材料和试剂

下表提供了我们实验室中经常使用的材料和设备的示例。类似规格的试剂和设备也可以使用。

1. 聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白cellware 12 mm圆形盖玻片（康宁，目录号：354087）

2. 无菌巴斯德玻璃移液管（Thomas Scientific，目录号：1215D99）

3. 24井盘（康宁，目录号：3524）

4. 35mm TC处理培养皿（康宁，目录号：353001）

5. 100 mm TC处理培养皿（康宁，目录号：430167）

6. SD100-4号一次性玻片

7. 50毫升锥形管（康宁，产品编号：430828）

8. 15ml锥形管（康宁，产品编号：430790）

9. InvitrolonTM PVDF/滤纸三明治（用于微型凝胶）（赛默飞世尔科学公司，目录号：LC2005）

10. E17.5/E18.5小鼠胚胎

11. 神经基础培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：21103-049）

12. B27增补件（赛默飞世尔科技公司，目录号：17504-044）

13. 杜尔贝科改良高糖鹰牌培养基（DMEM）（赛默飞世尔科技公司，目录号：11965-092）

注：此DMEM配方包含4500 mg/L葡萄糖、L-谷氨酰胺和酚红。

14. 蒸馏水（赛默飞世尔科技公司，目录号：15230-162）

15. 聚-D-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P6407）

16. 胎牛血清（非热灭活）（Omega Scientific，目录号：FB-01；或其他品牌FBS）

17. 0.25%胰蛋白酶EDTA（Thermo Fisher Scientific，目录号：25200-056）

18. 青霉素/链霉素（P/S）10000 U/ml（100倍浓缩）（赛默飞世尔科技公司，目录号：15140-122）

19. 杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（赛默飞世尔科技公司，目录号：14190-144）

