材料和试剂

生物材料

1. COS7 细胞（ATCC，CRL-1651）

试剂

1. Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Gibco，目录号：11965-092），储存于4°C

胎牛血清（FBS）（Gibco，目录号：10091148），储存于-20°C

3.青霉素/链霉素溶液（Gibco，目录号：15140122），储存于-20°C

4.胰蛋白酶-EDTA溶液（Gibco，目录号：25200056），储存于-20°C

5. Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（Gibco，目录号：11965-092），储存于 4°C

6. HBmito Crimson，200 μM DMSO 溶液，储存于-20 °C

本文中的染料可根据文献[11]合成、纯化，或从MedChemExpress购买（目录号：HY-D2346）。

7. DMSO（分析试剂级）（Aladdin，目录号：D103272），室温保存

8.浸油（奥林巴斯，产品编号：IMMOIL-F30CC）

解决方案

1. 完成 COS7 细胞培养基（见配方）

2. HBmito Crimson 溶液（参见配方）

3. HBmito Crimson DMSO 溶液（见配方）

食谱

1. 完整的COS7细胞培养基

试剂	最终浓度	数量
培养基	无	44.5 毫升
胎牛血清	10％	5 毫升
青霉素/链霉素溶液	1％	0.5 毫升
全部的	无	50 毫升

该溶液应在4°C下保存并在一个月内使用。每次使用时都要确保其无菌。FBS应通过0.2μm滤膜过滤。

2. HBmito Crimson 解决方案

试剂	最终浓度	数量
HBmito 深红，200 μM	500 纳米	2 微升
COS7细胞培养基	无	最多 1 毫升
全部的	无	1 毫升

每次使用前准备好溶液。

3. HBmito Crimson DMSO 溶液

试剂	最终浓度	数量
HBmito 深红色，5 mM	5 μM	1 微升
二甲基亚砜	无	最多 1 毫升
全部的	无	1 毫升

每次使用前准备好溶液。

实验室用品

1. 无菌 1.5 mL 聚丙烯离心管（任何供应商）

2. 无菌 50 mL 聚丙烯离心管（任何供应商）

3. 无菌无核酸酶过滤吸头（10、200 和 1000 μL）（任何供应商）

4.35毫米玻璃底盘，170μm±5μm（标准成像，目录号：STGBD-035-1; Cellvis，目录号：C35-20-1.5H）

5. 移液器吸头，无菌（任何供应商）

6. 细胞培养瓶，通风瓶表面积 25 cm2 ^（任何供应商）

7. 移液器（Eppendorf Research ^® plus），容量范围为 0.5–10 μL、10–100 μL 和 100–1000 μL

8.0.2μm滤膜（Millex-GP，目录号：SLGPR33RB）

设备

1. Abberior Facility Line（Abberior Instruments GmbH，德国），配备 60× 油浸物镜（NA 1.42，Olympus，日本）

2. 常见实验室设备：细胞培养箱、安全柜、-20°C 冰柜、冰箱（任何供应商）

3.显微镜培养箱（OKOlab，型号：H301-T-UNIT-BL-PLUS）

软件和数据集

1.阿贝里奥督察 (16.3.14280)

2.惠更斯SVI（23.10）

3. ImageJ Fiji，版本 2.1.0。带有 Java 1.8.0_172

4. 《起源》（2019b）

程序

A. STED饱和功率测量

STED 饱和功率是指有效耗尽染料分子荧光所需的激光功率。饱和功率低的染料可提高 STED 成像的整体质量，尤其是在高分辨率、长期实验中。因此，饱和功率是确定染料是否适合高分辨率成像的关键参数。此外，测量饱和功率有助于估计成像所需的最佳耗尽激光强度，例如在 C 部分中设置 HBmito Crimson 的耗尽功率。STED 显微镜的分辨率可以用以下公式描述：

$d \approx \frac{λ}{2 否。一个。 \sqrt{1 + \frac{我_{年代电视埃德}}{我_{s 一个吨}}}}$

λ为激发波长，NA为显微物镜的数值孔径，I _STED为耗尽激光的强度，I _sat为荧光团的饱和强度。从公式中可以看出，当I _STED一定时，降低饱和功率I _sat ， I _STED /I _sat就会增大，从而获得更高的分辨率。因此，低饱和功率的探针可以在较低的激光功率下获得较高的分辨率，从而有效降低光漂白和光毒性。

