材料和试剂

生物材料

1. P3 胶质母细胞瘤干细胞样细胞（由患者 [14] 产生，并通过 CRISPR-cas9 编辑 [2] 进行修改）

试剂

1.神经基础培养基（NBM）（Gibco，目录号：2110349），4°C 保存

2. B27 50×（Thermo Fisher Scientific，目录号：17504044），4°C 保存

3.FGF基础（PeproTech，目录号：100-18B），储存于-20°C

4.肝素（Sigma-Aldrich，目录号：H3149）

5.青霉素 - 链霉素（Dutscher，目录号：P06-07100），储存于-20°C

6.不含葡萄糖的神经基础培养基（NBM _{W / O}）（Gibco，目录号：A2477501），储存于4°C

7.[ ¹³ C] ₆ -葡萄糖（Sigma，目录号：389374），4 °C 储存

8. Accutase（Corning，目录号：25058CI），储存于-20°C

9.磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Gibco，目录号：14190-094），4°C储存

解决方案

1. 细胞培养基（见配方）

食谱

1. 细胞培养基

通过在 500 mL 培养基中加入 10 mL B27、20 ng/mL 基本 FGF、100 U/μL 肝素和 1,000 U/mL 青霉素-链霉素，制备完整 NBM (cNBM) 和完整 NBM _W/O (cNBM _W/O )。用 4.5 mg/mL [ ¹³ C] ₆ -葡萄糖 ([ ¹³ C] _{6 -葡萄糖 NBM) 补充 cNBM}_W/O。

实验室用品

1. 滤膜 0.2 μm（Sartolon 聚酰胺）

2.Qiagen RNeasy Mini试剂盒（Qiagen，目录号：74104）

设备

1. CO ₂培养箱（松下，型号：MCO-18AC-PE，目录号：13040182）

2.缺氧室（Heraeus，型号：B 5060 EK/CO2，目录号：8403096）

3.真空泵（KNF Neuberger，型号：N86 KN.18，目录号：D-79112）

软件和数据集

1. 此处使用的数据集和软件列于表 1 中。DIMet 工具 [6] 及其配套数据格式化工具 TraceGroomer 均可通过两个用户友好的 Galaxy 网络平台使用：Galaxy EU [15] 和 Workflow4Metabolomics (W4M) [16,17]。对于此方案，选择 W4M 是因为它包含一个同位素校正工具 [18]，该工具与 DIMet 和 TraceGroomer 兼容。用户无需具备任何编码技能。

表 1. 用于数据分析的软件和数据集。DIMet和 TraceGroomer Galaxy 版本可通过 Workflow4Metabolomics (W4M) https://workflow4metabolomics.usegalaxy.fr/和 Galaxy EU ( https://usegalaxy.eu/ ) 获取。

类型	软件/数据集/资源	版本	日期	执照	使用权
数据	https://zenodo.org/records/13741706	0.3	2024 年 10 月 9 日	共享许可协议	自由的
软件	DIMet 的网络 Galaxy 版本（源代码： https: //github.com/cbib/DIMet）	0.2.4	2024 年 3 月 22 日	麻省理工学院	自由的
软件	Tracegroomer 的网络 Galaxy 版本 ( https://github.com/cbib/TraceGroomer )	0.1.4	2024 年 6 月 8 日	麻省理工学院	自由的
工作流管理器	Galaxy Workflow4Metabolomics (W4M) https://workflow4metabolomics.usegalaxy.fr/	23.0	2023 年 6 月 6 日	GPL-3.0	自由的

程序

细胞以球状体形式生长，并在 37 °C 的 5% CO ₂培养箱中在 cNBM 中培养。使用前，对这些细胞系进行支原体污染检测。使用特定 PCR 引物确认不存在支原体。用于实验程序的所有细胞系均在第 10 代和第 30 代之间培养。