20. 台盼蓝（Sigma-Aldrich，目录号：93595）

21. 阿糖胞苷（Ara-C）（Sigma-Aldrich，目录号：C6645）

注：储备液在浓度为50mg/ml的水中重新配制，等分并储存在-20°C。

22. 抗微管蛋白-β-III抗体（小鼠单克隆）（Covence，目录号：MMS-435P）

23. 抗GFAP抗体（兔多克隆）（安捷伦（Dako），目录号：Z0334）

24. 阿历克斯抗-21G抗-21G抗-21G抗阿历克斯兔抗-48L二级抗体目录

25. Alexa FluorTM 647驴抗鼠IgG（H+L）二级抗体（Thermo Fisher Scientific，目录号：A-31571）

26. DAPI（英维特罗根，目录号：D1306）

27. 多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）

28. TritonTM-X100（Sigma-Aldrich，目录号：T8532）

29. 驴血清（Sigma-Aldrich，目录号：S30-100ML）

30. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A9647）

31. 荧光安装介质（Dako，目录号：S3023）

32. 乙醇溶液70%

33. 鼠层粘连蛋白，天然（Thermo Fisher Scientific，目录号：23017-015）

34. 样品缓冲液，Laemmli 2x浓缩液（Sigma-Aldrich，目录号：S3401）

35. NuPAGE 4至12%，Bis-Tris，迷你蛋白凝胶（Thermo Fisher Scientific，目录号：NP0321PK2）

36. 吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）

37. 脱脂奶粉（圣克鲁斯生物技术公司，目录号：sc-2324）

38. Super Signal West Dura超长持续时间基板（Thermo Fisher Scientific，目录号：34076）

39. 抗TrkB抗体（milipore，目录号：07-225）

40. 抗Rbfox1抗体克隆1D10（Millipore，目录号：MABE985）

41. 抗Rbfox3（NeuN）抗体（Millipore，目录号：MAB377）

42. 抗鼠IgG，HRP结合物（Millipore，目录号：AP192P）

43. 抗兔IgG，HRP结合物（Millipore，目录号：AP182P）

44. 1毫米Fluo-4二甲基亚砜溶液（赛默飞世尔科学公司，目录号：F14217）

45. PowerLoad浓缩液100x（赛默飞世尔科技公司，目录号：P10020）

46. 水溶性丙磺舒（赛默飞世尔科技公司，目录号：P36400）

设备

1. 解剖罩（NuAire，型号：NU-201-430）

2. 层流罩（NuAire，型号：NU-425-400，II级，A/B3型）

3. 立体显微镜（奥林巴斯，型号：SZH-ILLK）

4. 倒置组织培养显微镜（Nikon，型号：Chipot）

5. 细胞培养二氧化碳培养箱（三洋，型号：MCO-17AIC）

6. 外科剪刀，锋利（精细科学工具，目录号：14002-16）

7. 学生标准型镊子（精细科学工具，目录号：91100-12）

8. 锋利的细剪刀（精细科学工具，目录号：14060-10）

9. Graefe镊子（精细科学工具，目录号：11052-10）

10. Dumont#7镊子（精细科学工具，目录号：11272-30）

11. 细胞计数器（Nexcelom Bioscience，Cellometer Vision）

12. 离心机（Thermo Scientific，型号：CL2）

13. 组织培养罩（NuAire，型号：NU-425-400）

14. 共聚焦显微镜系统（蔡司，型号：LSM780）

15. 本生灯（HanauTM Touch-O-Matic）

16. Branson 1800声波仪（Branson）

17. XCell SureLock微型细胞蛋白质电泳（Thermo Fisher Scientific，目录号：EI0001）

18. GeneGnome XRQ化学发光成像系统（Syngene）

程序

笔记：

a。该方法描述了从E17.5/E18.5小鼠胚胎中产生原代海马神经元所需的关键步骤。每一步之后都包含了实用的提示，以便更好地指导读者完成整个过程。

b。海马神经细胞的最终培养可根据不同的培养基片或玻片进行。

A、用聚-D-赖氨酸涂覆组织培养皿/培养板

1. 将50ml无菌组织培养级水添加到5mgγ射线照射和细胞培养试验的聚-D-赖氨酸瓶（最终工作浓度为0.1mg/ml），在无菌层流罩中重组聚-D-赖氨酸。

2. 在培养皿表面均匀涂上0.1mg/ml聚-D-赖氨酸溶液，室温下在层流罩中培养20分钟。

3. 通过抽吸去除聚-D-赖氨酸溶液，并用无菌组织培养级水彻底冲洗表面两次。

4. 在电镀电池之前，将盘子/盘子置于层流罩下约1小时，使其表面完全干燥。

注：如果玻璃盖玻片上的电镀槽使用商用聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白预涂12 mm盖玻片。用无菌层流罩中的无菌镊子将聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白涂层的盖玻片直接转移到24孔板的孔中，然后再进行神经元电镀。或者，可以通过将12 mm的常规盖玻片放入24个孔板孔中并在层流罩中用0.1 mg/ml聚-D-赖氨酸覆盖20分钟来涂覆。之后，用PBS清洗两次，并用10µg/ml层粘连蛋白溶液在37°C下覆盖至少4小时，方法是将盖片放在培养箱中，直到细胞准备好进行电镀。在电镀细胞前用PBS冲洗两次，以防止培养表面干燥。将1ml PBS加入1mg层粘连蛋白粉末中，用PBS稀释至10µg/ml层粘连蛋白，制成1 mg/ml层粘连蛋白储备液。在盘子里涂上盖玻片可以避免在盘子之间转移时刮掉涂层。

