Western-blot and Exaction of Protein from Strawberry Fruit

材料与试剂

1. 枪头
2. PVDF膜
3. NC膜
4. 海绵
5. 滤纸
6. 培养皿
7. 保鲜膜
8. 甲醇
9. X-光片
10. 冰
11. TBST
12. 脱脂奶粉
13. 显色底物
14. 30% Acr-Bis (29:1)
15. 分离胶缓冲液 (4x)
16. 浓缩胶缓冲液 (4x)
17. 10% APS
18. TEMED
19. SDS
20. Tris
21. 甘氨酸
22. NaCl
23. Tween 20
24. 浓HCl
25. 甲醇
26. Tris-HCl (pH 6.8)
27. BPB
28. 甘油
29. 巯基乙醇
30. 蛋白提取液 (见溶液配方)
31. 10%分离胶 (5 ml) (见溶液配方) 
32. 5%浓缩胶 (2 ml) (见溶液配方)
33. 电泳缓冲液 (1 L) (见溶液配方)
34. TBST溶液 (1 L) (见溶液配方)
35. 封闭液 (见溶液配方)
    
36. 转膜缓冲液 (1 L) (见溶液配方)
37. 5x SDS Loading Buffer (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 研磨用具
2. 移液枪
3. 天平
4. 涡旋振荡器
5. 离心机
6. 电泳仪
7. 摇床
8. 4 °C冰箱
9. 暗盒
   

实验步骤

1. 称取草莓果肉2 g, 用液氮在研钵中研磨成粉。
2. 加入2 ml 蛋白提取液提取蛋白，冰上放置30 min，涡旋使其充分裂解。
3. 13,800 x g，4 °C，离心10 min，取上清。
4. 取待检测样品，加入SDS Loading buffer 至终浓度为1x，混匀后加热煮沸5 min，冷却后，13,800 x g短暂离心，取适量样品点样检测。
5. SDS-PAGE电泳：SDS-PAGE胶制备好后，放入电泳槽中，加入电泳液，上样。80 V电压下电泳30 min后 (样品跑入分离胶后，以溴酚蓝线为准)，100 V电泳至蓝色条带跑至玻璃板底部。
6. 备一张与胶大小相同的PVDF膜，浸入甲醇5 min，甲醇处理的目的是活化膜上的正电基团；NC膜 (硝酸纤维素膜) 不用泡。
   注：PVDF膜和NC膜任选其一。
7. 胶放置在负极，PVDF膜放置在正极，放入电泳槽，按照海绵-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵的顺序摆放，要确保每一层都无气泡；将电泳槽置于冰水混合液中，100 V电压转膜约1.5 h。
8. 取出膜 (与胶接触面为正面，注意面不能错，做好标识)，TBST清洗 (将膜置于培养皿中，加10 ml TBST，120 rpm振荡，室温2 min，3次) 后置于封闭液 (5%脱脂奶粉，10 ml TBST) 中，室温振荡封闭6 h (120 rpm)，亦可放置4 °C冰箱过夜封闭。
9. 按比例1:8,000加一抗于10 ml TBST封闭液 (2.5%脱脂奶粉) 中，将膜浸入，4 °C过夜封闭，慢摇。
10. TBST振荡 (120 rpm) 清洗PVDF膜5-6次，每次5 min；多洗几次，可延长时间洗。
11. 按照1:10,000效价，加入对应的二抗 (标记辣根过氧化物酶) 于封闭液 (0.5%脱脂奶粉) 中，将膜转放入，室温摇床反应2 h。
12. TBST振荡 (120 rpm) 洗5-6次，每次5 min，可延长时间。
13. PVDF膜置于培养皿中，按1:1混匀显色底物 (ECL，加1 ml)，均匀滴加在PVDF膜正面，手动摇晃反应3-5 min，用滤纸吸去多余液体。
14. 盖上保鲜膜，中间不可有气泡，显色底物较多时可将PVDF膜置于新的保鲜膜中，放入暗盒中。
15. 在暗室将X-光片放在 PVDF膜上，压入暗匣中，曝光时间依信号强弱调整 (30 s-2 min) 。
16. 进行X-光片显影 (1-3 min) 和定影 (30 s)。
    

溶液配方

1. 蛋白提取液
   磷酸缓冲液 (pH 7.8)
   

   EDTA	1 mM
   甘油	10%
   Triton X-100	0.5%
   DTT	41 nm

2. 10%分离胶 (5 ml)
   

   H2O	2.42 ml
   30% Acr-Bis (29:1)	1.33 ml
   分离胶缓冲液 (4x)	1.25 ml
   10% APS	0.05 ml
   TEMED	0.003 ml

3. 5%浓缩胶 (2 ml)
   

   H2O	1.14 ml
   30% Acr-Bis (29:1)	0.34 ml
   浓缩胶缓冲液 (4x)	0.5 ml
   10% APS	0.02 ml
   TEMED	0.002 ml

4. 电泳缓冲液 (1 L)
   

   SDS	1 g
   Tris	1 g
   甘氨酸	14.4 g

   ddH₂O定容到1 L
5. TBST溶液 (1 L)
   

   Tris	2.42 g
   NaCl	8 g
   Tween 20	1 ml

   加浓HCl 1 ml调pH至7.8
6. 封闭液
   5% 脱脂奶粉融入TBST溶液
7. 转膜缓冲液 (1 L)
   

   Tris	3.03 g
   甘氨酸	14.4 g
   甲醇	200 ml

   ddH₂O定容到1 L
8. 5x SDS Loading Buffer
   

   Tris-HCl (pH 6.8)	250 mM
   SDS	10% (w/v)
   BPB	0.5% (w/v)
   甘油	50% (w/v)
   巯基乙醇	5% (w/v)