A. 细胞传代

1. 将球体收集到 15 mL 管中。

2. 将管以 1,000× g 的速度离心5 分钟。

3. 除去上清液，用 5 mL PBS 清洗两次。

4. 以 1,000× g 的速度离心管5 分钟。

5. 除去上清液。

6. 在 37°C 下用 1 mL Accutase（700 U/mL）分离球体 15 分钟。

7. 用 9 mL [ ¹³ C] ₆ -葡萄糖 NBM 回收细胞。

8. 计数细胞。

B. 标记底物给药

^{1. 将 500,000 个 P3 细胞接种于含有 [ 13} C] ₆ -葡萄糖 NBM的 6 孔板中。

_{2. 在常氧（21％O 2}）或缺氧（0.1％O ₂ ）条件下孵育细胞0、24和48小时。

C. 用于代谢组学数据采集的细胞提取物

1. 对于悬浮细胞（快速过滤法）：

a. 将1 mL细胞培养物滴于0.2 μm的滤膜上。

b. 用 2 mL PBS 冲洗过滤器。

c.迅速从过滤装置中取出滤膜，放在铝箔上，放入液氮中冷冻。

d. 将滤膜储存于-80℃。

2. 对于细胞上清液：

a. 从过滤装置中回收过滤后的上清液。

b. 装运前将上清液储存于-80°C。

3. 遵循核心服务的指导。在我们的案例中，代谢组学分析是与 MetaboHub-MetaToul 合作进行的。

D. RNA纯化用于转录组数据采集

1.用cNBM在6孔板中接种500,000个P3细胞。

_{2. 在常氧（21％O 2}）或缺氧（0.1％O ₂ ）条件下孵育细胞0、24和48小时。

3. 按照 C 部分的方法冷冻细胞。

4. 根据制造商的协议，使用 Qiagen RNeasy Mini 试剂盒从新鲜冷冻细胞中提取 RNA。

5. 检查 RNA 的质量和数量。我们使用了片段分析仪 (Agilent) 和该公司的标准灵敏度 RNA 试剂盒 (DNF-471)。转录组测序是与德国德累斯顿国家肿瘤疾病中心 (NCT) 分子肿瘤诊断核心单位 (CMTD) 合作进行的。

E. 用于组学数据采集的生物样本的运输

将所有样品放在干冰中寄出。这对于运送到代谢组学核心的样品和运送到转录组学平台的样品均有效。代谢组学数据采集和 RNA 测序不在本方案的范围内；两者均可在我们之前的出版物 [2] 中查阅。

F. 收集代谢组学和转录组学数据集

1. 收集标记的代谢组学数据。检查数据是否已根据天然同位素的存在进行了校正；大多数代谢组学服务都提供同位素体的校正丰度。此校正由外部工具（如 W4M 中的 IsoCor [18]）进行。

2. 收集测序服务获得的转录组学（RNA-seq）数据，并进行差异分析，获得差异表达基因（DEG）表（见注1）。

数据分析

A. 使用 Galaxy 中的 DIMet 准备分析数据

1. 从 Zenodo ( https://zenodo.org/records/13741706 )下载提供的数据，并查看其详细说明。代谢组学设施已使用 IsoCor 对代谢组学数据进行了预校正。除了代谢组学数据外，还提供了 T0 和 T48 时间点的 LDHAB-KO 与对照的差异表达基因 (DEG)。在本地计算机上保存并解压缩下载的文件夹。

2. 确保代谢组学数据每组至少包含 3 个生物学重复（最佳为 ≥ 5 个生物学重复）。提供的数据包含 3 个生物学重复。

B. 通过 Galaxy Web 工作流管理器访问 DIMet 工具

1. 在浏览器中打开 Galaxy W4M https://workflow4metabolomics.usegalaxy.fr/。如果不熟悉 Galaxy，请参阅文件 S1以获取有关加载文件、打开工具和重复使用文件的指导。在同一个 Galaxy 会话中运行所有后续步骤，以便轻松重复使用文件。

2. 只需要网络浏览器；无需编码技能。

C. 使用 TraceGroomer 格式化代谢组学数据

1. 打开 Galaxy 中的 TraceGroomer 工具（图 1A）以格式化数据以与 DIMet 兼容：

a. 上传标记的代谢组学文件和样本元数据文件（图 1A.i）。

b. 将适当的文件拖放到必填字段，如图 1A.ii 所示。

c. 将可选文件字段留空，并使用输入类型（“isocor 输出文件”）和高级选项的默认设置。运行该工具。

d. 下载输出文件。TraceGroomer 生成四个文件（图 1A.iv）[6]。这四个量化文件将在 DIMet 模块的以下步骤中使用。

图 1. 格式化并全局探索数据集。（A）使用 TraceGroomer 格式化。上传元数据文件和代谢组学文件 (i)，然后将它们拖放到各自的字段 (ii)。运行 (iii)。四个输出文件分别是同位素体丰度、同位素体比例、平均富集度和总代谢物丰度 (iv)。（B）使用主成分分析 (PCA) 图探索全局数据结构。将总丰度和平均富集度（在 A 中生成）以及元数据拖放到所示的字段 (i)。选择条件 (ii，上方)、输出格式 (ii，左下方) 和运行 (ii，右下方)。输出由两种类型的图形组成：主成分 1 和 2 的投影（散点图）（iii，左上方；iii，右侧）和成分变异性（条形图）（iii，左下方）。