B、处死孕鼠，取出E17.5/E18.5胚胎

1. 根据动物护理和使用委员会（ACUC）批准的方案对怀孕的老鼠实施安乐死（CO2安乐死或异氟醚麻醉，然后砍头或颈椎脱位）。

2. 把动物固定在一个干净的手术区域，用70%的乙醇清洁腹部。

3. 为了暴露胚胎，使用外科剪刀（图1A）在腹部中部进行切口（图1A），从耻骨区开始，一直到腹腔末端，如图2A中虚线所示。

注：用手术剪进行切口时，用镊子（图1B）夹起皮肤层。这将有助于避免直接位于下面的胚胎受到意外伤害。

图1。用于制备海马神经元的解剖仪器。A、方案步骤B3-B6中使用的外科剪刀。B、方案步骤B3-B6和C1中使用的标准型镊子。C、步骤C1中使用的细剪刀。D、在步骤C2-C3中使用的弯曲镊子（抓钳）。E、步骤C4和C5中使用的Dumont镊子。

图2。E17.5/18.5妊娠动物胚胎手术切除的制备。A、用白色虚线显示切口位置的固定动物（步骤B3）；B.腹部切口后子宫暴露（步骤B3）。

4. 用镊子和手术剪刀（图1A-1B）小心地暴露含有胚胎的整个子宫（子宫角）（图2B），并立即将子宫转移到装有冰PBS的100 mm培养皿中（图3A）。

注：用镊子抓住子宫并将其拉出腹部，另一只手用外科剪刀切断任何粘连和宫颈连接（图2B箭头所示）。

5. 继续用镊子和手术剪刀取出单个胚胎，小心地取出胎盘和卵黄袋。将胚胎移入一个新的100毫米的装有冰PBS的培养皿中，以清洗胚胎并除去血液和胚胎液（图3B）。

6. 用镊子（图1B）固定胚胎，用外科剪刀切开头部（图3C）。将头部转移到一个新的100毫米培养皿中，其中含有10%胎牛血清和1%抗生素（P/S）。

注意：从这一步开始，重要的是不断地将生物材料转移到新的含有抗生素的培养基中，以降低污染的可能性。在本方案所示的图中，有意使用PBS代替含有酚红的介质，仅为了获得更清晰的图像（图3A、图4、图5和图6）。

图3。从子宫中分离胚胎。A、分离的胚胎（B5。B步）；分离的胚胎（B5。B步）；分离的胚胎。D、胚胎头部的侧视图。白色虚线表示从头骨后部（黑色剪刀）开始执行步骤C1中所述的横向切割，同时用镊子将胚胎头部固定在鼻子区域（黑色箭头）。

C、海马解剖

1. 移到无菌层流气流的解剖柜中，准备一个100毫米的含有10%胎牛血清和1%抗生素（P/S）的冷冻完整DMEM的培养皿，用于大脑解剖。每次将一个胎头移入含有完整DMEM培养基的100 mm培养皿中，轻轻地从胎头中取出大脑（图4A）。具体来说，用一只手用镊子（图1B）捏住头部的口/鼻区域（图3D中的黑色箭头）。另一只手用细剪刀（图1C）从颅骨后部进入（图3D中为黑色剪刀）并进行横向切割（沿图3D中白色虚线所示嘴/鼻水平的横切面），以释放基底脑区。将胎头倒置，露出大脑的游离基底区。继续用两把镊子（图1B）轻轻地拉开颅骨，小心地取出整个大脑（图4A）。将大脑转移并收集到一个新的100毫米培养皿中，盛有干净的、冰镇的完整DMEM培养基。每次脑切除后更换培养基，排除血液。

2. 一次将一个大脑转移到一个35毫米的盛满冰镇DMEM培养基的皿盖中，然后在解剖立体镜下移动。

注：与35mm培养皿底部相比，使用解剖仪器时，35 mm培养皿盖的较低深度允许更好的移动。

3. 使用两个弯曲镊子（图1D）：用一个镊子（图4A中的白点）将大脑固定在一侧，并沿中线（图4A中的虚线）插入第二个镊子，以分离大脑的两个半球。继续使用弯曲镊子轻轻地分开和翻转大脑的两个半部分，以便暴露和显示海马区（图4B-4C）。

