材料和试剂

1. 肺炎球菌细胞

2. 丝裂霉素C（MitC）（0.1μg/ml）（Sigma-Aldrich，目录号：M0503）

3. 1×PBS（10×PBS pH 7.2）（Life Technologies，Gibco /Invitrogen ，目录号：70013-016）

4. 50mM Tris pH7.5

5. 2％（w/v）氯化胆碱的1x PBS（Sigma-Aldrich，目录号：C7527）

6. NaCl（AppliChem，目录号：A46615000）

7. Tris-HCl（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0799）

8. 甘油（AppliChem，目录号：A2364,5000）

9. SDS（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0416）

10. β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）

11. 溴酚蓝（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0404）

12. 酪氨酸

13. L-色氨酸

14. L-半胱氨酸^。 HCl

15. 谷氨酰胺

16. 腺苷

17. 尿嘧啶

18. 烟酸

19. 吡哆醇

20. 泛酸钙

21. 硫胺素-HCl

22. 核黄素

23. 生物素

24. 天冬酰胺

25. 酪蛋白基半合成培养基C + Y（Lacks和Hotchkiss，1960）（参见配方）

26. 加载缓冲区5x（请参阅配方）

27. C + Y与2％氯化胆碱（参见配方）

设备

1. 在37℃水浴中培养细菌培养物

2. 细胞密度计（Biochrom WPA CO8000细胞密度计）（Biochrom，目录号：80-3000-45）

3. 离心机

4. 0.2μm低结合蛋白膜（DISMIC-03CP）（Advantec，目录号：03CP020AS）

5. 0.22μm膜过滤器（Frilabo，目录号：1520012）

6. Amicon Ultra-15离心过滤器单元，截止10kDa（Merck Millipore，目录号：UFC901024）

7. Western印迹设备

程序

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I. 通过胆碱洗涤提取胆碱结合蛋白< ！ - p - >

1. 生长没有穴蛋白活性的溶源细胞，因此不能裂解，在37℃的C + Y中，直至达到OD 600nm约0.9 （过夜培养）。我们使用溶源性菌株，因为这个协议是以确定噬菌体溶素的定位。此外，因为穴蛋白功能激活噬菌体介导的溶解，我们消除了holin 活性以避免可能的噬菌体溶素逃逸（Frias等人， al 。，2013）。

2. 稀释1：100在7毫升新鲜的C + Y，并继续在37℃下孵育至0.2-0.25的OD 600nm，这需要约2小时。然后，通过用丝裂霉素C处理诱导噬菌体（MitC），终浓度为0.1μg/ml，或不处理控制

3. 在不同的时间点取样品（7ml）实例在20分钟间隔，MitC治疗后。如果是未处理的培养物，在相同时间点收集样品培养物达到OD 600nm 0.2-0.25

4. 通过离心收获细胞（3,200×g，在4℃下10分钟）。

5. 用0.5个培养体积（3.5ml）的冷的1x PBS洗涤细胞一次

6. 为了获得总细胞沉淀级分，将细胞悬浮于200μl50mM Tris pH7.5中并储存在-20℃。

7. 对于胆碱洗涤，轻轻悬浮PBS洗涤的细胞（在步骤5中）在200μl 的在1×PBS中制备的2％氯化胆碱（w/v），并在37℃温育30分钟 4℃，不搅拌以洗脱胆碱结合蛋白（避免细胞裂解）。

8. 作为胆碱特异性的控制洗涤只去除胆碱结合蛋白，孵育细胞相同条件下用1×PBS或2％（w/v）NaCl在1×PBS中制备

9. 搜集细菌通过离心（3,200×g，在4℃下15分钟）。获得胆碱提取后的细胞沉淀级分，洗涤沉淀一次用0.5体积的冷的1x PBS，悬浮在200μl的50mM Tris pH中 7.5，并储存在-20°C

10. 过滤上清液，其中对应于胆碱洗级分，通过0.2μm 低结合蛋白膜以确保所有细菌的去除。储存于-20°C。

11. 在SDS-PAGE上分离蛋白质：煮沸5-15μl 的沉淀级分和45μl上清液级分 min，用1x加样缓冲液装载到凝胶上。你将需要抗体为您的蛋白质可视化蛋白质的蛋白质印迹和重要的是使用抗体控制可能的细胞裂解一个已知的细胞质蛋白（图1）。当比较的数量在样品之间的感兴趣的蛋白质，不要忘记正常化加载蛋白质控制。作为加载相等样品的替代方法体积，然后归一化，确定蛋白质浓度并在每个泳道中加入相同量的总蛋白

图1.胆碱从细胞表面提取增加量的噬菌体溶素（胆碱结合蛋白）。在指定时间从MitC处理的溶原培养物（没有穴蛋白活性）取等量等分试样。通过离心收获细胞，并直接悬浮于Tris缓冲液（细胞沉淀级分，P）或胆碱洗涤（胆碱洗涤级分，S胆碱）中。作为对照，在60和80分钟收集的细胞用PBS（S PBS）洗涤。通过蛋白质印迹法检测噬菌体溶素Sv1（37kDa）与适当抗体的存在的所有级分。还测试了P和S级分的细胞质延伸因子Ts（43kDa）以控制细胞裂解（Frias等人，2013）。

