材料和试剂

剃须刀片（VWR北美，目录号：55411-050 ）
微量离心管（Denville Scientific Inc.，目录号：C2171）
PCR管（美国科学）
100平方目铜网上的FORMVAR FILM（电子显微镜科学，目录号：FF100-Cu）
在2 x 1 mm椭圆形槽铜网格上的FORMVAR碳膜（电子显微镜科学，目录号：FCF2010-Cu）
一次性药丸杵（Kimble，目录号：749521-0500）
PCR管
解剖盘
针头
移液器技巧
Toothpic K（飞世尔科技教育，S04180 ）
0.22 µm过滤器（Millipore 和MillexGP 过滤器）
铝箔（Fisher Scientific ，目录号：01-213-101）
Immobilon-P PVDF转移膜（Millipore，目录号：IPVH00010）
果蝇菌株：UASt -VCP WT，VCP RH和AE系是慈康生博士的礼物（Chang 等，2011）。
果蝇菌株
IFM-Gal4，其中Gal4在间接飞行肌肉启动子的控制下，源于flightin 基因（Yun 等人，2014）。的IFM 启动子提供表达的强烈的脉冲在后期蛹期和成年期的最初几天后，被沉默（Kandul 等人。，2016）。果蝇菌株保持在25°C的潮湿培养箱中。

20％多聚甲醛，EM级（电子显微镜科学，目录号：15713S）
8％戊二醛溶液，EM级（电子显微镜科学，目录号：16020）
16％多聚甲醛水溶液，EM级（电子显微镜科学，目录号：15710）
施耐德缓冲器（GIBCO，货号：21720-024）
原位细胞死亡检测试剂盒（Roche，目录号：11684795910）
卢damine毒伞素（生命科技，目录号：R415）
牛血清白蛋白（Fisher生物试剂，目录号：BP1600-100）
Fluoromou Ñ 吨-G（南方生物技术公司，目录号：0100-01）
Pierce RIPA 裂解液（Thermo Scientific，目录号：89900）
不含EDTA的Pierce蛋白酶抑制剂片剂（Thermo Scientific，目录号：88266）
Laemmli SDS样品缓冲液，6x（Bioland Scientific LLC，目录号：SAB02-02）
抗小鼠IgG辣根过氧化物酶连接的完整抗体（来自绵羊）（GE Healthcare，目录号：NXA931）
抗兔IgG辣根过氧化物酶连接的F（ab'）2片段（来自驴子）（GE Healthcare目录号：NA9340V）
山羊抗兔/小鼠Alexa Fluor 546/488二抗（Life Technologies，目录号：A11034 / A11029 / A11035 / A10036）
吐温20 500毫升（Hoefer ，目录号：56-40-6）
Immobilon Western化学发光HRP底物（密理博，目录号：WBKLS0500）。
Embed812（电子显微镜科学，目录号：14900）
四氧化三（（OsO 4 ）4％水溶液（电子显微镜科学，目录号：19150）
DDSA（十二碳烯基琥珀酸酐）（电子显微镜科学，目录号：13710）
NMA（无水萘甲酸甲酯）（电子显微镜科学，目录号：19000）
BDMA（苄基二甲基胺）（电子显微镜科学，目录号：11400）
环氧丙烷（电子显微镜科学，目录号：20401）
甲苯胺蓝O粉末（电子显微镜科学，目录号：22050）
硼酸钠（Fisher Scientific，目录号：S249-500）
醋酸铀酰二水合物（Ted Pella，目录号：19481）
硝酸铅（Sigma-Aldrich，目录号：22862-100G）
二水合柠檬酸钠（EMD，目录号：SX0442-1）
氢氧化钠认证的ACS微丸NaOH（Fisher Scientific，目录号：S318-500）
NMS-873（3- [3-（环戊硫基）-5-[[[2-甲基-4'-（甲磺酰基）[1,1'-联苯基] -4-基]氧基]甲基] -4H-1， 2,4-三唑-4-基]-吡啶（Selleckchem ，目录号：S7285）
ML240，2- （2-氨基-1H-苯并咪唑-1-基）-8-甲氧基-N-（苯甲基）-4-喹唑啉胺（Sigma-Aldrich，目录号：1346527-98-7）
Permount 封固剂（Fisher Scientific公司，目录号：SP15-100）
0 .1％特里顿X - 100
PBS
TUNEL酶
β- 巯基乙醇
乙醇
肌肉解剖固定缓冲液（请参见食谱）
解剖缓冲区（请参见食谱）
TUNEL阻塞缓冲区（请参阅食谱）
0.2M磷酸盐缓冲液（p ħ = 7.4）（见配方）
10 ml EM固定液（请参阅食谱）
Epon Mix（中等）（请参阅食谱）
1％甲苯胺蓝染色溶液（请参见食谱）
醋酸铀染色溶液（请参阅食谱）
柠檬酸铅染色液（请参见配方）

