VWR，型号：WB05）或加热板（例如，VWR，目录号：NO97042-642）
冷冻室，-20 °C或-80 °C

用于不同组织均质化选择的专用设备
叶片软组织和菌丝体的选择1：无特殊设备
对于各种植物组织和菌丝体，大于100毫克的选项2：
杜瓦瓶液氮

陶瓷研钵和杵

对于各种植物组织和菌丝体，小于100毫克的选项3 ：
打珠机（例如， Biospec ，型号：迷你型珠磨器16，目录号：607 / 607EUR）

采样木质部从成熟的树木：钻探（ē 。G. ，固安捷，目录号：2AJA6）和马利特（ē 。G. ，固安捷，目录号：4YR61），切菜板

程序

样品制备：称量10-50 mg样品（见图1）。
植物组织：用镊子和手术刀将样品切成约5×5×1 mm的块，较小和较薄的块将使样品质量更好。
菌丝体：使用手术刀/ 刮刀从P Etri板表面刮除菌丝体，或使用刮刀从液体培养物中收集菌丝体。
成熟树木的木质部组织：将木材样品放在砧板上，用凿子和木槌收获木质部组织碎片，用手术刀和刮刀切成5×5×1 mm的碎片。
注意：对于菌丝体，请尽量减少琼脂的用量以提高DNA质量。

1.实施例图样本规模的DNA 提取。甲。新鲜韧皮部从8周龄胡杨毛果树。重量20的Mg。乙。新鲜韧皮部从成熟P. 毛果树。重量15的Mg。Ç 。新鲜Leptographium Wagnerii 菌丝体从液态麦芽提取物中收获，重量20毫克，垂直线之间的间隔= 1毫米。

均质样品并添加提取缓冲液
根据样品类型，可以使用三个选项，无需完全均质化。

选项1：菌丝体和软叶组织
将样品放入1.5或2.0 ml微量离心管中。
加入1毫升提取缓冲液。
剧烈涡旋20 s。
继续执行程序C。
选项2：各种植物组织和菌丝体≥50 mg：
用研钵和液氮在研钵中研磨样品。
用刮刀或倾析到1.5 / 2.0 ml微量离心管中，转移10-50 mg均质样品。
加入1毫升提取缓冲液。
剧烈涡旋20 s。
继续执行程序C。
选项3：≤50 mg的各种植物组织和菌丝体：
将样品转移到2.0 ml打浆器管中。
加入1毫升提取缓冲液。
搅珠机处理20 s。
继续执行程序C。
注意：每50 mg或更少的组织中应使用1 ml提取缓冲液。为了充分涡旋，每管仅使用1 ml缓冲液。

DNA提取
在水浴或烧杯中用温水（约65 °C ）加热洗涤缓冲液以溶解任何沉淀剂，温度并不严格，只要没有残留的沉淀剂即可。
消除裂解和碎片：将样品在提取缓冲液中于65 °C 孵育15 分钟。在孵育期间涡旋一次，以6,000 xg离心10分钟。
消除碎片：离心后，将约0.5 体积的酵母转移到新试管中，加入1体积的预热洗涤缓冲液，并将样品涡旋20秒钟，以21,000 xg离心10分钟。
注意：移去污渍时，彻底清除碎片不是关键。

沉淀：传输约在21000 0.7体积漫到一个新的管中，加入0.85体积的异丙醇（室温），并且通过反转20秒混合离心。XG 为10分钟。
注意：在移取收集的液体时，应尽量减少转移任何碎屑。

洗涤沉淀物：倒出上清液，倒置试管，将其倒在纸巾上以除去残留的污染物。加入200 µl 70％乙醇，并以21,000 xg离心5分钟。
注意：请考虑当地法规，以正确处理异丙醇废物。

