材料与试剂

生物材料

大麦（ Hordeum vulgare品种Keel）发芽幼苗的顶端根分生组织从墨尔本大学获得，来自之前的研究[36]（注1）
大肠杆菌70S核糖体（New England BioLabs，目录号：P0763S）；一管 1 mg 足以作为下面详述的实验方案的内标

试剂

盐酸胍（GuHCl）（Sigma-Aldrich，目录号：G3272）
三氟乙酸（TFA）（Thermo Fisher Scientific，目录号：85183）
Pierce ^TM BCA 蛋白质测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：23227）
分子生物学级水，不含 DNase 和 RNase（Research Products International，目录号：248700）
三乙基碳酸氢铵缓冲液（TEAB）（Sigma-Aldrich，目录号：T7408）
三（2-羧乙基）膦盐酸盐（TCEP）（Macherey-Nagel，目录号：740395.107）
碘乙酰胺（IAA）（Sigma-Aldrich，目录号：I5161）
乙腈（Acn）（Sigma-Aldrich，目录号：271004）
Sera-Mag ^TM SpeedBad 羧化修饰磁性颗粒[GE Healthcare，目录号：45152105050250（亲水）； 65152105050250（疏水）]
无水乙醇，适用于 HPLC，≥99.8%（Sigma-Aldrich，目录号：34852-M）
内切蛋白酶 Lys-C（New England Biolabs，目录号：P8109S）
Trizma(R)-盐酸盐溶液，pH 9.0，不含 RNase（Sigma-Aldrich，目录号：1185-53-1）
用于分子生物学的无核酸酶水 (Sigma-Aldrich, 7732-18-5)
氯化钾 (KCl) (2 M)，不含 RNase（Sigma-Aldrich，目录号：AM9640G）
EGTA（sigma-Aldrich，目录号：324626）
氯化镁溶液 (MgCl ₂ ) (1 M)，不含 RNase（Sigma-Aldrich，目录号：M1028）
氯霉素（Cm）（Sigma-Aldrich，目录号：C0378）
放线菌酮（CHX）（Research Products International，目录号：50488631）
二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
蛋白酶抑制剂混合物（Pi）（Sigma，目录号：P9599）
苯甲基磺酰氟（PMSF）（Thermo Fisher Scientific，目录号：36978）

解决方案

重悬缓冲液（参见配方）
6 M GuHCl（参见配方）
50% (v/v) TFA（参见配方）
500 mM TCEP（参见配方）
55 mM IAA（参见配方）
消化缓冲液和内切蛋白酶 Lys C 工作溶液（参见配方）
80% Acn、0.1% TFA (v/v)（参见配方）

食谱

重悬缓冲液 (10 mL)

*在开始方案之前准备好所有必要的库存。建议制备预重悬缓冲液并于 4°C 保存；除小分子外，所有库存都必须通过 0.22 μm 过滤器过滤或高压灭菌。随后，在用于重悬之前，添加翻译失速剂和还原剂，即 Cm、CHX、DTT、PMSF 和 Pi。

试剂	最终浓度	体积
TRIS HCl（1 M，pH 9.0）	200毫米	2毫升
氯化钾 (2 M)	200毫米	1毫升
EGTA（500 mM，pH 8.0）	25毫米	500微升
氯化镁₂ (1 M)	35毫米	350微升
无RNase水	不适用	5.94毫升
CHX (180 毫米)	0.18毫米	10微升
数码地面电视 (1 M)	5毫米	50微升
PMSF (200 mM)	1毫米	50微升
圆周率 (100×)	1×	100微升
全部的	不适用	10毫升

6 M 盐酸盐酸 (10 mL)

*每次都是新鲜准备的。

试剂最终浓度数量

盐酸胍 6M 5.73克

无RNase水不适用高达 10 毫升

全部的不适用 10毫升
50% TFA (1 毫升)

*每次都是新鲜准备的。注意：在通风橱中准备。

试剂最终浓度体积

三氟乙酸 50% 500微升

无RNase水不适用 500微升

全部的不适用 1毫升
500 mM TCEP (750 µL)

*根据制造商的说明制备还原剂TCEP的工作溶液。将材料溶解在水中可能需要几分钟；混合几次。复溶后，溶液应保存在-20°C 下，并可稳定至少六个月。

试剂最终浓度数量

TCEP 500毫米 107毫克

无RNase水不适用 750微升

全部的不适用 750 µL
55 mM IAA (3 mL)

* IAA 对光敏感。溶液应新鲜配制，并且孵育应在黑暗中进行。

试剂最终浓度数量

国际航空协会 55毫米 56毫克

茶碱 (1M) 25毫米 3毫升

全部的不适用 3毫升

消化缓冲液和内切蛋白酶 Lys-C

*所需内切蛋白酶Lys-C的量取决于样品的数量和每个样品中的蛋白质含量。请考虑，即使 Lys-C 蛋白酶原液相同，如果样品中的蛋白质含量不同，25 mM TEAB 的体积也可能不同。

试剂	最终浓度	数量或体积
茶碱 (1M)	25毫米	10:1 (v/w) TEAB/蛋白质
内切蛋白酶 Lys-C (20 µg)	不适用	1:20（w/w）Lys-C/蛋白质
全部的	不适用	不适用

80% 乙腈、0.1% TFA (75 毫升)