设备

移液器（Denville Scien tific Inc. ，型号：P10，P 20，P 200，P 1000）
Ultra 45°金刚石刀（硅藻，目录号MX5341）
PELCO反向自闭合Twee zers（Ted Pella，目录号：5373 / 5375-NM）
DUMONT生物级镊子（Ted Pella，目录号：505 / 505-U）
粒料杵马达（金布尔/ Kontes ，目录号：749540-0000）
JEOL 100CX透射电子显微镜（加州大学洛杉矶分校脑研究所，电子显微镜核心设施）
超切超薄切片机（Leica EM UC6，Frank Laski博士，UCLA分子细胞与发育生物学）
PELCO Pro反向（自动关闭）t 镊子（Ted Pella，目录号：5375-NM）
解剖镊子（瑞士杜蒙生物学，电子显微科学）
金刚石刀（DiATOME ，Ultra 45°MX5341）
Formvar网格/槽网格（电子显微科学，目录号：FCF2010-Cu，FF100-Cu-50）
水浴（Fisher Scientific ，型号：Isotemp ）
迷你PROTEAN ® 四手工浇铸系统和四印迹bodule （Bio-Rad公司）
安全通风柜（UCLA设施4315-3309-2）
加热块（Fisher Scientific，型号：Isotemp ）

程序

间接飞行肌肉解剖
麻醉剂在CO 2 板上飞行。用剃须刀割断头部和腹部。
室温下，在微量离心管或PCR管中，在4％多聚甲醛/施耐德缓冲液中固定胸腔45分钟。
将固定后的胸带转移到含有0.1％Triton X -100 / PBS 的解剖盘中。Triton X - 100有助于打破表皮的表面张力，并在以下步骤中促进肌肉块的解剖。
间接飞行的肌肉（IFM，在图1A和1B中用红色箭头表示）位于胸骨的中间。可以使用30号针头或镊子解剖IFM。用针头或镊子轻轻地从背侧或腹侧中线打开胸腔，并暴露IFM。IFM是在胸中部前后左右运行的两大块肌肉（图1C）。每组IFM包含5条大块肌肉，这些大块肌肉彼此平行，并位于半剖开的胸部的背面。通过在将肌肉附着到角质层的末端进行切割来仔细隔离每条肌肉。一个固定良好的野生型胸部可以产生5-10个完整的肌肉碎片（图1C）。携带带有IFM靶向GFP标记的果蝇可用于进一步确认已经解剖了正确的肌肉（图1C）。

C：\ Users \ Bio-Dandan \ Dropbox \ Refomatting \ 2020-5-20 \ 0101540--1347 MingGuo 495304 \ Figs jpg \图1-updated.jpg

图1 。间接飞行肌（IFM）解剖。A. IFM在完整胸部中的位置（红色箭头）。B.固定胸部的矢状面，表示红色箭头其中IFM 是LO cated。C.在解剖盘中解剖肌肉块。所用果蝇的基因型是IFM-Gal4> UASt-mitoGFP 。比例尺：0.5 毫米。