干燥沉淀物：移出乙醇，将瓶盖打开，将沉淀物在65 °C 的加热块中干燥5分钟。
注意：为了更快地干燥，请尽可能多地除去乙醇。

重悬液：将沉淀物溶于20-50 µl TE缓冲液或无核酸酶的水中。涡旋溶解（如果需要），短暂离心以收集液滴到试管底部。将DNA样品储存在-20 °C 或-80 ° C C 直到使用。
Ñ OTE：如果DNA沉淀不是无色或白色柱70％乙醇洗净，加入20-50 μ TE的升缓冲液或无核酸酶的水重悬DNA而不干扰pellet.Gently在吸管的液体数次试管收集上清液作为DNA用于下游过程，保持沉淀直至DNA定量。将DNA用于基于PCR的检测，或储存在冰箱中直至使用。

资料分析

协议性能分析：

用于DNA提取的植物和真菌材料
为了测试协议的适用性，我们提取的DNA从人工接种树木，自然感染树和.The人工接种样品包括8周龄菌丝（表1）杨毛果与植物喷雾接种Sphaerulina musiva （LeBoldus 等人。，2010;亚伯拉罕。等，2018），和3年之久的云杉冷杉植物插件接种Heterobasidion SP。（Terhonen 等，2019），包括茎溃疡成熟的自然感染植物样品。P. 毛引起树木由S. musiva 感染，和成熟的黄杉花旗松感染根Leptographium wageneri .Necrotic 或变色韧皮部或木质部样品用10-380 mg组织（平均86毫克）用于DNA extraction.For每个样品，将1ml的无论样品重量如何，均使用提取缓冲液。从纯培养物收获的菌丝体中提取真菌DNA（表1）。对于固体培养基，可以使用麦芽提取物琼脂（2％麦芽提取物，2％琼脂）或KV8琼脂（18％V8汁），0.2％使用CaCO 3 （2％琼脂），在室温下在固体培养基上培养，对于液体培养基，分别使用麦芽提取物培养基（2％麦芽提取物）或KV8培养基（18％V8汁液，0.2％CaCO 3 ）。在室温下，在旋转摇床（100-150 rpm）上培养液体培养基中的培养物，并通过Miracloth （Calbiochem ）过滤从液体培养基中收获菌丝体，并用去离子水冲洗。

DNA样品质量评估
使用Nanodrop，Nanophotometer或Qubit 测量DNA浓度.PCR，定量实时PCR（qPCR），琼脂糖凝胶电泳（图2）和真菌ITS测序用于评估样品质量。每次运行均包含模板阴性对照和阳性模板对照，以评估检测的可靠性。

为P. 毛果其是在样品oculated或自然感染S. musiva ，我们使用了宿主-病原体特异性测定（亚伯拉罕等人，2018）。对于检测Heterobasidion 从接种的木材小号物种amples，物种特异性引物为H. annosum 和H. parviporum （Hantula 和Vainio ，2003）被用于（Terhonen 等人，2019）。对于检测L. wageneri 从P. 黄杉根和真菌培养物中，我们使用Leptographium 特异性引物（Schweigkofler 等等人，2005）。孟席斯疟原虫的引物（Winton 等人，2002）被用于区分阴性样品中的PCR抑制作用，以及扩增从花旗松针中提取的DNA。

用针对核大亚基，延伸因子和钙调蛋白区域的引物扩增来自双翅目培养物的DNA样品（Vilgalys和Hester，1990；Carbone和Konn ，1999；Grünig 等，2007； Nelsen 等，2011）。用真菌核糖体内部转录间隔区的引物ITS1-F和ITS4扩增出D. sapinea 和真菌内生菌的DNA （White et al。，1990; Gardes and Bruns ，1993）.PCR条件列于表2和表3中的引物序列。所有PCR扩增子均在带有StainIN TM RED或GelRed TM 核酸染料的1.5％琼脂糖凝胶上的紫外光下可视化。对于用于测序的真菌物种，PCR产物使用相应的引物进行纯化和测序（表1）在Microsynth SEQ LAB（德国哥廷根）。

使用多重Taqman qPCR方案（Abraham 等，2018）评估了DNA样品中潜在的PCR抑制剂对靶标检测的影响。使用商业试剂盒（DNeasy Plant Mini，Qiagen）从可比的组织样品中提取的DNA 作为用于低抑制剂样品七点稀释系列的引用是对用于制备P. 毛（10倍稀释系列，60 - 6 × 10 -4 纳克/微升）和S. Musiva DNA样品（5倍稀释系列， 50-3.2 × 10 -3 ng /μl （Abraham et al。，2018）用开发的方法和商业试剂盒进行提取。比较两种提取方法的样品的定量循环（Cq ）值，以评估潜在的PCR抑制剂对靶标检测的影响。