试剂	最终浓度	数量或体积
丙烯酰胺	80%	60毫升
三氟乙酸 (50%)	0.1%	150微升
无RNase水	不适用	14,850 µL
全部的	不适用	75毫升

实验室用品

冰
冰桶
移液器：10 μL、200 μL、1000 μL
吸头：10 μL、200 μL、1000 μL
超速离心管，1 mL，开顶厚壁聚碳酸酯（Beckman Coulter，目录号：343778）
超速离心管（Beckman Coulter，目录号：326819）
2 mL 安全锁管（Eppendorf，目录号：0030120094）
1.5 mL 安全锁管（Eppendorf，目录号：0030120086）
96孔板（Sarstedt，目录号：1581100）
铝箔
pH 试纸（Macherey-Nagel，目录号：90204）
固相萃取（SPE）柱（Waters，目录号：186000383）

设备

-80 °C 深度冷冻柜（SANYO，型号：MDF-U 72 V）
天平 XS105（梅特勒-托利多，目录号：30132870）
SW55 Ti 转子（Beckman Coulter，Krefeld，型号：55 Ti）
超速离心机（Beckman Coulter，Krefeld，型号：Optima XPN）
Optima MAX-XP 超速离心机（Beckman Coulter，目录号：393315）
MLA-130 定角转子（Beckman Coulter，型号：Krefeld，型号：MLA-130）
涡旋混合器（Bender & Hobein，型号：G560-E）
通风柜（Waldner，型号：气流控制器 AC2）
高速离心机（Eppendorf，型号：5417R）
培养室温度设置为 37 °C（注 2）
热混合器（Eppendorf，目录号：5382000015）
酶标仪（BioTek Elisa ELx808，型号：25-315S）
磁力架（Invitrogen，DynaMag-2，型号：12321D）
Speed-vac（LaboGene，型号：SCANVAC CoolSafe100-9 PROSuperior XS）
冷冻干燥机（Christ，型号：Alpha 2-4 LSCbasic）
Orbitrap 质谱仪（Thermo Fisher Scientific，型号：Eclipse）配备纳流 HPLC（Ultimate 3000 RSLC，Dionex）

软件和数据集

吸光度板读数器软件（BioTek，Gen5 2.09，04/2022）
微软办公软件（微软）
MaxQuant（2.4 以上版本，04/2022）
R统计语言（3.10以上版本，06/2023）
R 包 ProtSynthesis ( https://github.com/MSeidelFed/ProtSynthesis ) (访问日期，05/2022)
Python（版本 3 以上，04/2021）
Python 脚本 IsotopeEnrichment ( https://github.com/mgleeming/isotopeEnrichment )（访问日期，05/2022）

程序

多核糖体级分的制粒

植物单体或多核糖体级分可以在蔗糖梯度中纯化[16,37,38]。
1. 取先前在已知的翻译停滞剂（例如氯霉素和放线菌酮）存在下分离的多核糖体级分。如果储存在-80°C，则在冰上解冻5分钟（注3）。
2. 将多核糖体级分转移至 1 mL 开口厚壁聚碳酸酯超速离心管中，并充分混合（注 4）。
3. 添加重悬缓冲液至 1 mL，并通过上下移液彻底重悬，直至溶液澄清（注 5）。
4. 使用重悬缓冲液（标准偏差为 5 µg）对所有带有重悬多核糖体的管进行皮重。
5. 在 Optima MAX-XP 上安装的 MLA-130 固定角转子中，以 110,000 RPM、4 °C 离心 2 小时 [重力（平均）为 616,616 × g，最大 731,808 × g，K 系数为 8]超速离心机（注 6）。
6. 离心后立即通过倾析弃去上清液，同时注意不要扰动沉淀并迅速采取行动，以避免沉淀在缓冲液中重新悬浮的可能性。
7. 将管子倒置在干净的吸水纸上 1 分钟，以除去大部分上清液，让沉淀在这段时间内风干。要充分干燥多余的液体，请在管内短暂引入吸水纸，不要干扰底部的颗粒。多核糖体颗粒在管底部具有扁平果冻状外观（图 1）。
  
  图 1. 核糖体沉淀
8. 立即将管转移到冰上并使用或将颗粒储存在-80°C直至进一步使用。
重悬以进行 r 蛋白解离（注 7）。
1. 取出步骤 A8 中含有多聚核糖体沉淀的试管，并将其置于冰上。
2. 通过向样品中添加 60 µL 6 M GuHCl 并缓慢上下移液直至颗粒消失，重新悬浮核糖体颗粒。
3. 使用 P1000 将重悬液转移至 2 mL 安全锁管。
4. 通过移液将每个样品移入 1.2 µL 50% (v/v) TFA 溶液中，以达到 1% (v/v) 的最终体积，从而酸化每个样品。
5. 短暂涡旋每个样品。
6. 4°C全速（21,400 × g）离心 20 分钟以沉淀并去除 RNA。
7. 使用 P200 小心地将上清液转移到新的 2 mL 安全锁管中，不要破坏沉淀（注 8），将管储存在冰上，然后继续进行下一部分测量蛋白质含量。

测定和调整珠子的 r 蛋白浓度和蛋白酶需求

以下步骤使用经典的 BCA 蛋白质测定试剂盒和吸光度板读数器测量所有样品的总蛋白质含量。一些步骤已在测定手册提供的范围内进行了修改，以适应管道。
从每个样品中取出 6 µL 至 96 孔板（例如表 1），并用不含 RNase 的水稀释至少 1 倍，以达到小于或等于 3 M GuHCl 的浓度，该浓度低于 Pierce 的兼容性阈值BCA 蛋白质测定。

