Citrus Genomic DNA Microextraction Using CTAB Method

材料与试剂

1. 离心管 (2 ml圆底、1.5 ml)
   
2. 0.5 cm直径钢珠
   
3. 各种型号的枪头 (1 ml，200 μl，20 μl)
   
4. 棕色瓶
   
5. CTAB
   
6. β-巯基乙醇
   
7. Tris-饱和酚
   
8. 氯仿 (三氯甲烷)
   
9. 异戍醇
   
10. 异丙醇
    
11. 浓盐酸
    
12. NaOH
    
13. 无水乙醇
    
14. Tris
    
15. EDTA
    
16. NaCl
    
17. 1 M Tris-HCl (pH 8.0) (见溶液配方)
    
18. 0.5 M EDTA (pH 8.0) (见溶液配方)
    
19. 5.0 M NaCl (见溶液配方)
    
20. 氯仿:异戍醇 (24:1) (见溶液配方)
    
21. 苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1) (见溶液配方)
    
22. TE缓冲液 (见溶液配方)
    
23. CTAB buffer (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 加样枪
   
2. 离心管架
   
3. 震荡磨样机
   
4. 恒温水浴锅 (常州润华电器有限公司)
   
5. 各种规格的移液器
   
6. 离心机 (配备1.5 ml转头，转速大于10,000 rpm)
   
7. 4 °C冰箱
   
8. -20 °C冰箱
   

实验步骤

1. 取0.1 g左右的柑橘叶片放入装有两颗0.5 cm直径钢珠的2 ml离心管中，盖好离心管盖后连同离心管架一起浸入液氮中速冻1 min，取出后迅速放入震荡磨样机载物台上，170 HZ频率震荡3 min至叶片充分磨碎。
   
2. 加入700 μl CTAB提取液，颠倒混匀，然后在65 °C水浴锅中温浴60-90 min，隔15 min取出上下轻轻颠倒几次。
   
3. 水浴之后，加入800 μl苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1)，上下颠倒混匀10 min以上，然后10,000 x g离心10 min。
   
4. 吸取上清液转至另一1.5 ml离心管中，加入60 μl 5 M NaCl，再加入-20 °C冰冻无水乙醇1 ml，轻轻颠倒数次，混合均匀后冰冻30 min以沉淀DNA。
   
5. 然后10,000 x g离心5 min，弃上清液，加入1 ml 70%酒精浸泡2小时或过夜，10,000 x g离心5 min，弃酒精之后在工作台上风干DNA，加入120 μl TE缓冲液溶解DNA。
   

注意事项

1. 微量法提取DNA纯度不高，若要提高质量，可适当减少组织样品量 (0.05 g)，或者重复苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1) 抽提步骤。
   
2. 风干DNA步骤不宜过干，否则DNA不容易溶解。
   
3. 提取过程动作要轻柔，防止DNA分子断裂降解。
   

溶液配方

1. 1 M Tris-HCl (pH 8.0)
   称取Tris-Base 121 g，加入约800 ml水在磁力搅拌器上搅拌，使其充分溶解后加入浓盐酸调pH至8.0后加水定溶至1,000 ml，灭菌 (121 °C，15 min) 后于室温保存
   
2. 0.5 M EDTA (pH 8.0)
   称取EDTA-Na₂盐187 g加入约800 ml水，在磁力搅拌器上边搅拌边加入固体NaOH，当EDTA和NaOH均完全溶解，溶液变清时其pH值刚好达到8.0左右，再用pH试纸略加调整即可，灭菌 (121 °C，15 min) 后于室温保存
   
3. 5.0 M NaCl
   称取NaCl 300 g，加入蒸馏水约800 ml于磁力搅拌器上充分搅拌，约5分钟后停止搅拌，静止2~3分钟，倒出上清液，再加入100 ml蒸馏水重复前面的步骤，直到NaCl充分溶解后定溶至1,000 ml，灭菌 (121 °C，15 min) 后于室温保存
   
4. CTAB buffer
   
   DNA Buffer灭菌后于室温下保存3个月左右，使用时取适量Buffer按2%比例 (每100 ml Buffer加入2 g CTAB) 加入CTAB，65 °C水浴锅中充分溶解；在通风橱里加入1%的巯基乙醇 (现配现用)
   
5. 氯仿:异戍醇 (24:1)
   500 ml氯仿中加入21 ml异戊醇，混匀，棕色瓶中常温保存
   
6. 酚:氯仿:异戍醇 (25:24:1)
   Tris-饱和酚与氯仿:异戍醇 (24:1) 以1:1的比例等体积混合，棕色瓶中4 °C冰箱保存，使用时取下层
   
7. TE缓冲液 (100 ml)