注意：由于胚胎组织的脆弱性和柔软性，在试图解剖海马区时，大脑很容易受到损伤：在处理和握住胚胎脑时要小心。在立体镜上进行几次练习将有助于快速提高解剖技能。

图4。海马体的定位。A、解剖胚胎脑。白色虚线表示用一个弯曲镊子将两个大脑半球分开，同时用第二个弯曲镊子（白点）将大脑保持在一侧（步骤C3）。B、分离的大脑半球。白色箭头表示每个半球海马区的位置（步骤C3）。C、高倍图像显示一个大脑半球的海马区，用白色虚线表示。

4. 小心地从每个大脑半球移除脑膜（图5）。

笔记：

a。使用两个Dumont镊子（图1E）。用一把镊子夹住整个大脑，用第二把镊子轻轻地剥离脑膜。从捏嗅球区开始，逐渐向后拉，以便完全移除脑膜（图5）。在做这个手术的时候，轻轻地握住大脑，根据脑膜脱落的容易程度，可能有必要多次改变控制点。

b。正确地去除脑膜是很重要的，以消除尽可能多的非神经元细胞对神经元培养的贡献。

图5。脑膜切除术。箭头显示海马和皮质区域以及嗅球和脑膜从一个大脑半球移除（步骤C4）。

5. 使用Dumont镊子沿着海马体边缘进行精细切割，以完全释放海马体区域（图5-6）。用弯曲的镊子轻轻地将每个海马移到一个新的35毫米的组织培养皿中，培养皿中含有2ml的冰镇无血清DMEM培养基和1%的抗生素（P/S），并保存在冰上。

注：海马体可通过其典型的C形解剖结构和立体镜下与海马体相连的皮质区的光对比度差异来区分（图5-6）。在移除海马体之后，如果需要的话，可以从相同的胚胎中收集皮质来准备皮质神经元（本方案中没有描述）。

D、海马胰蛋白酶化

1. 用两个Dumont镊子将海马组织切成小块（理想情况下，每个海马体约2-3 mm3），在含有2毫升冰镇无血清DMEM培养基的35毫米组织培养皿中切碎海马组织（图6C）。

注：重要的是收集并保存在无血清DMEM培养基中（步骤C5和D1），以避免在下一步（步骤D2）中抑制胰蛋白酶EDTA活性。

图6。分离海马体（步骤C5和D1）。A、从一个胚胎脑中分离出海马。B、海马区高倍图像显示典型的C形解剖结构。C、碎海马。用于胰蛋白酶消化的海马组织块（步骤D1）。

2. 移到带有无菌层流气流的组织培养罩中，用移液管将含有碎海马的培养基转移到50 ml的无菌锥形管中。轻轻地将2ml 0.25%胰蛋白酶EDTA加入海马，并将试管置于37°C的水浴中25分钟（最终胰蛋白酶浓度为0.125%）。

注：在胰蛋白酶消化25分钟的过程中，切碎的海马体在重力作用下自然沉积到50毫升锥形管的底部。

3. 准备一个15毫升的无菌锥形管，其中含有2毫升温热（37摄氏度）DMEM，含10%胎牛血清和1%抗生素（P/S）。消化结束后，小心地将50毫升消化管移回组织培养罩中，不干扰或重新消耗海马沉积物，并使用1毫升针尖的吸管，仅将海马沉积物转移到含有2毫升完全培养基的新的15毫升锥形管中。

注：用1毫升针头直接接触50毫升试管底部的海马沉积物。轻轻吸气，只转移管底部的海马体，不含消化液。新的2ml培养基中所含的胎牛血清将使胰蛋白酶失活并停止其酶活性。

E、海马组织的磨碎

1. 用本生灯点燃抛光无菌玻璃巴斯德吸管，并产生一个较小的开口和光滑的尖端，以分离海马组织（图7）。使用如图7B所示的火抛光吸管慢慢地、轻轻地研磨海马体。用吸管上下吸6到8次。