按照 Pierce BCA 蛋白测定方案制备稀释的 BSA 标准品和工作试剂，并测定每个样品的未知蛋白浓度（注 9）。

首先，将每个标准品的 10 µL 分三次复制到 96 孔板中。
将 200 µL 工作试剂添加到每个孔中，并在板摇床上彻底混合板 30 s。
用铝箔盖住板并在 37°C 下孵育 30 分钟。
将板在室温下冷却 10 分钟。在读板器上测量 562 nm 处或附近的吸光度。
从所有其他单个标准品和未知样品的 562 nm 测量值中减去空白标准品重复的平均 562 nm 吸光度测量值（无蛋白质缓冲液测量值或水，取决于所选程序）。

通过绘制每个 BSA 标准品的平均空白校正 562 nm 测量值与其浓度（μg/mL）来制备标准曲线。使用标准曲线确定每个样品的未知蛋白质浓度。

表 1. 96 孔板布局。绿色柱代表 BSA 标准品的三个重复，灰色柱代表最多 21 个样品及其三个技术重复。

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	答：1	A2	答：3	S1:1	S1:2	S1:3	S2:1	S2:2	S2：3	S3:1	S3：2	S3:3
乙	乙：1	乙：2	乙：3	S4:1	S4:2	S4:3	S5:1	S5:2	S5:3	S6：1	S6:2	S6:3
C	碳：1	碳：2	碳：3	S7：1	S7：2	S7:3	S8：1	S8：2	S8：3	S9：1	S9:2	S9:3
D	深度：1	深度：2	深度：3	S10:1	S10：2	S10：3	S11：1	S11：2	S11：3	S12：1	S12：2	S12：3
乙	乙：1	乙：2	乙：3	S13：1	S13：2	S13：3	S14：1	S14：2	S14：3	S15：1	S15：2	S15：3
F	频率：1	前：2	前：3	S16：1	S16：2	S16：3	S17：1	S17：2	S17：3	S18：1	S18：2	S18：3
G	重力：1	重力：2	重力：3	S19：1	S19：2	S19:3	S20：1	S20：2	S20：3	S21：1	S21：2	S21：3
H	高：1	高：2	高：3	3M 氯化胍	3M 氯化胍	3M 氯化胍	水	水	水

确定并取出每个样品对应 10 µg 蛋白质的体积。
将确定的体积移入新的 2 mL Eppendorf 管中，并用 6 M GuHCl、1% (v/v) TFA 加满至 50 µL，以标准化所有样品中的蛋白质浓度。
通过向每个样品中添加 10 µL 1 M TEAB，将标准化蛋白质溶液的 pH 从酸性增加到大约 8。
通过向 pH 试纸中添加 1 µL 来监测每个样品的 pH 值。

SP3珠工作液
1. 从 4°C 中取出珠子 A 和 B，让它们平衡至室温约 10 分钟。库存 A 和 B 对应于 Sera-Mag SpeedBad 羧化修饰磁性颗粒套件中的 45152105050250（亲水）和 65152105050250（疏水）部件。轻轻摇动混合两种原料，使其均质化，并使珠子悬浮。
2. 在 2 mL Eppendorf 管中，将 100 µL 亲水珠库存 A 与 100 µL 疏水珠库存 B 混合，并添加 800 µL 无 RNase H ₂ O。
3. 将管子放入磁力架中约 1 分钟，使珠子与溶液分离，然后立即小心地丢弃上清液，不要干扰珠子。
4. 要清洗磁珠，从磁力架上取下管子，加入 1 mL 不含 RNase 的 H ₂ O。通过移液充分混合，然后将管子放回磁力架上。让珠子分离，1 分钟后用移液器除去上清液，不要干扰珠子。重复洗涤步骤三遍。
5. 为了获得工作溶液 (20 µg/µL)，在去除最后一次洗涤的上清液后，将 500 µL 无 RNase H ₂ O 添加到珠子中。工作液可在4℃保存一个月。
还原、烷基化和消化

选择蛋白酶消化核糖体蛋白质组的考虑因素：RNA-蛋白质结合域富含组氨酸、精氨酸和赖氨酸等氨基酸残基，这些都是碱性氨基酸。碱性氨基酸在整个 TOL 中填充核糖体蛋白质组，因为 r 蛋白必须与 rRNA 结合。事实上，许多 r 蛋白相互作用都是由 rRNA 直接介导的。核糖蛋白质组的性质明确定义了对定制蛋白酶处理以获得所有 r 蛋白的充分代表性的明确期望。已知蛋白酶胰蛋白酶可以消化赖氨酸和精氨酸 C 末端的肽序列。因此，r-蛋白的裂解可以产生许多小的胰蛋白酶肽。相比之下，Lys-C 仅消化赖氨酸残基 C 端的蛋白质序列。根据计算机分析，Lys-C 将大多数 r 蛋白切割成比胰蛋白酶明显更长的肽段（图 2）。因此，与测试的蛋白酶相比，使用 Lys-C 可以更好地表达核糖蛋白质组。

