材料和试剂

试剂

纯化的 DisA 蛋白（来源：M. smegmatis）
ATP（Sigma，目录号：A2383）
C-di-AMP（Jena Bioscience，目录号：NU-954S）
Tris 碱（Sigma，目录号：10708976001）
EDTA（Sigma，目录号：E4884）
氯化钠（NaCl）（Sigma，目录号：S9888）
四丁基硫酸氢铵（Sigma，目录号：15583）
甲醇（HPLC 级）（Sigma，目录号：34860）
双蒸水（Milli-Q 超纯水系统）
KH ₂ PO ₄（Sigma，目录号：P5655）
MgCl ₂（Sigma，目录号：M8266）
Tris-Cl（Sigma，目录号：10812846001）
Luria Bertani Broth，Miller（HIMEDIA，目录号：M1245）
IPTG（Sigma，目录号 I6758）

实验室用品

透析膜（Sigma，目录号：D9527）
移液器吸头（Tarsons，目录号：521000、521010、521020）
1.5 mL反应管（Tarsons，目录号：500010）
膜过滤器，0.22 μm 孔径（Merck，目录号：GSWP04700）

解决方案

蛋白质纯化缓冲液：裂解缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液（参见配方）
DisA 透析缓冲液（缓冲液 A）（参见配方）
尺寸排阻色谱法 (SEC)（缓冲液 B）（参见配方）
用于 c-di-AMP 合成反应的缓冲液 C（参见配方）
缓冲液 D（参见配方）
缓冲液 E（参见配方）

食谱

蛋白质纯化缓冲液

裂解缓冲液

50 mM Tris-Cl (pH 7.9)、300 mM NaCl 和 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)

洗涤缓冲液

50 mM Tris-Cl (pH 7.9)、300 mM NaCl 和 40 mM 咪唑

洗脱缓冲液

50 mM Tris-Cl (pH 7.9)、300 mM NaCl 和 300 mM 咪唑
DisA 透析缓冲液（缓冲液 A）

50 mM Tris-Cl 缓冲液（pH 7.5）、300 mM NaCl
尺寸排阻色谱法 (SEC)（缓冲液 B）

50 mM Tris-Cl（pH 7.9）、300 mM NaCl
用于 c-di-AMP 合成反应的缓冲液 C

50 mM Tris（pH 9.4）、300 mM NaCl
缓冲液D

100 mM KHPO、4 mM 四丁基硫酸氢铵，pH 5.9
缓冲液 E

75% (v/v) 缓冲液 D，25% (v/v) 甲醇

设备

不同容量的微量移液器（T-2、T-10、T-20、T-100、T-200、T-1000）（Tarsons，目录号：030000、030010、030020、030030、030040、03005）
分光光度计（Eppendorf，型号：^{BioSpectrometer®}）
HPLC 系统：Agilent 1200 HPLC（Agilent Technologies，型号：Agilent 1200 HPLC），配备四元泵、自动进样器、恒温柱箱，配有紫外检测器
AKTA（Cytiva，前 GE 医疗保健，型号：29707638）
C-18 色谱柱（4.6 × 150 毫米）（安捷伦，型号：Eclipse XDB-C-18）
Superose 12 10/300 柱（Cytiva，目录号：GE17-5173-01）
干浴（Bio-Rad，目录号：1660563）
冷冻离心机（Eppendorf，型号：离心机 5430）
涡旋振荡器（Tarsons，型号：SPINIX ^TM）
生物安全柜（Thermo Scientific，型号：1300系列II级，A2型）
真空泵及组件（Tarsons，型号：ROCKYVAC ^TM真空泵及组件）
水净化系统（Millipore，型号：超纯水净化系统）

软件和数据集

HPLC 系统软件 LC/CE Agilent ChemStation（B.04.02 SP1，4/2010）
Graph Pad Prism 5.01（5.01，9/2007）

程序

结核分枝杆菌DisA 蛋白的纯化及 C-di-AMP 合成测定
1. 按照 Gautam 等人 [12] 的方法纯化 DisA 蛋白。蛋白质纯化步骤简要介绍如下。
2. 将携带有disA基因的 pET28a 质粒的大肠杆菌BL21 (DE3)接种于 LB 培养基中, 37°C 下过夜生长。接种 1% 的原代培养物制备二次培养物, 并在 37°C 下摇动生长, 直至 OD 达到 0.6。
3. 通过添加 1 mM 异丙基 β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 来诱导次级培养物，并在 37 °C 下孵育 3 小时。
4. 通过 495× g离心收获培养物；然后将沉淀物重新悬浮在裂解缓冲液 [50 mM Tris-Cl (pH 7.9)、300 mM NaCl 和 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)] 中。
5. 对细胞进行超声处理并以 1980× g 的速度离心以去除细胞碎片。
6. 将上清液装入 Ni-NTA 柱上，使蛋白质与 Ni-NTA 珠子结合。
7. 用 100 倍柱体积的洗涤缓冲液（50 mM Tris-Cl（pH 7.9）、300 mM NaCl 和 40 mM 咪唑）清洗柱子。
8. 使用含有 50 mM Tris-Cl (pH 7.9)、300 mM NaCl 和 300 mM 咪唑的洗脱缓冲液洗脱 DisA 蛋白。通过 10% SDS-PAGE 分析蛋白质。
9. 按照所述方案 [12]，将纯化的 DisA 蛋白在缓冲液 A（参见配方）中在 4 °C 下透析 12-16 小时。
10. 将透析后的蛋白质注入尺寸排阻层析（SEC）柱中，以进一步利用缓冲液 B 纯化蛋白质（参见配方）。
11. 将纯化的蛋白质储存在-20°C 或-80°C 以供将来使用。
12. 确定 DisA 蛋白的浓度（280 nm/BCA 方法的光度测量）。
13. 计算在 50 μL 反应中达到 1 μM 浓度所需的 DisA 蛋白量。
14. 在 1.5 mL Eppendorf 管中，设置 50 μL 反应体系，其中包含缓冲液 C 中的 DisA 蛋白（1 μM）、0.5 mM ATP、5 mM MgCl（参见配方）。
15. 将反应物在 37°C 下孵育 4 小时。
16. 向反应管中添加 10 mM EDTA 来停止反应。
17. 将反应样品在 4 °C 下以 1,530× g离心30 分钟。
18. 收集上清液进行 HPLC 分析或储存在 -20°C 以备将来使用（图 1）。
  