图2.与开发中提取的DNA的样品的例子。编protocol.A 三孢梢。从菌丝体生长在麦芽提取物琼脂（MEA）中提取的DNA的样品泳道1,3和5：50-500 ng的DNA的泳道2。，4，和6：样品的10倍稀释液在泳道1,3和5凝胶：在1×TAE，100琼脂糖2.0％。V，35分钟爬梯：100bp的DNA梯状条带.B 。DNA提取自Leptographium wagnerii 从液体麦芽提取物（泳道1），菌丝Sphaerulina musiva 菌丝上生长KV8 琼脂（泳道2），S. musiva 在液体生长KV8 介质（3），新鲜杨树韧皮部（泳道4），新鲜叶杨（泳道5），成熟的道格拉斯冷杉木质部（第6道）和新鲜的道格拉斯冷杉针（第7道）。泳道1-4和6-7：20-100 ng DNA。泳道5：500 ng DNA。凝胶：1％琼脂糖1×TAE，120 V，70分钟梯子：1 kb DNA阶梯。

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说明：logonew

表1.用方案提取的样品类型，PCR成功率（％）和测序样品的数量

样品类型

DNA样品中的真菌

DNA样品中的宿主

样品描述

样本年龄

测试样品

PCR成功率（％）

排序样本

从植物材料中提取的DNA

异源异化

青海云杉

接种韧皮部

3年

20

70

未排序

细小异花孢

青海云杉

接种韧皮部

3年

20

二十五

Leptographium wageneri

黄杉花旗松

从根部自然感染的木质部

几年

五

60

Sphaerulina musiva

毛果杨

接种干叶

8周

9

78

接种韧皮部

8周

48

100

自然感染韧皮部

几年

34

72

未感染

毛果杨

树叶

1周

四个

100

黄杉花旗松

针头

1年

6

100

从菌丝体中提取的DNA

针叶树根内生菌

不适用

麦芽汁琼脂菌丝体

2周

二十四

100

ITS1 一个：14个样品ITS4 一个：10个样品

洋蛇

不适用

麦芽汁琼脂菌丝体

2周

39

100

ITS1 一个：17个样品ITS4 一个：22个样品

3周

二十二

100

22Pf_EF1α_ - [R b

4个星期

二十二

100

22个，带CAL-737R c

5周

二十二

100

22带LR6 d

Leptographium wageneri

不适用

菌丝，液体麦芽提取液

3周

五

100

未排序

榆粳稻内生菌

不适用

麦芽汁琼脂菌丝体

2周

61

100

ITS4 a ：61个样本

Sphaerulina musiva

不适用

带有KV8琼脂的菌丝体

1周

9

100

未排序

菌丝体，液体ID KV8 培养基

1周

二十五

100

未排序

a Gardes and Bruns 1993，White 等人，1990

b 格鲁尼格等人，2007年

c Carbone 和Kohn ，1999年

d Vilgalys 和Hester ，1990年，Nelsen 等，2011年

表2.用于测试样品质量的PCR条件和引物

检测物种

底漆

热循环仪设置

反应体积，微升

反应组成

1）初始变性

2）退火和伸长

3）最终伸长率

蒂pinea

EF1-728F和Pf_EF1α_R 一

95°C 3分钟

30×95°C 30 s，49°C 1分钟，72°C 1分钟

72°C 10分钟

二十五

反应混合1：
1×PCR缓冲液
（含氯化钾或2 NH 4 ·SO 4 ），
1.5毫摩尔MgCl 2 ，
200倍μM的dNTP，
0.5μM的每种引物，
1.25U的innuTaq DNA聚合酶（Alytik 耶拿AG），100纳克模板DNA的