IBMPFD果蝇的原位细胞死亡检测/ TUNEL分析
固定胸骨并按上述方法从WT，VCP WT，RH和AE蝇中分离出IFM ，并收集到PCR管中。
将TUNEL封闭缓冲液引入含有肌肉的试管中30分钟。TUNEL封闭缓冲液含有0.2％的Triton X - 100，可同时渗透和封闭肌肉样品。
从原位细胞死亡检测试剂盒中加入TUNEL酶（4 µl）和10x反应缓冲液（36 µl），并在37 °C的水浴中温育2-3小时。每隔30分钟使用移液器轻轻地混合样品。
用PBS洗涤样品两次。
用Fluoromount -G安装溶液替换PBS 。上使用一个玻璃吸管或200显微镜载玻片安装的IFM μ 升移液管尖端，并用共聚焦显微镜可视化的肌肉使用的546纳米的激发波长。在6天大的果蝇中，VCP RH和AE表达导致明显的细胞死亡（Zhang 等人，2017）。观察到这是广泛的红色核染色。

免疫荧光染色和共聚焦显微镜成像
如上所述，解剖固定的肌肉。然后用PBS洗涤，在室温下在摇杆上用0.2％Trito n X - 100 / PBS 渗透肌肉3-4小时，然后用1 x PBS 洗涤5 分钟。
对于肌原纤维染色，添加若丹明鬼笔环肽（1：500稀释）并在室温或4°C下染色2 小时过夜。
为了进行免疫荧光染色，将固定的肌肉片段与在0.2％Triton X - 100 / PBS中稀释至所需浓度（1：100或1：200）的一抗在4°C 孵育过夜。我们使用浓度为1：100的抗TARTAR结合蛋白或抗TDP43。
用0.2％Triton X - 100 / PBS 洗涤3次，每次10分钟。
将肌肉片段与山羊抗兔/小鼠Alexa Fluor 488或546二抗（1：200在0.2％Triton X - 100 / PBS中）在室温或4°C下孵育过夜。
用0.2％Triton X - 100 / PBS 洗涤3次（每次10 分钟），并将样品置于带有Fluoromount -G 的显微镜载玻片上。在共聚焦显微镜下以对应于第二抗体的在488nm或546nm的激发波长使样品可视化。在6天大的果蝇中，TDP43定位于野生型果蝇的IFM的细胞核和胞浆/胞质区域。在VCP RH和AE突变体的肌浆/胞质区域中，细胞核的定位模式消失了，并观察到更多的聚集体（Zhang et al 。，2017）。

蛋白质裂解物和蛋白质印迹
用CO 2 麻醉苍蝇，如上所述分离出胸部，然后将它们放入冰上的微量离心管中。
注意：胸腔未固定。

加入带有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液，每个胸腔10-15 µl，每个基因型5-10胸腔。
将裂解颗粒中的胸部均质，然后将聚丙烯颗粒杵预冷5-6次，然后用研钵以最高速度旋转杵10-15 s。在冰上孵育裂解物30分钟以完全溶解组织。
将蛋白质以10,000 xg的速度离心15分钟，然后将上清液转移至干净的微量离心管中。
在95 °C下用6x SDS样品缓冲液和β- 巯基乙醇煮沸上清液5分钟。
加载蛋白质，让它们在Tris / SDS运行缓冲液中的8％SDS-PAGE凝胶中分离，并在80伏特下运行。
转移蛋白至PVDF膜，用于在Tris /甘氨酸缓冲液，用15％2小时米乙醇。
用3％BSA / PBS孵育转移膜1小时。
将膜与稀释在1％BSA / 0.01％Tween-PBS中的一抗在4 °C下孵育过夜。
将膜在0.01％Tween-PBS中洗涤3次（每次10分钟），并与在5％脱脂牛奶/0.01% Tween-PBS中稀释的抗小鼠/兔IgG HRP连接的二抗孵育2小时。
用Immobilon Western化学发光HRP底物试剂盒开发膜。我们在胸腔中以可比较的水平表达了VCP WT，VCP RH和AE （Zhang et al 。，2017）。