D. 使用 DIMet 的主成分分析 (PCA) 探索全局数据结构

1. 打开Galaxy 中的dimet pca 绘图模块，继续 C 部分中使用的相同会话。

2. 将适当的文件拖放到字段中，如图 1B.i 所示。您需要提供总代谢物丰度（或平均富集）文件以及样本元数据文件。

3. 设置参数如图 1B.ii 所示。从下拉菜单中选择两个条件（对照和 LDHAB-KO），并使用单选按钮指定所需的输出格式（.pdf 或 .svg）。运行模块。

4. 执行后，可视化结果（图 1B.iii）并下载（注 2）。

E. 使用 DIMet 探索代谢物定量分析

1. 对于每个专用模块，在您的会话中单独运行它们（表 2 和图 2A）。按照表 2 所示拖放每个模块的输入量化文件。继续按照前面的步骤分配元数据文件。

表 2. DIMet 模块用于生成单个代谢物的图像。三个模块均接受相应的定量文件。

在 Galaxy 中打开此模块	拖放此量化文件作为输入
二聚体富集图	平均富集
二聚体同位素图	同位素比例
二聚体丰度图	总代谢物丰度

图 2. 使用 DIMet 探索代谢物定量分析。水平面板表示步骤，而垂直面板表示三个模块中的每一个。（A）三个模块的名称必须单独使用。（B）三个模块的通用参数：在条件框中设置顺序，如 (i) 所示，并选择所有时间点（ii，上方）。（C）调整模块特定参数以获得与 D 中相同的输出。（D）输出图。对于同位素异质体（中间）和总丰度条（右），图例作为单独的文件生成。

2. 设置数据特定参数（如图 2B 所示），这些参数在所有三个模块中保持一致。接下来，调整模块特定参数（如图 2C 所示）。

3. 运行模块。完成后，查看并下载结果（图 2D）。

F. 对两组（LDHAB-KO 和对照样本）进行 DIMet 差异分析

1.打开Galaxy中的dimet差分分析模块。

2. 识别 C 部分生成的文件和会话中的元数据（图 3A）。dimet差异分析接受任何类型的量化文件，但每次运行只能接受一种类型。

图 3. 使用 DIMet 进行两组之间的差异分析。（A）会话中的活动文件。（B）在下拉菜单（上方）中选择量化文件的类型，然后将量化文件（中间）和元数据（下方）拖放到各自的字段中。（C）选择“Wilcoxon 秩和检验”作为统计检验。（D）定义要比较的两组：在条件框中，按指示顺序设置“LDHAB-KO”和“Control”（上方）；在浏览时间点菜单中，选择 T48（下方）。（E）选择 fdr_bh（对应于 Benjamini-Hochberg 方法）作为多重检验校正方法并运行。输出表 (F) 可以可视化和下载。

3. 拖放输入文件，如图 3B 所示。

4. 设置非参数统计检验，如图 3C 所示。

5. 定义要比较的两个组，如图 3D 所示。在此示例中，比较了 T48 时的 LDHAB-KO 与对照组。您可以使用任何其他时间点进行此练习。

6. 选择校正多重检验的方法，如图 3E 所示（见注释 3），然后运行该模块。

7. 可视化结果输出表（图 3F）并下载。

G. 使用 DIMet 进行时间过程分析

1. 打开dimet 时间进程分析模块，可以比较连续的时间点。

拖放其中一个（任意）量化文件（如图 3B 所示）和元数据。

3. 选择统计检验和多重检验校正方法，如成对差异分析一样（参见 F 部分）。

4. 在条件框（图 3D，上）中，指定将用于分析的条件（请注意，这里不比较条件）。

5. 运行模块。DIMet 将自动比较每个条件下的连续时间点（ t _x+1 vs. t _{x ）。}

6. 一旦获得结果，请下载输出表。文件名表明执行了哪些比较。

H. 使用 DIMet 比较不同条件或时间点之间的整个标记概况

1. 打开dimet 双变量分析模块比较整个标记概况（见注释 4）。

2. 拖放同位素比例文件（如图 3B 所示）和元数据。

3. 在统计测试应用单选按钮部分中选择 Spearman 检验。

4. 在条件框（图 3D）中，设置所需条件。然后，选择“fdr_bh”进行多重测试校正（使用单选按钮），如图 3E 所示。

5. 运行模块。DIMet 将自动执行比较：(i) 每个时间点的 LDHAB-KO 和对照样本之间的比较，以及 (ii)每种条件下的t _x+1与 t _{x之间的比较。}