注：培养海马是获得良好细胞产量和细胞活力的关键步骤。火抛光后，一定要让玻璃吸管冷却下来再磨碎海马体。海马体块应该在上下吸6到8次后完全破碎。

2. 再次使用本生灯，准备一个新的火拔玻璃巴斯德吸液管，其尖端较长且呈锥形（图7C）。使用该移液管缓慢地向上和向下吸移海马细胞浆，以释放单个细胞。获得单细胞悬浮液后，立即进行程序F。将单细胞悬浮液保存在组织培养罩中，室温下无菌层流气流，同时计数细胞。

注：使用带有较长和锥形尖端的火拉巴斯德吸液管（图7C）会损坏细胞并影响细胞活力。

图7。玻璃巴斯德吸管头（步骤E1和E2）。A、完整的玻璃巴斯德吸管头。B、火焰抛光玻璃巴斯德吸液管，尖端光滑且较小。C、火抛光玻璃巴斯德吸管锥形和超小头。

F、细胞计数、细胞播种和细胞培养

1. 收集50μl细胞悬浮液，并添加5μl台盼蓝染料以评估细胞活性。使用单元格计数器计数单元格。

注：细胞存活率在活细胞的70-90%之间。例如，从8个胚胎中提取的神经元制剂的细胞活力和细胞计数是总共5 x 106个细胞中约4 x 106个活细胞（细胞活力=80%）。

2. 将剩余的海马细胞悬浮液在350 x g下离心5分钟。丢弃上清液，并通过在含B27补充剂的温热神经基础培养基中轻轻上下吸管重新悬浮细胞颗粒。根据将要使用的组织培养板调整培养基的体积。使用大约260000个细胞/平方厘米的播种密度。将细胞接种在先前涂有聚-D-赖氨酸的组织培养皿/平板中。

注意：细胞产量约为400000-600000个细胞/胚胎。在500 ml神经基础培养基中加入10 ml B27增补剂和5 ml P/S抗生素（100倍浓缩液），制备完整的神经元培养基。一些协议（例如。, Ruhl等人，2019年)建议在含10%FBS的DMEM培养基中预镀1小时，以促进神经元与板的粘附。然而，我们已经发现直接在神经基础培养基中加入B27补充剂就足以使神经元粘附良好。

3. 在初镀18～24小时后，加入阿糖胞苷（Ara-C），停止分裂细胞（非神经元细胞）的增殖。去除培养基（含有B27补充剂的神经基础培养基）的一半体积，并用含有2µM Ara-C（1µM Ara-C最终浓度）的新鲜培养基替换。

注：未将Ara-C添加到原代神经元培养物中会严重影响培养物的纯度（图8B和8F）。在神经元培养液中加入Ara-C可观察到一些有丝分裂细胞死亡。

4. 培养原代海马神经元，每48～72h更换一半培养基，初次治疗后更换培养基时不必继续添加Ara-C。培养6天后，原代神经元将发育良好并分化为两种形态，尤其是典型神经元标记物的表达，如微管蛋白-β-Ⅲ、NeuN、Rbfox1、神经营养素受体和其他一些神经元蛋白质（Tomassoni Ardori et al.，2019）（图8和图9）。

笔记：

a。只需更换一半的培养基，就可以保持生长因子在神经元条件培养基中自然分泌和存在。

b。虽然在原代细胞培养物制备过程中不可能绝对防止微生物污染（细菌、支原体、真菌），但这些步骤可以大大提高结果：i）在无菌环境中工作；ii）使用适当的无菌技术，包括戴无菌手套、使用无菌玻璃器皿和一次性移液管；以及小贴士；iii）保持所有设备清洁（解剖显微镜、培养箱、离心机和水浴）。