IBMPFD果蝇的甲苯胺蓝染色和电子显微镜
固定和嵌入

注意：在安全通风橱中执行步骤E 4和后续步骤。

麻醉苍蝇并切开胸骨，迅速浸入95％乙醇中（这有助于破坏表面张力，以便于随后将其浸入EM固定液中）。然后将胸液转移至微量离心管中的0.5 ml冰老EM固定缓冲液（下）中。
定出一个在冰上至少2小时以摇动。如果固定时间较长或需要暂停操作，则可在2 h时间点后将样品留在固定剂中，并在4 °C下放置一整夜或直到准备进行。荆棘将沉入微量离心管的底部。
在室温下，用0.1 M磷酸盐缓冲液冲洗每个样品3次（每次10分钟）。
注意：所有后续步骤均应在生物安全罩中进行。

将样品在ddH 2 O 中的1％OsO 4 （新鲜制备）中于室温下固定2 h。样品用OsO 4 固定的时间不得超过2小时，否则样品会变脆。
在室温下用ddH 2 O 冲洗样品3次（每次10分钟）。
在室温下将样品分别在70％和95％乙醇中脱水5分钟。
在室温下，将样品在100％乙醇中脱水两次（每次10分钟）。
在室温下，将样品在100％环氧丙烷中脱水两次（每次7分钟）。
在室温下将样品浸入100％环氧丙烷和Epon 混合物的1：1混合物中30分钟。
在室温下，将样品在100％Epon Mix（添加1.5％BDMA）中孵育过夜。
将样品以100％Epon 混合液（添加1.5％BDMA）引入包埋模具中。在每个孔的右下角，放一张带有样品名称/编号的纸（图2A）。
在6 0 -70 °C 过夜聚合Epon 。
C：\ Users \ Bio-Dandan \ Dropbox \ Refomatting \ 2020-5-20 \ 0101540--1347 MingGuo 495304 \ Figs jpg \图2-updated.jpg

图2. 果蝇胸腔包埋和切片位置。答：两个单独的样本嵌入并用标签封闭。B. 正确嵌入˚F LY胸部（红色箭头）在的Epon 树脂。胸部的矢状平面（白色虚线）应平行于树脂块的边缘，以便于剖切。C. 修整好的树脂块，厚切片后有胸部样品。玻璃刀或金刚石刀的刀片应该与胸部的矢状面平行。比例尺：1 毫米。

切片和染色

甲苯胺蓝染色
如图所示，将嵌入良好的胸腔样本放置在树脂块中（图2B）。胸廓的矢状中线平行于树脂块的边缘。
使用剃刀刀片切掉的Epon 围绕SAMPL ë尽可能（图2C）。减小截面面积将提高截面质量。
切割厚的部分（1.5-2 µm）以进行甲苯胺蓝染色，并确定将在其中进行电子显微镜成像的薄部分的区域。
用切片刀和玻璃刀切出较厚的部分。使用牙签将切片转移至载玻片上的水滴。
将载玻片放在70 °C的加热块上以蒸发水。这将使截面样本变平。
应用1％甲苯胺蓝以完全覆盖该切片样品区域，并将载玻片放在70 °C 加热块上，直到甲苯胺蓝液体的边缘开始干燥（2-5分钟）。不要过度干燥甲苯胺蓝溶液，否则切片会被染色缓冲液中的干燥溶质污染，从而导致图像质量下降。
在ddH 2 O中冲洗载玻片，直到去除未结合的污渍。
在使用Permount 安装溶液之前，先将部分完全干燥。
图3A中显示了野生型胸部对齐良好的厚切片样品（可以轻松观察到间接飞行的肌肉碎片）。可以利用组织样品的更高放大倍率图像（图3B）来分析肌肉组织的完整性。在6天大的果蝇中，与WT和VCP WT对照相比，表达VCP RH和AE的果蝇破坏了肌肉组织的完整性（Zhang et al 。，2017 ）。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 0101540--1347 MingGuo 495304 \ Figs jpg \图3.jpg