CAL-228F和CAL-737R b

30×95°C 30 s，50°C 1分钟，72°C 1分钟

nu-LSU-287-5'-mpn和LR 6 c

30×95°C 30 s，48°C 1分钟，72°C 1分钟

ITS1-F和ITS4 d

A）15×95°C 30 s，55°C 1分钟，72°C 1分钟
B）15×95°C 30 s，63°C 1分钟，72°C 1分钟

内生真菌

ITS1-F和ITS4 d

95°C 3分钟

A）15×95°C 30 s，55°C 1分钟，72°C 1分钟
B）15×95°C 30 s，63°C 1分钟，72°C 1分钟

72°C 7分钟

二十五

异源化

KJ-F和KJ-R或
MJ-F和MJ-R e

95°C 10分钟

40×95°C 30 s，67°C 35 s，72°C 1分钟

72°C 7分钟

二十五

Leptographium wagnerii

LEPTO1和LEPTO2 f

94°C 4分钟

35×94°C 15 s，65°C 25 s，72°C 40 s

72°C 10分钟

二十五

反应混合2：
1X标准的Taq
的MgCl 2 -free缓冲液，
1.5毫摩尔MgCl 2 ，
200倍μM的dNTP，
每种引物为0.2μM，
1.25U的Taq DNA聚合酶
（New England Biolabs公司），
15-100纳克DNA模板