  图 1. 核苷酸的 HPLC 谱图和 c-di-AMP 的标准曲线。A . 标准 ATP 的 HPLC 谱图。B. 标准 C-di-AMP 的 HPLC 谱图。C. C-di-AMP 合成反应的 HPLC 谱图。D. c-di-AMP 的标准曲线。
c-di-AMP 标准曲线的生成
1. 在缓冲液 C 中制备不同浓度的 c-di-AMP 或 ATP（范围从 100 到 500 μM）原液（参见配方）。
2. 使用反相 C-18 柱，使用缓冲液 D（参见配方）和缓冲液 E（参见配方）分离核苷酸。
3. 使用 0.22 μm 滤纸对 HPLC 缓冲液 D 和 E 进行过滤和脱气。
4. 应用以下缓冲液梯度以 0.7 mL/min 的流速分离核苷酸：
  
  0.0 分钟：0% 缓冲液 E
  
  2.5 分钟：0% 缓冲液 E
  
  5.0 分钟：30% 缓冲液 E
  
  10.0 分钟：60% 缓冲液 E
  
  14.0 分钟：100% 缓冲液 E
  
  21.0 分钟：100% 缓冲液 E
  
  22.0 分钟：50% 缓冲液 E
  
  23.0 分钟：0% 缓冲液 E
5. 分别注入 20 μL 500 μM 纯 c-di-AMP 和 ATP 进行 HPLC 分析。
6. 每次进样后，用缓冲液 D 以 0.7 mL/min 的流速清洗 HPLC 柱 10 分钟。
7. 纯 c-di-AMP 应在 ~23.7 分钟时出现峰值，而 ATP 应在 ~17.4 分钟时出现峰值。
8. 经过初步验证后，将 20 μL 不同浓度（100-500 μM）的 c-di-AMP 注入 HPLC，并使用之前所述的梯度和缓冲液进行分析。
9. 使用色谱数据系统软件获取峰面积。
10. 通过绘制曲线下峰面积 (AUC) 与所用 c-di-AMP 浓度的关系来准备标准曲线。
HPLC 分析 C-di-AMP 合成测定反应
1. 取20 μL反应样品进行HPLC分析。
2. 使用上面描述的梯度将反应样品注入 HPLC 系统。
3. 观察约~23.7 分钟处的峰值。
4. 如果在 ~23.7 分钟处观察到峰值，则使用色谱数据系统软件确定峰下的面积。
5. 利用峰面积应用标准曲线和线性方程确定反应中形成的 c-di-AMP 的浓度 (μM)。
6. 收集 23.7 分钟左右的 HPLC 洗脱级分，以进一步确认反应产物的质量（见一般注释 2）。

一般说明和故障排除

DisA（一种含 DAC 结构域的蛋白质）合成 c-di-AMP 在很大程度上取决于检测条件，如缓冲液成分（NaCl/KCl）、pH（5.4–9.4）、温度（35–40 °C）和孵育时间（0–6 小时）。对于Mycobacterium smegmatis，在缓冲液 C（50 mM Tris、300 mM NaCl、pH 9.4）中观察到最高活性。在 37 °C 下孵育 4 小时后，观察到 ATP 完全利用。当使用来自不同来源的 DisA 时，可能需要进行活性优化以避免出现多个峰（例如 ATP 或中间产物）。
我们采用之前报道的 LC-MS 法分析 DisA 反应（德国 Burker Daltonics）的 HPLC 洗脱级分，如 [14] 所述。对洗脱分子量进行 MS-MS 分析（负离子或正离子模式），以验证 c-di-AMP 的存在。标准方案包括使用 HPLC 梯度组合物进行 LC-MS 和 MS-MS 分析，如之前报道的 [15]。

协议验证

该协议或其部分内容已在以下研究文章中使用和验证：

Ryjenkov DA 等人。[10]。环二鸟苷酸是细菌中普遍存在的信号分子：对 GGDEF 蛋白结构域生物化学的见解。J Bacteriol。 [图 2B，图 3B、C，用于 c-di-GMP 分析]。
Christen M 等人。[11]。环状二-GMP 特异性磷酸二酯酶的鉴定和表征及其受 GTP 的变构控制。J Biol Chem。 [图 2A，用于 c-di-GMP 分析]。

Bai Y 等。[13]。结核分枝杆菌 Rv3586 (DacA) 是一种二腺苷酸环化酶，可将 ATP 或 ADP 转化为 c-di-AMP。PLoS One。[图 2A，用于 C-di-AMP 分析]

利益冲突

作者声明不存在利益竞争。

致谢

DC 非常感谢印度政府生物技术部通过拨款提供的初始资金帮助，拨款编号为 DBT/PR33123/MED/29/1497/2020。

参考

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