Protein-protein Interaction Detection in Strawberry Fruit by Co-IP Assay

材料与试剂

1. 枪头
2. 离心管
3. 草莓大绿果或白果
4. 菌株 (pSPYNE和pSPYCE)
5. 液氮
6. 冰
7. Agarose protein A+G beads
8. SDS Loading Buffer
9. 磷酸缓冲液 (pH 7.8)
10. EDTA
11. 甘油
12. TritonX-100
13. DTT
14. 蛋白裂解buffer (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 移液枪
2. 注射器
3. 研磨用具
4. 涡旋振荡器
5. 离心机
   

实验步骤

1. 将待测蛋白菌液按1:1混合注射于草莓大绿果或白果 (图1) 中，此时注射菌液蛋白表达效果较好，3天后取样 (所用菌株为pSPYNE, pSPYCE)；
   
   
   图1. 草莓果实大绿果和白果时期
   
   
2. 提取草莓果实蛋白，液氮中磨样充分，加入裂解buffer，涡旋混匀，冰上放置30 min使其充分裂解，4 °C，13,800 x g离心10 min；
3. 取上清于2 ml离心管中，另取50 μl为input；
4. 离心管中按比例加入抗体，室温孵育1 h或4 °C过夜；
5. 按1:10比例加入agarose protein A + G，室温3 h，4 °C，1,000 x g离心收集beads，并用预冷的裂解buffer清洗beads约5次；
6. 洗完最后一次，去掉上清后，向beads中加入SDS Loading Buffer至终浓度为1x，混匀后加热煮沸5 min，冷却后，13,800 x g离心取适量点样；
7. Western blot检测蛋白，具体步骤参见毛文文等，(2018)。
   

溶液配方

1. 蛋白裂解buffer
   

   磷酸缓冲液 (pH 7.8)	1x
   EDTA	1 mM
   甘油	10%
   TritonX-100	0.5%
   DTT	1 mM

参考文献

1. 毛文文，魏灵芝，李冰冰，贾文锁. (2018). 草莓果实蛋白提取和Western Blot. Bio-101 e1010222. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010222.