毛果杨

eIF4F1和eIF4F1-R g

94°C 4分钟

35×94°C 15 s，58°C 20 s，72°C 30 s

72°C 10分钟

15

Sphaerulina musiva

NABtF 和NABtR g

9 4°C 4分钟

35×94°C 15 s，58°C 20 s，72°C 30 s

72°C 10分钟

15

黄杉花旗松

LFY989F和LFY1102R h

94°C 4分钟

35×94°C 15 s，55°C 30 s，72°C 40 s

72°C 10分钟

二十五

反应混合物2 ，但每个引物含
0.4 µM

a Carbone and Kohn 1999，Grüniget al。，2007

b Carbone 和Kohn ，1999年

c Vilgalys and Hester ，1990年，Nelsen 等，2011年

d Gardes 和Brunns ，1993 ；White 等，1990。

Ë Hantula 和Vainio ，2003

f Schweigkofler 等，2005

g Abraham 等人，2018

h Winton 等，2002

表3. PCR反应中使用的引物序列。

引物对

DNA模板的起源

正向引物序列（5'-> 3'）

反向引物序列（5'-> 3'）

EF1-728F和Pf_EF1α_R 一

蒂pinea

CATCGAGAAGTTCGAGAAGG

GGGTTGTAGCCAACCTTCTTG

CAL-228F和CAL-737R b

蒂pinea

GAGTTCAAGGAGGCCTTCTCCC

CATCTTTCTGGCCATCATGG

nu-LSU-287-5'-mpn和LR 6 c

蒂pinea

CGAGTTGTTTGGGAATGC

CGCCAGTTCTGCTTACC

ITS1和ITS4 d

菌类

CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA

TCCTCCGCTTATTGATATGC

KJ-F和KJ-R，或

细小异花孢

CCATTAACGGAACCGACGTG

GTGCGGCTCATTCTACGCTATC

MJ-F和MJ-R e

异源异化

GGTCCTGTCTGGCTTTGC

CTGAAGCACACCTTGCCA

LEPTO1和LEPTO2 f

ept 属

CAAAGACGGCAGACGCGAGTCTC

GTTCCAGGGAACTCGGAAG

eIF4F1和eIF4F1-R g

杨属。

TGGGGCCTCTATTTAGCATGGAT

CTGCACCCGAAATGGGATTGACC

NABtF 和NABtR g

Sphaerulina musiva

CGACCTGAACCACCTTGTCT

CACGGTAACAGCGCGGAACGA

LFY989F和LFY1102R h

黄杉花旗松

TGTTCAACATCCAGGCAATGA

TAACCGGCGCCTGAATGCTTCG

a Carbone and Kohn ，1999，Grünig 等，2007

b Carbone 和Kohn ，1999年

c Vilgalys and Hester ，1990年，Nelsen 等，2011年

d Gardes and Brunns ，1993，White 等，1990

Ë Hantula 和Vainio ，2003

f Schweigkofler 等，2005

g Abraham 等人，2018

h Winton 等，2002

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说明：logonew

数据分析
在R版本3.6.1中进行了数据分析。使用ANOVA进行评估，然后使用Tukey的HSD测试（图3 A ）估算PCR抑制剂对定量循环（C q ）值的影响。我们可视化了样品重量，DNA浓度，通过绘制植物和真菌样品的主成分分析（PCA）的结果（图s 3 B - 3D ）绘制PCR成功的样品纯度（A 260/280 和A 260/230 ）。řPackage该Factoextra （Kassambara 而蒙特2017）。对于P. 冷杉样品，坏死长度也包括在模型中。分离PCA'S计算了P. 毛果样品（N = 85），P. 冷杉样品（N = 48）以及真菌样本（n = 129）。通过两次样本t检验比较同一样本类型中失败和成功的PCR反应之间的模板性质差异，必要时使用对数转换对数据进行归一化。

协议性能
所有的8周龄提取的DNA样品P. 毛果韧皮部接种S. musiva 进行PCR阳性病原体（表1）.PCR 扩增工作的所有真菌类DNA样品，并且将PCR产物适合于真菌ITS相比较而言，PCR成功率为用于从天然感染的成熟中提取的DNA的样品低P. 毛果样品（72％），接种3岁P. 冷杉样品（48％），和自然感染的成熟P. 花旗松根（60％）（表1）。提取方案产生的总DNA大部分片段大于10 kb（图2）。样品在-20 °C 至少稳定2年。部分DNA片段化（图2） 2 B ）不影响PCR性能。

根据使用商业试剂盒提取的DNA样品的C q 值的比较，提取的DNA样品中可能含有可能影响通过qPCR进行目标定量的准确性的抑制剂（图3 A ）。三种最高稀释度的Cq 值较低。（P <0.040）。稀释1000倍后，提取方法对定量没有影响。从方案提取的DNA样品制备的标准曲线与市售试剂盒相比具有较低的扩增效率（图1A ）。亚伯拉罕（Abraham）等人（2018）中的qPCR方案可能不适用于使用已开发的DNA提取方案提取的样品，但是该提取方法并未影响目标检测。

图3.比较qPCR分析来估算样品抑制剂的存在（A），和主成分分析，以可视化样本性质杨毛果样品（B），年轻云杉云杉SAMP LES（C），和真菌样品（d）。

我们通过可视化主成分分析（PCA）的结果探索了DNA样品特性与PCR成功的关系。两个第一主成分（PC）解释了总变异的68-87％.A 260/280 和A 260 / 230个值一起为PC1说明大多数变异P. 毛果，P. 冷杉和真菌的DNA样品（55％，至85 PC1％和75％的贡献分别变化，）（图小号1个乙-1 d ）。对于P. 毛果癣，样品在垂直PC2轴的两侧分为两组（图3 B ）。对于PC2轴左侧的样品，PCR成功率为100％，样品纯度相对较高（图3 B））。

样品重量解释55％和沿着在PC2的变化的40％的P. 毛果和P. 冷杉分别。较大的初始样品重量用下PCR成功率相关联，用于成熟白杨和年轻挪威云杉的DNA样品（表4）。在34个聚集在PC2轴右侧的成熟杨树样品中（图3 B ），失败的PCR反应的初始样品重量和DNA浓度较高（t = 2.882，P = 0.007和t = 2.195，P = 0.035类似地，PCR扩增失败的欧洲冷杉（P. abies）样品的初始样品重量和DNA浓度较高（分别为t = 1.9511，P = 0.057和t = 2.060，P = 0.045）。尽管DNA浓度较高，但宿主和病原体扩增均失败，这可能与模板质量低下以及成熟树皮组织样品中多酚含量高有关。集中度较低和模板质量足够高可能是由于定殖较少的样品中病原体DNA含量低所致。定殖严重的样品中酚类含量高可能抑制了病原体的检测，因为坏死长度的增加与挪威云杉样品中PCR成功率的降低有关。表明从树木组织样品中提取的含有大量木质素或其他多酚化合物的DNA样品可能具有较低的PCR成功率。