图8。培养中神经元的发育和分化。A、原代海马神经元体外培养1～6天的Brightfield图像。注意在体外（放大20倍）神经元网络的复杂性随着时间的推移而增加。B、体外培养6天后海马神经元的Western印迹分析。免疫印迹采用针对分化神经元标志物的抗体：BDNF受体TrkB胞外区，检测所有TrkB亚型，Rbfox1，βIII微管蛋白（b-III-Tub）和Rbfox3（NeuN）。分子量标记显示在左边。

G、免疫印迹分析检测分化神经元的标记物（图8B）

1. 体外培养6天后，从含有神经元的24孔板的一个孔中取出培养基。

2. 用PBS冲洗细胞一次。

3. 通过直接向孔中添加150µl 2x Laemmli样品缓冲液来溶解细胞。

4. 将细胞裂解液转移至1.5 ml试管中，超声处理10分钟，将基因组DNA切碎并消除粘度。

5. 将样品在95°C下加热5分钟，以促进蛋白质变性。

6. 将10µl样品每通道装入4-12%NuPAGE预铸凝胶中，并在120 V下运行凝胶。

7. 将凝胶转移到PVDF膜上。

8. 在室温下用5%脱脂牛奶在TBS吐温（0.1%）中封闭薄膜1小时。

9. 在4°C的温度下，轻轻摇动，用特定的初级抗体孵育一整夜。在TBS吐温（0.1%）缓冲液中，在5%脱脂牛奶中稀释1:1000。

10. 用TBS Tween（0.1%）缓冲液清洗薄膜三次，5分钟。

11. 用HRP结合的次级抗体在室温下孵育1h，同时轻轻摇动。在TBS吐温（0.1%）缓冲液中稀释1:5000的二级抗体。

12. 用TBS Tween（0.1%）缓冲液清洗薄膜三次，5分钟。

13. 用增强化学发光（ECL）基质培养膜，用化学发光成像系统或胶片曝光获得图像。

H、免疫荧光法对海马神经元的表型分析（图9）

1. 培养6天后，将培养基从含有多聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白预涂层的12 mm带海马神经元的盖玻片的24孔板中取出。用PBS冲洗电池，并用4%多聚甲醛/PBS溶液在4°C下固定30分钟。

2. 用PBS无钙/镁（PBS-/-）冲洗细胞3次，持续5分钟。

3. 在室温下使用封闭溶液1小时。

注：用10%正常驴血清（v/v）、0.1%TritonTM-X100（v/v）和0.1%BSA（w/v）制备封闭溶液。

4. 在4°C下用特异性初级抗体培养细胞过夜。

注：在含有1%正常驴血清、0.1%TritonTM-X100（v/v）和0.1%BSA（w/v）的PBS-/-溶液中稀释初级抗体。抗GFAP抗体的稀释度为1:1000，抗微管蛋白β-III抗体的稀释度为1:200（见材料和试剂）。

5. 用PBS-/-冲洗细胞3次，持续5分钟。

6. 在室温下用特异性二级抗体和DAPI染色（0.5µg/ml）孵育2小时。Alexa Fluor 488驴抗兔IgG（H+L）：抗GFAP抗体的次级抗体；Alexa Fluor 647驴抗小鼠IgG（H+L）：抗微管蛋白-β-III抗体的次级抗体。使用与步骤G4相同的溶液稀释次级抗体1:250。

7. 用PBS-/-冲洗细胞3次，持续5分钟。

8. 倒置盖玻片，并使用Dako荧光安装介质将其安装到玻璃载玻片上。当安装介质干燥后，样品可以通过共焦成像进行分析。

注：尽管在本方案中，我们表明，在培养6天内可获得分化的海马神经元，我们建议使用阿糖胞苷提高神经元培养纯度（图8和图9），但在某些情况下，与胶质细胞共培养神经元可进一步支持神经元成熟和长期存活(Kaech和Banker，2006年Kim等人，2020年;).