1. 将 1 mL HBmito Crimson DMSO 溶液加入 35 mm 玻璃底盘中。

2. 在商用 STED 系统的背景界面中将空间光调制器 (775 nm) 模式设置为“无”，将环形分布的耗尽光束转换为高斯分布。将激发强度设置为 3%，可根据染料亮度进行校准。将激发强度调整为 3%，根据染料亮度进行校准。逐渐将耗尽激光强度从 0% 增加，增量为 1%–3%（约 2–5 mW），例如 0%、2%、4% 等，直至 50%。在每个耗尽激光强度级别，捕获两张图像 - 一张在激发激光打开的情况下，一张在激发激光关闭的情况下。记录每张图像的平均荧光强度。

3. 对于每个耗尽激光功率，从激发开启图像的平均荧光强度中减去激发关闭图像的平均荧光强度。绘制归一化荧光强度与耗尽激光强度的关系图。将数据拟合成曲线，并确定荧光强度降至其初始值的 50% 的点。此时相应的耗尽激光强度即为染料的饱和功率。

注意：在每个激光强度下重复成像和记录多次，以确保数据的准确性和可靠性。监测样品的光漂白，以防止过度激发造成的损坏，并根据需要调整激光设置，以最大限度地减少光漂白。

B. 样品制备

1. 在我们的研究中，COS7 细胞在装有 COS7 培养基的细胞培养瓶中培养。细胞在 37 °C 含 5% CO ₂的湿润环境中培养2-3 天。

2. 当细胞密度达到80%时，弃去原COS7培养基，用3 mL PBS清洗细胞，以除去残留培养基。加入1 mL胰蛋白酶-EDTA溶液消化3分钟。消化完成后，加入1 mL COS7细胞培养基终止消化过程。

3. 将消化的细胞以 200× g离心3 分钟，收集细胞沉淀。

4. 将约 6 × 10 ⁴ –9 × 10 ^{4 个}细胞接种到 35 mm 玻璃底培养皿中。为获得最佳成像效果，请确保接种后细胞分布均匀且不会过于拥挤。

5. 让细胞在培养箱中生长 24 小时。汇合度在 40%–80% 之间是后续标记和成像步骤的理想选择。如果需要清洗细胞，最佳成像时间是清洗后 1 小时内。

6. 弃去原培养基，加入1 mL HBmito Crimson 溶液，37 °C、5% CO ₂环境下孵育10 min，无需清洗，直接进行STED 成像，根据具体实验要求进行相应调整。

注意：准备用于成像的细胞时，必须考虑几个关键因素：

细胞密度：保持适当的细胞密度（40%-80%），保证细胞健康，同时为单细胞成像提供足够的空间。细胞密度过高可能导致细胞聚集，对图像质量产生不利影响。

培养基选择：针对不同的细胞系选择合适的基础培养基和血清，以保证最佳的生长条件。

污染控制：细胞必须不受任何污染，以确保可靠的成像结果。培养基中加入抗生素有助于防止污染。

C. 图像采集

该协议专门设计用于 Abberior Facility Line，但该方法也可以适用于其他 STED 显微镜。

使用荧光团获取活细胞成像时，选择合适的波长范围至关重要。最佳激发功率、耗尽激光功率、像素大小、线累积和停留时间应根据经验确定，以最大限度地提高信噪比 (SNR)，同时最大限度地减少光漂白，尤其是在长时间延时成像期间。我们还建议将细胞放置在视野 (FOV) 的中心，因为 FOV 中心的成像质量最好。

激发功率：根据染料特性和实验要求选择合适的激发波长。对于 HBmito Crimson，使用 640 nm 的激发波长。从低激发强度（1%–5%）开始，然后以 1%–3% 的增量逐渐增加激发强度。根据图像中观察到的信号强度确定合适的激发功率值。注意避免过度激发，这会导致样品光漂白并防止信号过饱和。

耗尽激光功率：选择合适的耗尽波长。对于 HBmito Crimson，使用 775 nm 的 STED 耗尽激光波长。从 15%–20%（约 20–30 mW）的耗尽激光功率开始，然后以 1%–3%（约 2–5 mW）的增量逐渐增加强度。根据图像中观察到的分辨率和 SNR 调整耗尽光强度。