图3 。IFM的甲苯胺蓝和EM图像。AB。在不同放大倍数下，胸部厚部分的甲苯胺蓝染色。C. 野生型胸部薄片的EM图像。D.使用ImageJ对线粒体大小进行量化。小号Cale的棒：1 微米（119个像素）。选择的线粒体横截面面积为2.92 微米2 （红色小号quare）。

电子显微镜样品制备
从甲苯胺蓝染色中选择对齐良好的样品，以用于薄切片（80-90 nm）。
用钻石切片机（已消毒的ddH 2 O）用切片机切成薄片。这些部分应显示银色到金色。
用细针将1-4个部分放在水面上的一条线上以进行网格安装。
拿起一个没有用镊子涂上formvar的空插槽网格。轻轻触摸网格以使浮在表面上的部分变小。这些部分将连接到水滴内插槽的中间。
使用一对自闭合镊子，将新的密封密封的插槽网格或网状网格朝上放置。将附有分区的插槽网格放置到新formvar网格的光亮面上。
将三角形滤纸的尖角放在网格之间的边缘，以除去两个网格之间的水滴。这些部分将附加到formvar密封的新网格上并展平。
删除空的网格，然后重新使用它来拾取其他部分。的部分连接的网格可以是商店d 在进一步染色的网格框如下面描述的。
制备醋酸铀（UA）溶液，并通过0.22 µm过滤系统过滤。在室温下，在UA解决方案上将网格的截面面漂浮15分钟。在ddH 2 O水滴中清洗网格五次（每次1分钟），或在3个装有ddH 2 O的单独烧杯中清洗三遍（每次1分钟）。
将网格部分的光泽面朝下放在一滴柠檬酸铅溶液上，并在室温下染色5-10分钟。戴上口罩以防止呼吸，因为过量的CO 2 会影响染色质量。保持染色皿用染色皿随附的塑料盖覆盖。
按上述方法用ddH 2 O 洗涤格栅。
将染色的网格转移到网格盒中以进行进一步成像。
图3C显示了使用TEM以10,000x观察的野生型肌肉的图像。与野生型和VCP WT苍蝇相比，在6天大的苍蝇中，表达VCP RH和AE的苍蝇显示肌动蛋白和线粒体结构受到破坏（Zhang 等，2017 ）。
线粒体横截面尺寸定量
一个。导入的超微结构Ë lectron显微镜图像（10,000 X MAG nification）在以图像J软件（美国国立卫生研究院），图3D。

b。设置比例后（分析>设置比例：119像素= 1 µm），使用多边形选择（黄线）绘制图像上的每个线粒体并测量其面积（分析>测量），如图3D所示。图像上的所有线粒体均被单独测量。