II。在2％胆碱存在下制备培养基级分< ！ - p - >

1. 在37℃下在C + Y中生长没有穴蛋白活性的溶原细胞，直到达到OD 600nm约0.9（过夜培养）。

2. 在7ml新鲜的C + Y中稀释1：100，并继续在37℃下温育至0.2-0.25的OD 600nm。

3. 通过离心收集细胞（3,200×g，在4℃下10分钟），并弃去上清液。

4. 将溶菌素悬浮在含有2％氯化胆碱的7ml C + Y中，用MitC（0.1μg/ml）处理细胞以诱导噬菌体并继续孵育（或者，细菌可在不存在胆碱的情况下生长）。 />

5. 在MitC处理后的不同时间点取样品（7ml）。

6. 通过离心收获细胞（3,200×g，在4℃下10分钟）。为了获得细胞沉淀级分，用0.5体积的冷的1x PBS洗涤细胞一次，悬浮在200μl的50mM Tris pH7.5中并储存在-20℃。

7. 收集对应于培养基级分的上清液，并通过0.22μm膜过滤器过滤。除了分泌的蛋白质之外，该级分还包括在生长培养基中在2％氯化胆碱存在下从肺炎球菌表面洗脱的胆碱结合蛋白。注意胆碱结合蛋白可以使用第一节中描述的程序提取。

8. 通过在Amicon Ultra-15离心过滤装置（截止10kDa）上离心（3,200×g，4℃，约15分钟）浓缩上清液35倍（终体积200μl）。建议膜的截留分子量比保留的蛋白质的分子量小至少3倍。由于我们想研究37kDa噬菌体溶素，我们选择了10kDa截断

9. 注意，该实验还允许测试特定化合物的膜渗透作用，因为在这种情况下人们期望细胞质蛋白质释放到培养基中。如果这是实验的目标，则在步骤4中用目标化合物挑战（MitC处理的）培养物后，按照以下步骤处理样品。

10. 在SDS-PAGE上分离蛋白质：用1×上样缓冲液将5-15μl沉淀部分和45μl上清液部分煮沸5分钟，并加载到凝胶上。您将需要您的蛋白质的抗体在蛋白质印迹上显现蛋白质，并且使用已知胞质蛋白的抗体控制最终细胞裂解是重要的。

食谱

1. C + Y（pH 8），463ml
400ml PreC（A）
13毫升补充（B）
10ml在水中的1mg/ml（w/v）谷氨酰胺
10ml亚当斯III（C）
5ml在水中的2％（w/v）丙酮酸盐 15ml pH 8的1M磷酸钾（KPO 4）缓冲液
10ml在水中的5％（w/v）酵母提取物（A）PreC，2000ml
2.42g无水乙酸钠
10g酪蛋白氨基酸 0.01克L-色氨酸 0.1g L-半胱氨酸。 HCl
将dH <2> O添加至2,000 ml
调整至pH 7.4-7.6
高压灭菌器
在室温下储存。
（B）补充，213 ml
30ml 3合1盐（D）
60ml 20％（w/v）葡萄糖的水溶液 3ml 50％（w/v）蔗糖的水溶液 60ml 2mg/ml（w/v）腺苷的水溶液
60ml 2mg/ml（w/v）尿苷的水溶液
过滤灭菌（0.22μm）
存储在4°C
（C）Adams III，400ml
0.8克天冬酰胺 0.08克胆碱
0.64ml的1％（w/v）CaCl 2水溶液
64ml Adams I（E）
16ml Adams II（F）
将dH <2> O加到400ml
中过滤灭菌（0.22μm）
在4℃下避光保存
（D）3合1盐，100ml
10g MgCl 2 。 6H <2> 0.05g CaCl 2水溶液
0.02ml的0.1M MnSO 4·6H 2 O·4H 2 O·h / 将dH <2> O添加到100 ml
高压灭菌器
在室温下贮存
（E）Adams I，200ml
0.03克烟酸
0.035克吡哆醇 0.12克泛酸钙 0.032克硫胺素-HCl 0.014g核黄素
0.06ml 0.5mg/ml（w/v）生物素的水溶液
将dH ₂O加到200ml
中过滤灭菌（0.22μm）
在4℃下避光保存
（F）Adams II，100ml
0.05g的FeSO 4 7H 2 O 0.05g的CuSO 4 。 5H O 0.05g的ZnSO 4 7H 2 O 0.02g的MnCl 2 4H 2 O 1ml HCl浓缩
将dH <2> O添加到100 ml
高压灭菌器
在室温下贮存

2. 5x上样缓冲液（62.5mM Tris-HCl，pH6.8,20％甘油，2％SDS，10％β-巯基乙醇），8ml
1 ml 0.5 M Tris-HCl（pH 6.8）
1.6ml甘油
1.6ml 10％SDS 0.8mlβ-巯基乙醇 0.4ml 0.5％（w/v）溴酚蓝的水溶液
将dH <2> O加到8ml
中储存于-20°C

3. C + Y与2％氯化胆碱，100ml
2克氯化胆碱
将C + Y添加到100 ml
过滤灭菌（0.22μm）
存储在4°C

参考文献

1. Frias，M.J.，Melo-Cristino，J.and Ramirez，M。（2013）。导出肺炎球菌噬菌体SV1溶素需要含胆碱的磷壁酸和是不依赖于孔的。 Mol Microbiol 87（2）：430-445。

2. Lacks，S.and Hotchkiss，R.D。（1960）。对确定肺炎球菌中的酶的遗传物质的研究 a> Biochim Biophys Acta 39：508-518。