图 2. 火山图概述了通过应用于整个生命树模型生物的核糖体蛋白质组的计算机蛋白酶消化，与胰蛋白酶相比，Lys-C 产生的平均肽长度的差异。与补充表 1 相关。使用 Protein-Digestion-Simulator 软件 ( https://github.com/PNNL-Comp-Mass-Spec/Protein-Digestion-Simulator )进行计算机蛋白酶消化。分析消化所得的图在 x 轴上包含胰蛋白酶和 Lys-C 消化的平均肽长度之间的比率的log ₂ 。 y 轴包含根据每个特定核糖体蛋白的平均肽长度的统计比较调整后的P值 ( P _adj )的-log ₁₀ 。请注意，在真核模型中，大多数 P-Stalk 酸性蛋白的 x 值 > 大于 0；与 Lys-C 相比，用胰蛋白酶消化时，所有其他核糖体蛋白的平均肽长度更短。水平虚线表示使用 -Log _{10函数转换的显着性边界 (}P ≤ 0.05) ；因此，与 Lys-C 相比，用胰蛋白酶消化时，该线上方的所有蛋白质的平均肽长度明显更短。
1. 将 1.2 µL 0.5M TCEP 添加到每个样品中，以达到 10 mM 浓度，并在培养箱中以 800 RPM 和 37°C 摇动 45 分钟。
2. 快速工作：添加 60 µL 新鲜制备的 IAA，并在黑暗中摇动或用铝箔覆盖，在培养箱中以 800 RPM 和 37 °C 培养 45 分钟。
3. 向每个样品中添加 160 µL Acn，以达到 70% (v/v) 的最终浓度。
4. 将 10:1 的珠子与蛋白质的比例添加到每个样品中，并通过移液器彻底混合以形成均匀的溶液。
5. 让样品在室温下静置 10 分钟，通过移液混合，然后在室温下再静置 10 分钟。等待时准备消化缓冲液。
6. 将管子放在磁力架上，让它们分离 30 秒。
  
  关键：快速工作并准备好所有材料。所有后续清洗步骤均快速执行，无需从磁力架上取下安全锁管。
7. 用移液器取出并丢弃上清液。
8. 将 1 mL 纯 Acn 添加到每个管中，静置 10 秒，然后用移液器吸取丢弃。
9. 向每个管中添加 1 mL 70% (v/v) 乙醇，静置 10 秒，然后用移液器丢弃。从磁力架上取下管子。
10. 向每个样品添加 10:1 消化缓冲液 (μL) 与蛋白质 (μg) 的比例。消化缓冲液含有内切蛋白酶 Lys-C，蛋白酶与蛋白质的比例为 1:20，在 25 mM TEAB 中稀释。
11. 在 37°C 下以 200 RPM 摇动过夜（18-20 小时）孵育。
肽洗涤和加工
1. 添加 50% (v/v) TFA 以达到 1% 浓度以淬灭消化，例如，对于 130 µL，每个样品添加 2.6 µL 50% (v/v) TFA。
2. 充分混合并在微量离心机中旋转 2 秒。
3. 将管转移到磁力架上，取出磁珠，分离 60 秒，然后将上清液转移到新的 1.5 mL 安全锁管中。
4. 重复此步骤，将带有上清液的管转移回磁力架，分离 60 秒，然后将上清液转移到新的 1.5 mL 安全锁管中。
5. 以最大速度 (21,400 × g ) 离心 10 分钟以除去任何残留的珠子。
6. 在不破坏沉淀的情况下，将 90% 的上清液转移至新的 1.5 mL 安全锁管中。
7. 将每个样品的 1 µL 放在 pH 试纸上，确认 pH 值低于 3。
8. 按照您选择的排列方式以垂直方式安装 SPE 柱（每个样品一个）。
  
  注意：在通风橱中工作。
9. 用 1 mL 的 80% Acn、0.1% TFA (v/v) 清洗 SPE 柱，以通过重力平衡、释放和丢弃流穿物。
10. 用 1.2 mL 0.1% (v/v) TFA 再次洗涤两次，让流出物通过重力释放，然后丢弃。
11. 清洗后，缓慢加载样品，使肽与 SPE 小柱结合。
12. 用 1.5 mL 0.1% (v/v) TFA 清洗结合的肽，并通过重力丢弃流出物。
13. 在每个 SPE 墨盒下方安装 1.5 mL 安全锁管，并通过使用 800 µL 80% Acn 和 0.1% TFA (v/v) 洗脱来收集肽。
14. 在室温下真空浓缩至初始体积的约 20%（在此制备阶段，Acn 几乎完全去除）。
15. 将样品在深冰箱（-80°C）中冷冻 1 小时。
16. 将样品冷冻干燥约 3 小时或直至管完全干燥。
17. 冻干肽可重新悬浮在质谱上样缓冲液（2% ACN、0.05% TFA）中，并在您选择的 LCMS 平台中进行测量。

数据分析

我们的方法中使用的完整 R 和 Python 代码是公开可用的，并通过两个 GitHub 存储库完整记录。在这里，我们将 R 包的文档包含在补充文件 1 中，并将其在 html 格式的已编译 markdown 上的推荐用法作为补充文件 2，其中包含包中每个函数的详细示例、输入和输出。要可视化 .md 文件中嵌入的图形，您的计算机必须登录互联网。此外，我们报告了数学公式，详细说明了它们的实用含义和假设，并在 Martinez-Seidel 等人的手稿中解释了它们的结果。 [1]。

