实验名称：利用单细胞测序技术分析Rh41细胞亚群的差异表达基因
产品名称：Kapa RNA HyperPrep with RiboErase 试剂盒

[KAPA建库试剂盒在通用方法学中的应用] 下一代测序技术 (NGS)，又称为大规模平行测序技术，与一代测序技术相比，其在测序速度以及成本上的优势使得该技术在各个领域得以迅速应用。
        按所测序核酸分子的类型不同，NGS文库类型可分为DNA 文库—全基因组测序 (WGS)、全外显子组测序 (WES), 染色质免疫沉淀测序 (ChIP-seq) ; RNA 文库—全转录组测序, RNA免疫沉淀测序 (RIP-seq)。KAPA NGS系列产品可覆盖所有类型文库构建应用。
        二代测序技术被应用于各种起始样本中，而流式细胞分选和激光捕获显微切割技术的出现让在单细胞水平上研究细胞基因组及转录组异质性成为可能；目前该技术的发展逐渐成熟，已被广泛用于生命科学研究的各个领域，如：生殖细胞的遗传重组，干细胞的异质性，组织器官内细胞基因组的异质性，胚胎植入前的遗传学诊断等等。KAPA NGS文库制备方案具有文库产率高，转化率高，复杂度好，保真性好等特点，适用于各种样品类型文库的构建，尤其是像单细胞这样低起始量的困难样品更有出色表现 (Roche Dialog，罗氏诊断在华推广KAPA NGS新一代测序系列产品完善基因检测解决方案)。

研究背景

探寻一种新的用于单细胞数据中基因表达定量的方法，该方法是一种新的基于负二项模型的差分表达分析算法 (NBID)。为了验证该方法分析的不同细胞亚群的差异表达基因的可信程度，利用含标记物CD44^high 及 CD44^low两个亚群的Rh41细胞作为研究对象，FACS分别筛选出两个亚群之后进行转录组建库，分析得到两个亚群的差异表达基因。之后利用NIBD算法，分析用未分选的Rh41细胞进行单细胞建库的数据，得到的两个亚群的差异表达基因进行比对，验证重合率。

生物材料：Rh41人肺泡横纹肌肉瘤细胞系

实验目的

利用Kapa RNA HyperPrep with RiboErase试剂盒构建Rh41细胞的转录组文库，分析得到差异表达基因，与利用NIBD算法分的单细胞文库的差异表达基因进行比较，验证NIBD算法的分析效率。

关键词：基于负二项模型的差分表达分析算法(NIBD)，RNA-seq，单细胞测序，差异表达基因

实验步骤

1. 总RNA提取：利用Trizol提取Rh41细胞的总RNA。
2. RNA文库构建：总RNA起始量为200 ng，使用Kapa RNA HyperPrep with RiboErase文库构建试剂盒进行建库。经过片段化，反转录及第二链合成，用磁珠进行纯化、末端修复、加A尾、连接接头后，在C1000 (Bio-rad)上进行12个循环的PCR扩增成库。
3. 测序：在HiSeq 4000 (Illumina) 平台上进行测序分析，双端150 bp，三次重复。
4. 分析：将获得测序数据比对到人基因组上, 通过生物信息学分析差异表达情况。

实验结果

本实验中，为了分析CD44^high and CD44^low两个亚群的Rh41细胞进行差异表达，在转录组建库前，利用FACS根据CD44蛋白表达水平的高低将Rh41细胞分选成两个细胞亚群 (图 1)。


 图 1. FACS分选时CD44的表达计数 (图摘自Chen et al., 2018中的Fig 5B)

将分离得到的两个细胞亚群，构建转录组文库，测序后分析分析RNA-seq数据得到差异表达基因 (图 2)。并在单细胞数据中，利用NIBD算法得到Rh41细胞两个亚群存在1019个差异表达基因，其中699个在转录组数据中也分析得到，占68.6%，证明NIBD算法在分析差异表达有较强的的验证能力。


 图2.单细胞数据和转录组数据分析的差异表达基因的结果 (图摘自Chen et al.,2018中的Table S12中的部分数据)

参考文献

1. Chen, W., Li, Y., Easton, J., Finkelstein, D., Wu, G. and Chen, X. (2018). UMI-count modeling and differential expression analysis for single-cell RNA sequencing. Genome Biol 19(1): 70. 
2. 罗氏诊断产品（上海）有限公司生命科学部. Kapa RNA HyperPrep with Riboerase 试剂盒产品说明书.