像素大小：在 STED 显微镜中，设置合适的像素大小对于满足奈奎斯特采样定理并确保获取的图像准确反映样品的细节和分辨率至关重要。像素大小应至少为分辨率的 1/2，即像素大小 ≤ d/2。

停留时间：停留时间决定每个像素的曝光时间，从而影响图像的信噪比和分辨率。对于大多数样本，停留时间的设置通常在 1 到 10 μs 之间。此范围可确保图像保持足够的信噪比。如果样本信号相对较弱，则可以将曝光时间增加到 10-20 μs，以增强每个像素的信号收集。较长的停留时间将提高信噪比，但也会增加整体成像时间和光漂白的风险。

线积累：线积累的设置影响图像的信噪比和分辨率。对于常见样本，默认的线积累一般设置在2-4倍之间，这个范围在显著提升信噪比的同时，避免过度曝光导致光漂白。如果信噪比较弱，可以增加线积累的次数，保证样本在采集过程中保持稳定不动，不会因为采集时间延长而发生偏移。对于不稳定的样本，建议减少线积累的次数。对于需要高分辨率和高信噪比的实验，可以考虑将线积累设置为较高的值（如8次或更高）。相反，对于快速成像的需求或容易发生光漂白的样本，可以选择较低的线积累（如1-2倍），以减少光漂白，减少成像时间。

为了确定最佳成像参数，我们建议使用控制变量法，系统地每次改变一个参数以观察其对图像质量的影响。这种方法可以实现最佳图像质量和最高分辨率。

1. 打开显微镜系统电源，确保软件和硬件之间正确通信，并打开 Abberior Facility Line 软件。

2.选择63×油浸物镜，并在镜头上涂上浸油。

3. 将标准珠样品放在样品架上，打开软件，选择对准功能，等待系统对话框显示“对准成功”消息，表示程序已完成。确保激发和耗尽激光器均已正确对准。

4. 将活细胞培养箱连接到显微镜系统。一旦培养箱中的环境条件稳定在 37 °C、5% CO ₂和 75% 湿度，添加准备好的样本。

5. 使用显微镜的自动对焦功能定位样品的焦平面。Abberior 自动对焦功能可主动稳定样品的 Z 位置，并连续进行 Z 漂移补偿，确保共聚焦和 STED 成像期间不会发生焦点漂移。

6. 在共焦模式下确定合适的成像区域。

7. 相应调整成像参数。

如图 2 所示，λ _Ex 640 nm：15.7 μW；λ _Dep 775 nm：71.2 mW；像素大小：20 nm；线累积：3；停留时间：6.5 μs；ROI：44.5 μm × 50.74 μm；检测波长：650~750 nm。

图 2. HBmito Crimson 标记的活体 COS7 细胞线粒体的共聚焦和 STED 成像结果比较。原始图像中的比例尺为 5 μm。放大图像中的比例尺为 1 μm。

8. 获取 STED 图像，确保同时收集共聚焦和 STED 图像。

9. 对于长时间成像，可根据经验适当降低激发功率、耗尽功率、线积累和驻留时间。耗尽激光强度可降低至单帧成像的一半左右，以满足成像要求。设置时间间隔和成像帧数，然后采集图像。

如图 3 所示，λ _Ex 640 nm：12.75 μW；λ _Dep 775 nm：34.7 mW；像素大小：25 nm；线累积：3；停留时间：5 μs；帧时间：8.22 s；ROI：4.75 μm × 7.025 μm；检测波长：650~750 nm。

图 3. 用 HBmito Crimson 标记的 COS7 细胞中的线粒体的长期成像；白色箭头表示融合事件。比例尺：1 μm。

注意：确定长期成像参数时，请确保最低必要的激光强度和曝光时间以仅实现所需的分辨率。对于线粒体嵴成像，最低分辨率要求定义为在给定功率水平下清晰显示嵴结构。通过利用这些优化设置，长期成像可以最大限度地减少光漂白效应，从而获取更多帧并延长成像时间。