真菌DNA样品基于A 260/230 和A 260/280 值（PC1变异的75％，图3 D ）变化很大，与液体培养相比，从菌丝体中提取的DNA样品的纯度通常更高。基于此，我们建议尽量减少用于DNA提取的真菌样品中的琼脂含量。尽管样品纯度差异很大，但所有真菌DNA样品的PCR扩增都是成功的。

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说明：logonew

表4.根据协议提取的不同DNA样品类型的样品重量，DNA浓度和DNA吸光度值。显示了中位数，最小值和最大值。

样品类型

样品（重量，毫克）

DNA（ng / µl）

一个260/280

一个260/230

中位数

最小-最大

中位数

最小-最大

中位数

最小-最大

中位数

最小-最大

杨树，PCR可以

100

100

二十二

11-49

2.2

1.6-2.2

1.8

1.1-2.1

杨树成熟，PCR可以

20

10-160

3

1-15

1.6

0.9-2

0.5

0.2-1.2

杨树成熟，PCR失败*

35

15-140

7

1-20

1.3

1.2-2

0.4

0.3-0.6

云杉幼嫩，PCR OK

92

36-380

30

5-266

1.5

0.7-2

0.5

0.1-2

云杉年轻，PCR失败**

136

58-326

63

10-265

1.6

1.2-2.2

0.8

0.3-2.2

真菌，液体培养基

不适用

不适用

35

5-330

2.1

1.8-2.2

1.7

1.1-2.2

真菌，固体培养基

不适用

不适用

20

2-168

1.8

0.9-2.2

0.5

0.1-2.2

*宿主和病原体PCR均失败

**仅通过病原体PCR检测

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笔记

提取缓冲液量和样品重量
我们建议每50 mg或更少的植物或真菌组织使用1 ml提取缓冲液。相对于提取组织而言，缓冲液体积低可能会对PCR成功产生负面影响。

溶解沉淀
如果在70％乙醇洗涤后DNA沉淀不是无色或白色，则添加20-50 用微升TE缓冲液或无核酸酶的水重悬DNA，而不会干扰沉淀物。将液体轻轻移入试管中几次，并收集上清液作为DNA用于下游过程。保持沉淀物直至DNA定量。使用DNA用于基于PCR的检测，或保存在冰箱中直至使用。

重复使用搅拌器
为了降低成本和减少塑料浪费，可以清洗打珠机的管子，用漂白剂处理以降解DNA，高压灭菌后再使用，将珠子，瓶盖和管子分开放在单独的容器中，用温肥皂水填充容器，搅拌均匀。 5分钟，倒出肥皂水，用自来水冲洗直到清澈的水为止，摇动试管和盖子以除去残留的自来水，用去离子水冲洗两次，以除去任何残留的DNA，将成分浸泡3％1小时W / V NaOCl 溶液（使用商业漂白剂和去离子水的1：1溶液）（肯普和史密斯，2005年）。用自来水冲洗两次，然后进行两次去离子水冲洗，使试管组件隔夜干燥或在管中干燥。烘箱中。一旦组分是干的，编译管和高压釜在121 ℃下30分钟。

菜谱

提取缓冲液
1 M氯化钠

100毫米Tris HCl

10毫米EDTA

2％PVP

在搅拌的热板上将所有成分混合在烧杯中
用无菌纯净水填充至所需体积
加热溶液直至PVP溶解
洗涤缓冲液
1％SDS

0.5 M 氯化钾或氯化钠

在搅拌的热板上将所有成分混合在烧杯中
用无菌纯净水填充至所需体积
加热溶液，直到看不到沉淀为止
使用前先加热洗涤缓冲液以溶解任何沉淀物
致谢

这项研究是由科学能源部办公室生物和环境研究（BER），授予no.DE-SC0018196办公室的支持，并通过森林科学的哥廷根。Jumoke大学学院和森林生态，资助Aduke 巴巴洛拉和大卫罗伯特Rӑscuţoi ，哥廷根大学，高度认可了他们的DNA提取贡献，PCR实验小号等了。帕特里克·班尼特博士感谢提供L. wagenerii 株和自然感染的道格拉斯冷杉根样品，和凯尔博士SOND RELI 提供成熟P. 毛样品自然感染S. musiva 。

利益争夺

没有宣布利益冲突。

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