C。对于每个胸部分析至少三张图像，并检查每种基因型的3个胸部。

d。一个独立的小号tudent的牛逼- 测试我š用来测试不同基因型之间的统计学意义。

体内VCP抑制剂治疗
将NMS-873（19.2 mM，原料浓度）和ML240（25.2 mM，原料浓度）的粉末形式溶解在DMSO中作为原料。
稀储备溶液在等hanol /的DDH 2 O（100微升乙醇+ 600微升的DDH 2 O），以该所希望的浓度。乙醇可以帮助保持溶液中的化合物。在微波炉中加热果蝇食物20秒钟，直到其完全融化，然后使其冷却至<50°C。将食品中的DMSO /乙醇H 2 O中的化学物质与每4 毫升飞行食品中10升的食用染料一起添加到食物中，并手动混合直至颜色均匀。如果食物看起来很潮湿，可以在室温下将带有棉塞的小瓶干燥。相当数量的DMSO /乙醇用作载体对照。
将所需基因型的果蝇父母放在含有DMSO /乙醇或抑制剂的食物中3天，以产卵，然后取出。后代的生长则发生在存在的车辆控制或测试化合物。
之后立马隔离成虫（从其case壳孵出），将这些成虫转移到新鲜制备的含有相同浓度DMSO或抑制剂的食物中，并在进行分析之前将果蝇喂养所需的天数。
VCP抑制剂喂养significantl ý反向ð 第ë肌肉崩解，肌肉细胞死亡和超微结构线粒体缺陷VCP RH和AE蝇（张等人。，2017）。

菜谱

肌肉解剖固定缓冲液（500 µl）
100 µl 20％多聚甲醛

施耐德缓冲液400 µl

储存在4°C

注：镨eferably准备新鲜的每次实验。

解剖缓冲区
0.1％Triton X - 100

1x PBS缓冲液

室温保存

TUNEL阻塞缓冲区
的50mM Tris-Cl（上p ħ = 7.4）

188毫米氯化钠

Triton X-100的0.2％

1％BSA

储存在4°C

0.2M磷酸盐缓冲液（p ħ = 7.4）
溶液X：3.516 g Na 2 HPO 4· 2H 2 O / 100 ml ddH 2 O

溶液Y：2.76 g NaH 2 PO 4 · H 2 O / 100 ml ddH 2 O

将40.5 ml溶液X 与9.5 ml溶液Y混合，然后获得50 ml的0.2 M磷酸盐缓冲液。所述p ħ应该是7.4 。

室温保存

10 ml EM固定液
1.25毫升8％戊二醛

0.625毫升16％低聚甲醛

5.0 ml 0.2 M磷酸盐缓冲液

3.125 ml的的DDH 2 ö与不孕ë

储存在4°C

Epon Mix（中）
Embed812 20毫升

DDSA（十二碳烯基琥珀酸酐）16毫升

NMA（无水纳迪克甲基）8毫升

BDMA（苄基二甲基胺）0. 9 毫升（每次嵌入均需新鲜添加）

包埋前彻底混合至少1 小时

可以在室温下保存在避光容器中。预ferably每次准备新鲜

1％甲苯胺蓝染色液
1克甲苯胺蓝粉

1克硼酸钠

100毫升ddH 2 O

使用前过滤0.22 µm。

室温保存在避光容器中

醋酸铀染色液
4克乙酸铀酰

100毫升ddH 2 O

完全溶解（加热至70°C以促进溶解）

使用前过滤0.22 µm

室温下保存在防光照的丙烯酸储藏容器中，以防止β 辐射

铅CITR 吃染色液
在装有铝箔的小烧杯中煮沸100 ml ddH 2 O，以除去CO 2 ，使其冷却至室温

1.33克硝酸铅

1.76克柠檬酸钠

30 ml无CO 2 ddH 2 O

8毫升1 N NaOH（100毫升ddH 2 O中的4克NaOH ）

添加无CO 2的ddH 2 O至总体积为50 ml

储存在4 °C的避光容器中

确认小号

我们感谢美国国立卫生研究院（国立衰老研究所），格伦医学研究基金会，娜塔莉·R和尤金·琼斯衰老与神经退行性疾病研究基金会，肯尼斯·格伦家庭基金会的慷慨支持。加州大学洛杉矶分校Laurie和Steven Gordon对帕金森氏症的治疗承诺，以及Renee和Meyer Luskin家庭基金会。

我们感谢Rosaline Young，Mark Dodson，Hansong Deng和Jina Yun制定并优化了协议（Clark 等，2006； Deng 等，2008； Yun 等，2014）。

竞争我nterests

我们没有利益冲突。

参考文献

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