6. 下载输出表。文件名将指示执行的比较。

I. 使用 DIMet 整合代谢组学和转录组学数据

1. 打开dimet 代谢图模块，将标记代谢组学与转录组学数据集整合在一起，进行成对差异分析。继续在同一会话中重复使用总代谢物丰度文件（在 C 部分生成）和元数据文件（图 4A.i）。

图 4. 使用 DIMet 整合代谢组学和转录组学数据。（A）准备好用于dimet 代谢图模块的文件：代谢组学数据文件 (i)、两个途径文件 (ii) 和两个差异表达基因 (DEG) 文件 (iii)。（B）拖放代谢组学和途径文件 (Bi、B.ii)；使用眼睛按钮(B.iii) 快速可视化 DEG 文件；识别基因符号列 (左下) 和数字数据列 (右下)。（C）定义第一个比较：拖放 T0 DEG 文件 (C，上方)。在下拉菜单中，选择 B.iii 中看到的列和时间点 T0（从元数据中读取）（C，中间）。按照指示设置条件框 (C，下方)。（D）定义第二个比较：单击插入解除管制设置按钮打开字段；拖放 T48 DEG 文件，选择时间点 T48，并设置其余字段，如 C 所示。（E）设置隔间（上），设置统计参数，如图所示（中间，下），然后运行。（F）结果可下载；每个代谢图都生成为独立图形，以及全局图例。下载的图形是使用外部图形软件（Inkscape）排列的（F）。请注意，“转录本”和“基因”是代谢图的可互换术语。

2. 从 A 部分的 Zenodo 下载 ( https://zenodo.org/records/13741706 ) 中，找到两个包含代谢途径数据的文件和两个差异表达基因 (DEG) 文件。这四个文件位于子文件夹 metabologram_data/ 中。将文件上传到您的 Galaxy 会话，如图 4A.ii 和 4A.iii 所示。

3. 确保所有活动文件如图 4A 所示。将文件拖放到各自的字段，如图 4B、4C 和 4D 所示。

4. 设置输出中显示的比较结果（图 4C 和 4D），并配置全局参数（图 4E）。运行该工具。

5. 完成后，下载结果（图 4F）。

协议验证

该方案在我们之前发表的两篇论文中得到了验证。第一篇论文探讨了乳酸脱氢酶在胶质母细胞瘤代谢可塑性中的作用 [2]，分析结果如图 4C 和附录图 S4 所示。第二篇论文展示了 DIMet 工具在真实示踪物代谢组学数据集中的应用，包括来自胶质母细胞瘤对照培养物的时间序列数据集 [6]。

一般说明和故障排除

一般说明

要了解如何创建和组织您自己的数据分析文件（例如样本元数据、通路列表、DEG 文件等），请参阅 DIMet Galaxy 模块中的“帮助”菜单。在那里，您将找到有关每种输入类型的预期内容和文件组织的详细指导。

1. 我们使用标准流程 [2] 处理大量 RNA-seq 数据。简而言之，在预处理和映射 fastq 文件后，对生成的原始计数矩阵进行差异表达分析，以获得差异表达基因 (DEG) 集。

2. 主成分分析也可以使用 Galaxy 中的dimet pca 分析模块生成数值结果（即表格）。用法与dimet pca 图相同。

3. 有关提供的统计测试和多种测试校正方法的更多详细信息，请参阅我们之前出版物 [6] 的补充材料第 S3 节。

4. 代谢物的标记谱是指其所有同位素体的集合，按标记（碳）原子数排序并以比例表示。该谱也称为 MDV（质量同位素分布矢量）[4]。

补充信息

以下支持信息可在此处下载：

1. 文件 S1. 与 Galaxy 一般用法相关的补充信息

致谢

这项工作由法国国家癌症研究所 (INCA) 的 PLBIO 2021“癌症生物学和科学” [N 221284] 资助。该方案首次由 Guyon 等人 [2] 和 Galvis 等人 [6] 描述和验证。

利益冲突

不存在利益冲突或利益竞争。

伦理考量

P3 细胞来源于患者供体样本；地区伦理委员会批准在挪威卑尔根 Haukeland 大学医院收集活检组织（REK 013.09）。

参考

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Guyon, J., Fernandez‐Moncada, I., Larrieu, CM, Bouchez, CL, Pagano Zottola, AC, Galvis, J., Chouleur, T., Burban, A., Joseph, K., Ravi, VM, et al. (2022).乳酸脱氢酶通过代谢共生促进胶质母细胞瘤的生长和侵袭。EMBO Mol Med. 14(12): e202115343。
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