10.保存数据。

D.扩展图像处理

使用 Huygens 软件直接处理单帧图像，分别设置每个通道的后处理参数。对于长期成像，建议先进行强度校正，然后在 Huygens 软件中进行批量反卷积。

1. 打开Huygens Professional软件，选择File > Open，导入需要反卷积的图像文件。

2. 在主窗口中选择图像以访问图像属性。此选项位于“编辑”菜单下，或右键单击图像并选择“属性”。相应地设置显微镜参数：

物镜：输入用于获取图像的物镜的数值孔径 (NA) 和放大倍数。

激发波长 ( λ _Ex )：指定成像期间使用的激发波长。

发射波长（λEm ）：输入荧光通道_对应的发射波长。

体素大小：输入图像采集期间使用的像素大小（在 x、y 和 z 维度上）。

折射率：输入所用浸入介质（例如油、水、甘油）的折射率。

针孔半径：如果使用共聚焦显微镜，请指定针孔半径或尺寸。

3. 选择点扩展函数 (PSF)：在“恢复”菜单中，选择PSF选项。如果软件没有自动检测到 PSF，您可以手动选择或加载适当的 PSF 文件。从“恢复”菜单中选择“反卷积向导”。反卷积通常使用经典的最大似然估计 (CMLE) 算法执行，其中软件会自动计算 SNR 和背景等参数。这些默认设置经过优化，可以处理大多数图像。但是，可以手动调整迭代次数、SNR 和背景等参数以增强图像质量，尤其是对于更复杂或低 SNR 图像。

4. 单击运行按钮开始反卷积处理。

5. 处理后，使用软件的可视化工具查看解卷积后的图像。

6. 从文件菜单中选择另存为，保存已处理的图像。以常见格式（如 TIFF、JPEG 或其他可用格式）保存图像。

7.使用批处理器工具对多个图像文件进行批量反卷积处理，设置好批处理参数和文件路径后，点击开始批处理按钮开始处理。

数据分析

STED 图像的分辨率是根据线粒体结构的半峰全宽 (FWHM) 进行分析的。该分析提供了系统分辨率的定量测量，使我们能够准确评估成像过程中实现的空间分辨率。

1. 启动 ImageJ 软件并通过选择文件>打开来打开所需的图像。

2. 复制需要分析的图像区域，使用ImageJ 中的直线功能选择该区域内的多个嵴，如图 4 所示，并按照箭头指示的方向在指定位置生成信号强度分布图。

图 4. 放大的 STED 和 STED+ 结果和荧光信号强度分布与白色箭头相对应。比例尺：1 μm。结果使用商业反卷积软件 Huygens（SVI，荷兰）进行处理。

3. 利用ImageJ 中的Analyze > Plot Profile功能获取信号强度分布。单击List打开强度值，然后将这些值复制到 Origin 软件中。

4. 在 Origin 中，应用高斯拟合得出高斯拟合曲线，如图 5 所示。

5. 根据高斯拟合计算标准差 (σ)。使用公式 FWHM = 2.355 × σ 确定图像的 FWHM。

图 5. STED 和 STED+ 结果以及拟合的荧光信号强度分布与白色箭头相对应。比例尺：1 μm。

协议验证

该协议或其部分内容已在以下研究文章中使用和验证：

Ren 等 [11]。利用低饱和功率探针通过 STED 纳米显微镜对嵴和线粒体 DNA 相互作用进行可视化。（图 2-6）。

一般说明和故障排除

一般说明

1. 染料浓度需谨慎优化，不能太高也不能太低。HBmito Crimson 建议染料浓度为 500 nM，染色时间为 10 min。可根据具体实验要求进行调整。

2. 根据具体染料选择合适的激光波长进行激发。

3. 校准 STED 系统的激发和耗尽激光器，以实现最佳 STED 性能。

4. 保持稳定的实验室温度和湿度对于避免环境波动影响显微镜性能至关重要。

故障排除

问题 1：STED 成像中的运动伪影

可能的原因：样本抖动或线粒体运动。

解决方案：确保样本在成像过程中保持稳定和静止至关重要。在活细胞成像中，成像速度慢会导致线粒体运动，从而产生运动伪影。成像速度受像素停留时间和线累积的限制。因此，在确保足够的荧光信号收集的同时，尽量减少线累积和停留时间非常重要。此外，减少 FOV 有助于提高成像速度并减少线粒体运动的影响。