协议验证

该协议或其部分内容已在以下研究文章中使用和验证：

马丁内斯-赛德尔等人。（2022）。改造的核糖体在寒冷期间在增殖的植物组织中合成特定的蛋白质组。 bioRxiv（图 5 和 6）。

为了验证我们的湿实验室方法（步骤 4）的方法学目标，我们使用了大肠杆菌70S 核糖体的商业制剂。我们建议使用这样的对照来确认所需的大分子复合物（在我们的例子中为核糖体）能够完整地承受本文描述的所有纯化程序。

准备 4 µL 等份的大肠杆菌核糖体（注 10）。
将核糖体等分试样分层在蔗糖垫（Martinez-Seidel 等人 [1]）或蔗糖梯度顶部，如 Siodmak 等人先前所述。 [16]。
按照 A 节中所述高速离心，并遵循本手稿各部分中详述的相同程序。

通过评估 MaxQuant 为三个独立重复生成的蛋白质注释的完整性，我们验证了我们的方法能够恢复天然 70S大肠杆菌核糖体（图 3）。

图 3.通过核糖体蛋白质组分析流程获得的市售制剂中大肠杆菌70S 核糖体蛋白质组的完全覆盖。与补充表 2 相关。核糖体蛋白质组学流程通过来自大肠杆菌70S 核糖体的相同商业制剂的三个独立重复进行了验证。测试的管道包括核糖体提取，随后通过蔗糖垫进行纯化[遵循程序 A，使用 60% (w/v) 蔗糖溶液作为垫来过滤核糖体颗粒与任何其他碎片]，用离液剂重新悬浮颗粒状复合物促进核糖体蛋白解离的试剂，并在 SP3 珠结合核糖体蛋白进行蛋白酶消化之前去除 rRNA。 70S 核糖体的覆盖是完整的，其中 21 个蛋白质来自 30S 小亚基，33 个蛋白质来自 50S 大亚基，再加上一小组预期的核糖体相关因子。图中三重条的高度（即 x 轴单位）是通过 LC-MS/MS 从对照核糖体复合物测量并通过 MaxQuant 定量的 LFQ-核糖体蛋白质丰度的log ₁₀值。 y 轴包含已识别核糖体蛋白的通用名称。

我们可以自信地报告，在所有重复中（补充表 2），我们以恒定的化学计量恢复并分析了所有大肠杆菌r 蛋白，从而验证了所提出的方法恢复了天然和完整的核糖体，并且恢复的核糖蛋白质组没有从根本上改变纯化程序。

质谱参数：梯度设置（流速300 nL/min）为：溶剂B 59 min内3%–23%，10 min内23%–40%，5 min内40%–80%，即保持在 80% 5 分钟，然后在 0.1 分钟内降至 3%，随后在 3% 溶剂 B 中平衡 9.9 分钟。所有 LC-MS/MS 实验均使用具有正模式纳米电喷雾电离 (ESI) 源的 Eclipse Orbitrap 质谱仪。喷雾电压、离子漏斗 RF 和毛细管温度水平设置分别为 1.9 kV、30% 和 275 °C。每个完整的 MS 扫描谱图和尽可能多的数据相关的高能 C 陷阱解离 (HCD)-MS/MS 谱图以每个周期 3 秒的速度采集质谱图。全扫描质谱图设置为捕获 am/z 为 375 至 1500 之间的离子，最大离子捕获时间为 50 ms，自动增益控制目标值为 4e5； am/z 为 200 时分辨率为 120,000。 m/z 隔离窗口为 1.6，自动增益控制目标值为 5e4，归一化碰撞能量为 30%，最大离子捕获时间为 22 ms， am/z 为 200 时的分辨率为 15,000，用于执行前体离子（电荷态范围为 2 至 6）的数据依赖型 HCD-MS/MS。

生成的数据集在完整的数据提交下通过 PRIDE [40] 合作伙伴存储库存入 Proteome Xchange Consortium [39]，这意味着可以主动浏览所有已测序的肽和已识别的蛋白质。数据集标识符为 PXD032938（DOI：10.6019/PXD032938）。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

我们发现，以生理上合法的方式从大麦幼苗获得顶根分生组织的最简单方法是将植物在完全覆盖的15厘米培养皿中发芽，避光3-5天（大麦的最佳发芽时间）。这确保了根系的黑暗环境，同时提供了开始发芽所需的营养液。建议在电镀前 24 小时在黑暗中吸液。
任何设置为 37 °C 的空间或烤箱都适用于孵化步骤。
我们不建议对进入管道的多核糖体量进行标准化，因为这些量是根据 rRNA 吸光度计算的，因此不能反映 r 蛋白质组动态变化。相反，我们标准化了进入蛋白酶消化的 r 蛋白的数量。我们建议记录和报告多核糖体的总量（即，源自超速离心蔗糖梯度分级过程中的 rRNA 吸光度）作为主动翻译的反映。
样品之间的体积可能不同。总馏分体积应在 400 至 800 µL 之间。超速离心管的最大体积为 1 mL。
这将降低 60% (w/v) 蔗糖浓度，使所有多核糖体在超速离心过程中沉淀。建议制备不添加任何物质的预重悬缓冲液，并将其储存在 4 °C 下。重悬之前，添加翻译失速剂和还原剂。
转子和超速离心机的可用性：我们在此描述的超速离心机和转子特定的运行可以根据您可以使用的任何设备进行调整，方法是使用我们的参数和贝克曼库尔特转子转换工具来查找您自己的设备中的等效运行（https： //www.beckman.com/centrifuges/rotors/calculator）。
始终将样品置于冰上。
RNA 颗粒可保存在 -20 °C 下以备后用。
理想情况下，标准曲线应在与测试样品相同的溶液中制备。或者，始终在与测试样品相同的溶液中加入不含蛋白质的对照，以检查是否没有反应性，从而验证超纯水中建立的标准曲线。
每个等分试样含有约 2000 个吸光度 260 个单位，相当于约 102 µg 核糖体和 23 µg r 蛋白。

