Isolation of mitochondria

Isolation of mitochondria from cultured cells using nitrogencavitation method

Buffers and solutions

1X Isolation Buffer (IB):

220 mM Mannitol, 70 mM Sucrose, 10 mM HEPES—KOH pH 7.4, 1 mM EGTA, protease inhibitors.

For 500 ml:

Dissolve 20 g of Mannitol,12 g Sucrose in 400 ml of ddH₂O. Add 5 ml of 100 mM EGTA, 5 ml of 1 M HEPES—KOH, pH 7.4.

Cool at 4°C for 30 minutes. Check pH, adjust with HCl or KOH if necessary.

Bring volume up to 500 ml.

5X Isolation Buffer (IB):

1.1 M Mannitol, 350 mM Sucrose, 50 mM HEPES-­‐KOH pH 7.4, 5 mM EGTA, protease inhibitors.

For 100 ml:

Dissolve 20 g of Mannitol, 12 g Sucrose in 70 ml of ddH₂O (It might be necessary to heat up to waterto help dissolving the mannitol and sucrose).

Add 5 ml of 100 mM EGTA, 5 ml of 1 M HEPES—KOH, pH 7.4.

Bring volume up to 100 ml.

80%Percoll Solution (10 ml): 

4 ml 5X Isolation Buffer, 16 ml Percoll

52% Percoll Solution(10 ml):

6.5 ml 80% Percoll, 3.5 ml 1X isolation buffer

21% Percoll Solution(10 ml):

2.63 ml 80% Percoll, 7.37 ml 1X isolation buffer
 

Isolation of crude mitochondrial fraction

1. Harvest 2x108 cells in 50 ml tube by centrifugation at 1000 rpm for 10 minutes.
   Perform all steps at 4°C from here onwards.
2. Discard supernatant. Wash cells once with 30 ml ice—cold PBS and pellet cells at 1000 rpm for 10 minutes.
3. Discard supernatant. Resuspend cells in 30 ml of isolation buffer. Pellet cells at 1000 rpm for 10 minutes. Discard supernatant.
4. Resuspend cell pellet in 15 ml isolation buffer supplemented with protease inhibitor cocktail, and transfer cell suspension to a Parr 40 ml nitrogen bomb.
5. Pressurize chamberto 200 psi, and allow equilibration for 10 minutes on ice.
6. Release cell lysate into a centrifuge tube through the release valve of the nitrogen bomb.
7. Centrifuge lysate at 600 g for 5 minutesusing SS—34 rotor to remove nuclei and intact cells.
8. Transfer supernatant (containing mitochondria) to a fresh centrifugetube.
9. Resuspend pelletin 15 ml of isolation buffer (supplemented with protease inhibitors)and transfer resuspension to a 40 mlWheaton glass homogenizer.
10. Very gently (with fluidity) dounce the pellet with a Wheaton tight glass douncer for 10 strokes.
11. Transfer lysate to a fresh centrifuge tube and centrifuge at 600 g for 5 minutesat 4°C.
12. Pool supernatant with that collected in step 8. Discard pellet.
13. Centrifuge combined supernatant for 5 minutes at 650 g. Transfer supernatant to a fresh tube. Repeat this step until the pellet becomes hardly visible (typically 2—4 times). 
14. Pellet crude mitochondrial fractionat 10,000 g for 10 minutes.
     

Gradient purification of crude mitochondrial fraction

Resuspend crude mitochondrial fraction in 1 ml of IB until homogeneity is reached. Overlay the mitochondrial suspension onto a discontinuous Percoll gradient prepared as follows:

1.25ml 80% percoll 
3.75ml 52% percoll 
3.75ml 21% percoll

Centrifuge at 23200 rpm for 90 minutes at 4°C. Collect mitochondria at 21%/52% interface.

Wash mitochondria with IB and pellet mitochondria by centrifugation at 13,000 rpm for 10 minutes. Repeat this step twice.

Category