问题 2：STED 图像分辨率不足

可能的原因：STED 光路对准不正确或参数设置不理想。

解决方法：确保系统正确校准。校准后对标准40nm珠子进行成像。对单个珠子的信号强度进行高斯拟合，得到其FWHM。如果FWHM达到40nm，则系统状态良好。在样本成像过程中，参数设置不当会导致分辨率不足。参考流程中的参数设置建议。调整参数时，避免对同一FOV进行多次成像，以最大程度地减少光漂白效应。

致谢

该方案与以下论文相关：Ren 等人。使用低饱和功率探针通过 STED 纳米显微镜可视化嵴和线粒体 DNA 相互作用。DOI：10.1038/s41377-024-01463-9。这项工作得到了国家重点研发计划（2022YFC3401100）、国家自然科学基金（22177024、62025501、31971376、92150301）和中央地方科技发展引导基金（246Z1302G）的支持。我们感谢北京大学国家蛋白质科学中心对 STED 超分辨率成像的帮助。我们感谢 Abberior China 和 Optofem Technology Limited 提供 Facility Line STED 和 Huygens 软件。

利益冲突

BG 是 HBmito Crimson 获奖专利（ZL202011401937.1）的发明人。其他作者声明没有利益冲突。

伦理考量

该协议不涉及任何道德方面的考虑。

参考

Spinelli, JB 和 Haigis, MC (2018)。线粒体对细胞代谢的多方面贡献。Nat Cell Biol. 20(7): 745–754。https ://doi.org/10.1038/s41556-018-0124-1
Tan, JX 和 Finkel, T. (2020)。线粒体作为健康和疾病中的细胞内信号传导平台。J Cell Biol. 219(5): e202002179。https: //doi.org/10.1083/jcb.202002179
Rizzuto, R.、De Stefani, D.、Raffaello, A. 和 Mammucari, C. (2012)。线粒体作为钙信号的传感器和调节器。Nat Rev Mol Cell Biol。13 (9): 566–578。https: //doi.org/10.1038/nrm3412
Lill, R., Hoffmann, B., Molik, S., Pierik, AJ, Rietzschel, N., Stehling, O., Uzarska, MA, Webert, H., Wilbrecht, C., 和 Mühlenhoff, U. (2012)。线粒体在细胞铁硫蛋白生物合成和铁代谢中的作用。Biochim Biophys Acta。1823 (9): 1491–1508。https ://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2012.05.009
Friedman, JR 和 Nunnari, J. (2014)。线粒体的形态和功能。《自然》。505 (7483): 335–343。https: //doi.org/10.1038/nature12985
Baker, N.、Patel, J. 和 Khacho, M. (2019)。线粒体动力学、嵴重塑和超复合物形成之间的联系：线粒体结构如何调节生物能量学。线粒体。49：259–268。https: //doi.org/10.1016/j.mito.2019.06.003
Cogliati, S.、Enriquez, JA 和 Scorrano, L. (2016)。线粒体嵴：美丽与功能的交汇点。Trends Biochem Sci. 41(3): 261–273。https: //doi.org/10.1016/j.tibs.2016.01.001
Kondadi, AK, Anand, R. 和 Reichert, AS (2020)。Cristae 膜动力学 - 范式转变。Trends Cell Biol. 30(12): 923–936。https: //doi.org/10.1016/j.tcb.2020.08.008
Liu, T., Stephan, T., Chen, P., Keller-Findeisen, J., Chen, J., Riedel, D., Yang, Z., Jakobs, S. 和 Chen, Z. (2022)。利用温和的内膜染色对线粒体进行多色活细胞 STED 纳米显微成像。美国国家科学院院刊。119 (52): e2215799119。https: //doi.org/10.1073/pnas.2215799119
Stephan, T., Roesch, A., Riedel, D. 和 Jakobs, S. (2019)。线粒体嵴的活细胞 STED 纳米显微镜。Sci Rep. 9(1): e1038/s41598–019–48838–2。https ://doi.org/10.1038/s41598-019-48838-2
Ren, W., Ge, X., Li, M., Sun, J., Li, S., Gao, S., Shan, C., Gao, B. 和 Xi, P. (2024)。使用低饱和功率探针通过 STED 纳米显微镜可视化嵴和线粒体 DNA 相互作用。Light Sci Appl . 13 (1): 116。https ://doi.org/10.1038/s41377-024-01463-9