故障排除

转子和超速离心机的可用性：我们在此描述的超速离心机和转子特定的运行可以根据您可以使用的任何设备进行调整，方法是使用我们的参数和贝克曼库尔特转子转换工具来查找您自己的设备中的等效运行（https： //www.beckman.com/centrifuges/rotors/calculator）。
37 °C 的孵化步骤：孵化步骤在 37 °C 的房间中进行，但这些可以在任何可设置为适当温度的烤箱中完成。
消化时间：消化时间可以从 12 到 24 小时不等，但我们建议无论您选择的范围如何，始终保持其可重复性。必须尽快用酸淬灭消化，以确保样品的重现性。
安全停止点：我们已成功将多核糖体颗粒在 -80 °C 下保存长达六个月。在 GuHCl 中重悬后，未消化蛋白质最安全的停止点是在还原和烷基化之后，此时蛋白质将保持变性，直到进行以下步骤。我们建议不要这样存储超过几周，因为 TEAB 缓冲液会慢慢失去其缓冲能力。消化后，干净的肽最好可以在-80°C无限期保存，但我们已将肽在室温下保存长达一个月。
磁珠溶液：磁珠重悬工作溶液在 4 °C 下保存可保存一个月。
稳定同位素滴定和最佳标记时间：稳定同位素标记必须进行足够长的时间，以便代谢目标（即氨基酸）达到标记掺入的稳态水平，该水平通常持续几天并允许实验期内进行。这可确保实验开始时富集固定量的可溶性氨基酸池，从而确保肽富集的校正是合法的。如果不这样做可能会导致不可重复的肽富集。
SPE 小柱排列：我们建议使用普通胶带将 SPE 小柱粘在升高的表面上，使其底部开口可以装入微量离心管的接收管中。这样，肽将直接洗脱到微量离心管中。 SPE 柱可以干燥，而不会影响回收的肽的数量。

致谢

我们感谢墨尔本大学 Bio21 分子科学和生物技术研究所的质谱和蛋白质组学设施对质谱分析的支持。调频-S。感谢马克斯·普朗克学会（马克斯·普朗克分子植物生理学研究所）和墨尔本大学通过墨尔本-波茨坦博士项目（MelPoPP）资助他的研究。

