Observation of Rice Tissues with Semi-thin Section

材料与试剂

1. 2 ml离心管
   
2. 吸管
   
3. 注射器
   
4. 牙签
   
5. 1 ml加样器
   
6. 200 μl加样器
   
7. 细毛笔
   
8. 滤纸
   
9. 戊二醛
   
10. NaH₂PO₄·2H₂O
    
11. Na₂HPO₄·12H₂O
    
12. 甲苯胺蓝
    
13. 乙酸
    
14. 滤纸
    
15. 伊红
    
16. 无水乙醇 (国药试剂)
    
17. Technovit 7100
    
18. 硬化剂Ⅰ
    
19. 硬化剂Ⅱ
    
20. 石蜡
    
21. 0.1 M PBS, pH 7.2缓冲液 (见溶液配方)
    
22. 脱水剂 (见溶液配方)
    
23. 固定剂 (见溶液配方)
    
24. 渗透液 (见溶液配方)
    
25. 包埋剂 (见溶液配方)
    
26. 染色液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 烘箱 (温度范围25-100 °C，国产)
   
2. 磁力搅拌器 (国产)
   
3. 干燥器 (国产)
   
4. 玻璃刀制刀机 (Leica KMR3，Germany)
   
5. 钻石刀 (超薄级，DiTOME，Switzerland)
   
6. 超薄切片机 (Leica UC6，Germany)
   
7. 透射电子显微镜 (H-7650，Japan)
   
8. 用具：手术剪刀、眼科镊子、量筒、烧杯、包埋模具、酒精灯、玻璃条
   

实验步骤

1. 取样：目的水稻组织切成6 mm³的小块，每份样品至少取20个小块，迅速置于2.5%戊二醛固定液中，抽真空2 h，4 °C或室温固定一周以内。
   
2. 梯度脱水：依次更换30%、50%、70%、80%、90%、100%、100%乙醇溶液，每个梯度室温放置10min。
   注：更换100%乙醇时，速度要快！
   
3. 树脂渗透：室温下，依次更换3:1、1:1、1:3的无水乙醇与7100包埋剂的混合液，每个梯度作用12 h。再更换纯包埋剂，作用12 h。
   
4. 包埋聚合：在包埋磨具中加入0.5 ml左右包埋剂，用干燥牙签将样品挑到包埋孔子并定位到合适的位置，缓缓注入包埋剂至包埋孔满。加入的包埋剂以包埋孔的液面凸起不溢出为准，并将样品拨正。加了硬化剂Ⅱ的包埋剂极易凝固，室温下包埋操作可进行5-7 min。样品在38 °C烘箱中聚合过夜。
   
5. 修块：用单面刀片切包埋块，使样品稍稍暴露，并使待切部位呈方形或长方形，最后用单面刀片将样品块的切面切平。
   
6. 玻璃刀的制备：玻璃条洗净，晾干。用玻璃制刀机将玻璃条对半切成两条等长的，再对半切，制成边长为25 mm的正方块，然后再将每个正方块按对角线切割，切成2把玻璃刀。玻璃刀现制现用较好。
   
7. 粘刀槽：将玻璃刀放在Leica EMMP展片台上预热，同时将塑料刀槽放在展片台的溶蜡区预热，以便沾上少许蜡，然后将刀槽固定在刀背上，并用石蜡密封刀槽底部和左右两边，避免漏水。
   
8. 固定样品块和玻璃刀：将样品包埋块固定在超薄切片机的固定器上，将有刀槽的玻璃刀固定在刀台上，调整刀的角度为4度，选择切片上下位置。
   
9. 切片：用吸管向水槽内加水，使在刀刃处有薄层液体并形成月形水面。粗进刀，靠近样品，然后选择切片厚度1 μm，切片速度3-5 mm/sec，进行切片。
   
10. 捞片、展片、粘片：当刀槽水面上有完整的切片时，用头发丝或细铜丝绕成小圈，固定在手柄上捞片，并将切片转移到滴有蒸馏水的载玻片上，然后将载玻片放到展片台上展开，当载玻片上的水滴被蒸干后切片就被粘在载玻片上。
    
11. 染色：在载玻片的切片部位上加入1滴甲苯胺蓝染液，染色2-5 min，用蒸馏水冲去多余的染液，滤纸吸干多余的水分，烘干。
    
12. 样品块的保存：固化好的样品块放在干燥器中4 °C保存，以免树脂变性。
    

溶液配方

1. 0.1 M PBS, pH 7.2缓冲液
   A液：NaH₂PO₄.2H₂O 31.21 g 定容到1,000 ml
   B液：Na₂HPO₄.12H₂O 71.64 g 定容到1,000 ml
   取A液28 ml，B液72 ml配制成0.2 M PBS缓冲液，然后用蒸馏水稀释成0.1 M的工作液
   
2. 脱水剂
   30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇和无水乙醇
   
3. 固定剂
   2.5%戊二醛 (进口品质试剂，0.1 M PBS, pH 7.2配制)
   
4. 渗透液
   100 ml Technovit 7100加入1 g硬化剂Ⅰ，玻璃棒搅拌约5 min，至白色颗粒完全溶解
   
5. 包埋剂
   按照1 ml硬化剂Ⅱ加入15 ml渗透液的比例配制
   
6. 染色液
   1)

   1%甲苯胺蓝
   甲苯胺蓝1 g
   95%乙醇4 ml
   10%乙酸10 ml
   搅拌后用滤纸过滤
   
   2)

   伊红乙醇溶液
   伊红0.5 g
   95%乙醇100 ml