Subcellular Localization of Proteins in Rice Cells Using Immunogold Labeling Technique

材料与试剂

1. 2 ml离心管
   
2. 吸管
   
3. 注射器
   
4. 牙签
   
5. 培养皿
   
6. 液氮50 L
   
7. 包埋模具 (geltin胶囊)
   
8. 玻璃条
   
9. 铜网
   
10. 铜网镊子
    
11. 细毛笔
    
12. 滤纸
    
13. 蜡板
    
14. 乙醇(国药试剂)
    
15. 多聚甲醛
    
16. 25%戊二醛(进口品质)
    
17. NaH₂PO₄·2H₂O
    
18. Na₂HPO₄·12H₂O
    
19. NaCl
    
20. PBS
    
21. NaOH
    
22. LOWICRYL K4M Embedding Kit (Electron Microscopy Science, USA, catalog number: 14330)
    
23. TWEEN20
    
24. BSA
    
25. Glycine
    
26. 0.01 M PBS, pH 7.2缓冲液 (见溶液配方)
    
27. 固定剂 (见溶液配方)
    
28. 脱水剂 (见溶液配方)
    
29. 包埋剂 (见溶液配方)
    
30. PBST (见溶液配方)
    
31. 阻断液 (见溶液配方)
    
32. 醋酸铀染液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 天平
   
2. 玻璃棒
   
3. 量筒
   
4. 烧杯
   
5. 酒精灯
   
6. 手术剪刀
   
7. 眼科镊子
   
8. 冰箱
   
9. 紫外聚合仪 (Leica EM AFS2, Germany)
   
10. 玻璃刀制刀机 (Leica KMR3, Germany)
    
11. 钻石刀 (超薄级，DiTOME, Switzerland)
    
12. 超薄切片机 (Leica UC6, Germany)
    
13. 透射电子显微镜 (H-7650, Japan)
    
14. 真空泵
    

实验步骤

1. 取样：以下所有操作均在冰上进行。将水稻组织切成小块，每份样品至少取10个小块，迅速置于预冷的4%多聚甲醛和0.5%戊二醛的混合固定液中，抽真空至样品沉底后再继续抽2 h。4 °C冰上可以保存一周。不同水稻组织取样要求：组织要在固定液中剪切。叶片切成1 mm × 1 mm小块，花药两端剪开，幼嫩组织可取大些但不能超过3 mm³，其他含硅的组织剪的越小越好。
   
2. 脱水：所有乙醇梯度(除30%乙醇)均需要提前半小时预冷到-20 °C。30%乙醇在4 °C冰上操作，其他均在-20 °C操作。具体流程如下：30%乙醇 1 h → 50%乙醇 1 h → 70%乙醇1 h(此步可过夜)→ 80%乙醇 30 min → 85%乙醇 20 min → 90%乙醇 20 min → 95%乙醇 20 min → 100%乙醇 1 h → 100%乙醇 1 h。
   
3. 渗透：所有步骤均在-20 °C操作。树脂K4M与乙醇的配比(体积比)及渗透时间流程如下：3:1 12 h→2:1 12 h→1:1 12 h→1:2 12 h→1:3 12 h→纯树脂K4M 12 h。
   
4. 包埋聚合：Leica EM AFS2紫外聚合仪提前加入50 L液氮，将样品室预冷到-20°C。将胶囊加满树脂K4M，用预冷的牙签将样品挑进胶囊中，盖紧胶囊。开始运行紫外聚合程序-20 °C UV 48h，25 °C UV 48 h。聚合后，样品编号好4 °C干燥器中保存。
   
5. 超薄切片：将包埋块粗修暴露出样品，再用玻璃刀细修成梯形；安装钻石刀，对刀，进刀进行切片，将样品切成厚度为60-80 nm的切片，镍网捞片，自然烘干。
   以下标记工作均在湿盒内操作。
   
6. 阻断：将镍网倒扣在阻断液液滴上20 min。
   
7. 清洗：将阻断液上的镍网转移到PBST液滴上，洗2次，每次10 min。
   
8. 一抗孵育：1:50稀释一抗(1 μl抗体+49 μl PBST)，将镍网转移到一抗的液滴上，4 °C冰箱过夜。同时用PBST代替一抗做阴性对照。
   
9. 清洗：将阻断液上的镍网转移到PBST液滴上，洗3次，每次10 min。
   
10. 晾干：将清洗后的镍网吸干并晾在小皿的滤纸上，镍网正面向上，盖上平皿盖子，以免粘灰。晾干30 min，也可放置更久。
    
11. 二抗孵育：1:50稀释二抗，将镍网转移到二抗的液滴上，37 °C孵育1 h。
    
12. 清洗：将阻断液上的镍网转移到PBST液滴上，洗6次，每次10 min。最后，用滤纸吸干镍网上的水。
    
13. 染色：在干净的培养皿内放置蜡板，把醋酸铀液滴到蜡板上，将镍网覆于染液上30 min，然后用双蒸水冲洗、吸干。
    
14. 透射电镜观察：将铜网固定于样品杆上，样品杆插入透射电镜，加高压，同时打开CCD成像系统。低倍找到切片上的样品，选择感兴趣的区域进行聚焦成像，CCD成像系统获得相应的数码照片。
    

注意事项

1. 金标成功标记的关键在于一抗与切片上抗原的结合能力及特异性，Western blot是检验一抗特异性及结合能力的重要标准。
   
2. 一抗浓度和二抗浓度要根据每次标记后的图片结果做调整和摸索。一般情况下，金标中一抗浓度要比Western blot中的要高 (撰写者实验经验)。二抗浓度根据推荐的稀释比进行稀释。
   

溶液配方

1. 0.01 M PBS, pH 7.2缓冲液
   

   NaH2PO4.2H2O	0.175 g
   Na2HPO4.12H2O	1.71 g
   NaCl	3.51 g

   溶于400 ml蒸馏水中
   
2. 固定剂 (4%多聚甲醛和0.5%戊二醛的混合固定液)
   

   多聚甲醛粉末	1 g
   溶于49 ml	0.01 M PBS中

   加入1 M NaOH溶液并放60 °C水浴中促进多聚甲醛溶解
   大约30 min后，白色粉末溶解
   待溶液冷却后再加入25%戊二醛1 ml，混匀即可
   
3. 脱水剂
   乙醇的水溶液(30%, 50%, 70%, 80%,85%, 90%, 95%, 100%)
   
4. 包埋剂
   LOWICRYL K4M Embedding Kit (Electron Microscopy Science, USA) 配制5个样品的用量：
   

   Cross link A	4.05 g
   Monomer B	25.95 g
   Initator C	0.15 g

   取以上三组分加入干燥的烧杯中，用玻璃棒将粉末压碎并轻轻搅拌5 min，混匀树脂即可用
   
5. PBST
   

   NaH2PO4.2H2O	0.255 g
   Na2HPO4.12H2O	3.27 g
   NaCl	4.25 g

   溶于500 ml蒸馏水中
   加入0.25 ml TWEEN20
   
6. 阻断液
   

   BSA	0.02 g
   Glycine	0.75 g

   溶于20 ml PBST中
   
7. 醋酸铀染液
   使用双蒸水将醋酸铀配成0.5%的水溶液，醋酸铀溶解需15-30 min