利益争夺

作者声明，该研究是在不存在任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

参考

Martinez-Seidel, F.、Suwanchaikasem, P.、Gentry-Torfer, D.、Rajarathinam, Y.、Ebert, A.、Erban, A.、Pereira Firmino, AA、Nie, S.、Leeming, MG、Williamson, NA，等人。（2022）。改造的核糖体在寒冷期间在增殖的植物组织中合成特定的蛋白质组。BioRxiv：e518201。https://doi.org/10.1101/2022.11.28.518201
Erban, A.、Martinez-Seidel, F.、Rajarathinam, Y.、Dethloff, F.、Orf, I.、Fehrle, I.、Alpers, J.、Beine-Golovchuk, O. 和 Kopka, J. (2020 ）。使用气相色谱法与质谱联用来识别温度调节的初级代谢物的多重分析和数据处理方法。 Hincha, DK 和 Zuther, E.（编辑）《分子生物学方法》。施普林格美国，203-239。https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0660-5_15
Bowman, JC、Petrov, AS、Frenkel-Pinter, M.、Penev, PI 和 Williams, LD (2020)。树的根源：核糖体的意义、进化和起源。化学。启示录120(11)：4848–4878。https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.9b00742
Woese, CR、Kandler, O. 和 Wheelis, ML (1990)。迈向有机体的自然系统：古细菌、细菌和真核生物领域的提案.. Proc。国家。阿卡德。科学。美国87(12)：4576–4579。https://doi.org/10.1073/pnas.87.12.4576
Woese, CR 和 Fox, GE (1977)。原核域的系统发育结构：主要界。过程。国家。阿卡德。科学。美国74(11)：5088–5090。https://doi.org/10.1073/pnas.74.11.5088
Ciccarelli, FD、Doerks, T.、von Mering, C.、Creevey, CJ、Snel, B. 和 Bork, P. (2006)。走向自动重建高度解析的生命树。科学311（5765）：1283–1287。https://doi.org/10.1126/science.1123061
Fournier, GP 和 Gogarten, JP (2010)。核糖体生命之树生根。摩尔。生物。进化。 27（8）：1792-1801。https://doi.org/10.1093/molbev/msq057
Bernier, CR、Petrov, AS、Kovacs, NA、Penev, PI 和 Williams, LD (2018)。翻译：生命的普遍结构核心。摩尔。生物。进化。 35(8)：2065–2076。https://doi.org/10.1093/molbev/msy101
Charlebois, RL 和 Doolittle, WF (2004)。计算原核基因的普遍性：拯救核心免于灭绝。基因组研究。 14（12）：2469-2477。https://doi.org/10.1101/gr.3024704
Harris, JK、Kelley, ST、Spiegelman, GB 和 Pace, NR (2003)。宇宙祖先的遗传核心。基因组研究。 13（3）：407-412。https://doi.org/10.1101/gr.652803
库宁，EV (2003)。比较基因组学、最小基因集和最后的普遍共同祖先。纳特。微生物学牧师。 1（2）：127-136。https://doi.org/10.1038/nrmicro751
Martinez-Seidel, F.、Beine-Golovchuk, O.、Hsieh, YC 和 Kopka, J. (2020)。植物核糖体异质性和专业化的系统评价。正面。植物科学。 11：e00948。https://doi.org/10.3389/fpls.2020.00948
Genuth, NR 和 Barna, M. (2018)。核糖体异质性的发现及其对基因调控和生物体生命的影响。摩尔。单元格71(3)：364-374。https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.07.018
Shi, Z.、Fujii, K.、Kovary, KM、Genuth, NR、Röst, HL、Teruel, MN 和 Barna, M. (2017)。异质核糖体优先翻译全基因组范围内不同的 mRNA 子池。摩尔。单元格67(1)：71–83.e7。https://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.05.021
Ferretti, MB、Ghalei, H.、Ward, EA、Potts, EL 和 Karbstein, K. (2017)。 Rps26 通过识别 Kozak 序列元件来指导 mRNA 特异性翻译。纳特。结构。摩尔。生物。 24（9）：700-707。https://doi.org/10.1038/nsmb.3442
Siodmak, A.、Martinez-Seidel, F.、Rayapuram, N.、Bazin, J.、Alhoraibi, H.、Gentry-Torfer, D.、Tabassum, N.、Sheikh, AH、Kise, JKG、Blilou, I .，等人。（2023）。拟南芥免疫信号中核糖体组成和核糖体蛋白磷酸化的动态。核酸研究。 51（21）：11876-11892。https://doi.org/10.1093/nar/gkad827
Martinez-Seidel, F.、Hsieh, YC、Walther, D.、Kopka, J. 和 Pereira Firmino, AA (2021b)。 COSNet i：ComplexOme-Structural Network Interpreter，用于研究后生动物核糖体的空间富集。BMC 生物信息学22(1): 605-605。https://doi.org/10.1186/s12859-021-04510-z
康涅狄格州查萨皮斯 (2019)。在结构生物学和基于网络的系统生物学之间架起桥梁。摩尔。生物技术。 61（3）：221-229。https://doi.org/10.1007/s12033-018-0146-8
Smirnova, J.、Loerke, J.、Kleinau, G.、Schmidt, A.、Bürger, J.、Meyer, EH、Mielke, T.、Scheerer, P.、Bock, R.、Spahn, CMT 等。（2023）。主动翻译植物 80S 核糖体的结构，分辨率为 2.2 Å。纳特。植物9(6)：987–1000。https://doi.org/10.1038/s41477-023-01407-y
Matsuo, Y.、Tesina, P.、Nakajima, S.、Mizuno, M.、Endo, A.、Buschauer, R.、Cheng, J.、Shounai, O.、Ikeuchi, K.、Saeki, Y.、等人。（2020）。 RQT 复合物解离内源 RQC 底物 SDD1 上碰撞的核糖体。纳特。结构。摩尔。生物。 27（4）：323-332。https://doi.org/10.1038/s41594-020-0393-9
Flis, J.、Holm, M.、Rundlet, EJ、Loerke, J.、Hilal, T.、Dabrowski, M.、Bürger, J.、Mielke, T.、Blanchard, SC、Spahn, CM 等。（2018）。真核 80S 核糖体的 tRNA 易位和 GTP 水解的影响。细胞报告25(10)：2676–2688.e7。https://doi.org/10.1016/j.celrep.2018.11.040