图9。原代海马神经元培养6天后的免疫荧光染色（G程序）。用（A-D）或不加（E-H）阿糖胞苷（Ara-c1µM）培养神经元，并对胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白（GFAP为绿色）、神经元标记物βIII微管蛋白（红色为b-III-TUB）和细胞核染色剂（DAPI为蓝色）染色。注意6天后未经Ara-C处理（F）的神经元培养中，GFAP阳性细胞数量显著增加。用1µM Ara-C培养的神经元的高倍放大图像（I-K），并对βIII微管蛋白（b-III-TUB为绿色）和细胞核染料（蓝色为DAPI）染色。体外培养6天后观察神经元网络的复杂性。

一、海马神经元钙显像功能表型特征（图10和视频1）

功能分化神经元的进一步测试包括自发或谷氨酸诱导去极化后体外发生的钙动态成像（Grienberger和Konnerth，2012）。

1. Fluo-4负载缓冲液的制备：为制备1 ml负载缓冲液，在10µl PowerLoad（100x浓缩液）中加入1µl的Fluo-4储备液（Fluo-4储备液：1 mM在二甲基亚砜中；最终浓度为1µm）。然后添加10µl丙磺舒（储备溶液250 mM；最终浓度2.5 mM）和979µl ECS缓冲液（140 mM NaCl、4.7 mM KCl、2 mM NaHCO3、1 mM NaH2PO4、1.2 mM MgCl2、1.5 mM CaCl2、3 mM葡萄糖和10 mM HEPES，pH 7.4）。

2. 体外培养6天后，用含有海马神经元的盖玻片从24孔板中取出培养基。用250µl的Fluo-4负载缓冲液在37°C下培养每个盖玻片30分钟，然后在37°C的ECS缓冲液中洗涤30分钟，以便使Fluo-4脱酯化和活化。

3. 将记录室中的流量调节至0.5 ml x min，并将温度设置为37°C。

4. 将盖玻片放入录音室并选择合适的区域。

5. 设置焦距，将激光强度（480 nm）设置为较低的可能值和积分时间（像素停留时间），以便在以2个图像x秒的共焦模式开始时间序列采集之前，采集时间小于500毫秒。

6. 记录神经元的自发活动，然后在1毫米处施加谷氨酸盐，持续10秒，去极化并观察场中的所有细胞。

7. 要进行图像分析，请在ImageJ（或斐济）中导入文件https://imagej.net/Fiji/Downloads)；将查找表设置为彩虹RGB；调整图像亮度和对比度；打开ROI管理器（分析/工具/ROI管理器）；选择一个合适的区域形状覆盖感兴趣的神经元，然后选择Images/Stacks/Plot Z-axis Profile来绘制所选ROI随时间变化的光子密度。将ROI添加到ROI管理器，并继续执行另一个ROI。密度图可以导出到电子表格，以便进一步量化。

图10。体外培养6天后原代海马神经元的钙显像（程序一）。用钙指示剂Fluo-4（A）测定原代海马神经元钙荧光强度随时间的变化。在用1 mM谷氨酸盐（蓝色条）治疗前，注意神经元的自发活动。（A）中分析的单个神经元用（B）中的数字表示。在（C）或（D）用1 mM谷氨酸盐刺激前（D）后神经元培养中钙荧光的典型图像。

视频1。体外培养6天后原代海马神经元的钙离子实时成像（图10；程序I）

致谢

我们感谢艾琳·索森和安蒂·凯洛希·佐藤康钦对手稿的批判性阅读。这项工作得到了国家癌症研究所癌症研究中心NIH校内研究计划的支持。

相互竞争的利益

作者声明没有竞争性的利益，提到特定的材料、试剂和设备并不意味着得到美国国立卫生研究院的认可。

伦理学

小鼠研究的实验方案经美国马里兰州弗雷德里克国家癌症研究所（ACUC）动物护理和使用委员会批准（批准号：17-072；批准日期：2018年1月23日）。

工具书类

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