Fernie, AR 和 Stitt, M. (2012)。关于代谢组学与蛋白质组学和转录组学的不一致：应对逻辑、化学和网络交互科学信函日益复杂的问题。植物生理学。 158（3）：1139-1145。https://doi.org/10.1104/pp.112.193235
van de Waterbeemd, M.、Tamara, S.、Fort, KL、Damoc, E.、Franc, V.、Bieri, P.、Itten, M.、Makarov, A.、Ban, N.、Heck, AJR,等人。（2018）。使用先进的混合质谱方法解剖整个生命王国的核糖体颗粒。纳特。交流。 9(1)：e1038/s41467–018–04853–x。https://doi.org/10.1038/s41467-018-04853-x
Ingolia, NT、Brar, GA、Rouskin, S.、McGeachy, AM 和 Weissman, JS (2012)。通过对核糖体保护的 mRNA 片段进行深度测序来监测体内翻译的核糖体分析策略。纳特。协议。 7（8）：1534-1550。https://doi.org/10.1038/nprot.2012.086
Ting, MKY、Gao, Y.、Barahimipour, R.、Ghandour, R.、Liu, J.、Martinez-Seidel, F.、Smirnova, J.、Gotsmann, VL、Fischer, A.、Haydon, MJ 等等人。（2023）。植物核糖体分析指南，包括 rRNA 片段的结构分析。BioRxiv：e567332。https://doi.org/10.1101/2023.11.16.567332
Batth, TS、Tollenaere, M.、Rüther, P.、Gonzalez-Franquesa, A.、Prabhakar, BS、Bekker-Jensen, S.、Deshmukh, AS 和 Olsen, JV (2019)。微粒上的蛋白质聚集捕获可实现多用途蛋白质组学样品制备*。摩尔。细胞。蛋白质组学18(5)：1027a–1035。https://doi.org/10.1074/mcp.tir118.001270
Hughes, CS、Moggridge, S.、Müller, T.、Sorensen, PH、Morin, GB 和 Krijgsveld, J. (2018)。用于蛋白质组学实验的单锅固相增强样品制备。纳特。协议。 14（1）：68-85。https://doi.org/10.1038/s41596-018-0082-x
Moggridge, S.、Sorensen, PH、Morin, GB 和 Hughes, CS (2018)。扩展蛋白质组学 SP3 顺磁珠处理方法的兼容性。J.蛋白质组研究。 17（4）：1730-1740。https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.7b00913
Martinez-Seidel, F.、Beine-Golovchuk, O.、Hsieh, YC、Eshraky, KE、Gorka, M.、Cheong, BE、Jimenez-Posada, EV、Walther, D.、Skirycz, A.、Roessner, U .，等人。（2021）。空间丰富的旁系同源重排认为功能多样化的核糖体在拟南芥冷驯化过程中出现。国际。 J.莫尔。科学。 22（11）：6160。https://doi.org/10.3390/ijms22116160
Martinez-Seidel, F.、Suwanchaikasem, P.、Nie, S.、Leeming, MG、Pereira Firmino, AA、Williamson, NA、Kopka, J.、Roessner, U. 和 Boughton, BA (2021)。膜富集的蛋白质组学将核糖体积累和蛋白质组重编程与大麦根分生组织的冷驯化联系起来。正面。植物科学。 12：e656683。https://doi.org/10.3389/fpls.2021.656683
Figueroa, NE、Franz, P.、Luzarowski, M.、Martinez-Seidel, F.、Moreno, JC、Childs, D.、Ziemblicka, A.、Sampathkumar, A.、Andersen, TG、Tsiavaliaris, G. 等等人。（2023）。 3',5'-cAMP 的蛋白质相互作用组揭示了其在调节肌动蛋白细胞骨架中的作用。植物杂志115(5): 1214–1230。https://doi.org/10.1111/tpj.16313
Poorter, H.、Niinemets, à、Ntagkas, N.、Siebenkäs, A.、Mäenpää, M.、Matsubara, S. 和 Pons, T. (2019)。对植物对光强度的反应进行荟萃分析，涉及从分子到整个植物性能的 70 种性状。新植醇。 223（3）：1073-1105。https://doi.org/10.1111/nph.15754
Hunt, R. 和 Cornelissen, J. (1997)。 59 种温带植物的相对生长速率的组成部分及其相互关系。新植醇。 135（3）：395-417。https://doi.org/10.1046/j.1469-8137.1997.00671.x
费舍尔，RA (1921)。对最近一篇关于“植物生长的定量分析”的文章中制定的方法的一些评论。安.应用。生物。 7（4）：367-372。https://doi.org/10.1111/j.1744-7348.1921.tb05524.x
布莱克曼，VH (1919)。复利定律和植物生长。安.机器人。 33（131）：353-360。https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.aob.a089727
Gupta, S.、Rupasinghe, T.、Callahan, DL、Natera, SHA、Smith, PMC、Hill, CB、Roessner, U. 和 Boughton, BA (2019)。通过 MALDI-MSI 和 µ-XRF 光谱法对发芽初期盐胁迫大麦种子的时空代谢和元素分析。正面。植物科学。 10：e01139。https://doi.org/10.3389/fpls.2019.01139
Cheong, BE、Beine-Golovchuk, O.、Gorka, M.、Ho, WWH、Martinez-Seidel, F.、Firmino, AAP、Skirycz, A.、Roessner, U. 和 Kopka, J. (2020)。拟南芥 REI-LIKE 蛋白在冷驯化过程中激活核糖体生物发生。科学。报告11(1)：1-25。https://doi.org/10.1101/2020.02.18.954396
Firmino, AAP、Gorka, M.、Graf, A.、Skirycz, A.、Martinez-Seidel, F.、Zander, K.、Kopka, J. 和 Beine-Golovchuk, O. (2020)。植物叶绿体和细胞质核糖体的分离和配对蛋白质组分析。植物9(7)：892。https://doi.org/10.3390/plants9070892
Deutsch, EW、Bandeira, N.、Sharma, V.、Perez-Riverol, Y.、Carver, JJ、Kundu, DJ、García-Seisdedos, D.、Jarnuczak, AF、Hewapathirana, S.、Pullman, BS 等等人。（2019）。 2020 年 ProteomeXchange 联盟：在蛋白质组学中实现“大数据”方法。核酸研究。 48(D1)：D1145-D1152。https://doi.org/10.1093/nar/gkz984
Perez-Riverol, Y.、Csordas, A.、Bai, J.、Bernal-Llinares, M.、Hewapathirana, S.、Kundu, DJ、Inuganti, A.、Griss, J.、Mayer, G.、Eisenacher,金属。（2018）。 2019年PRIDE数据库及相关工具和资源：改进对量化数据的支持。核酸研究。 47：D442–D450。https://doi.org/10.1093/nar/gky1106

补充资料

可以在此处下载以下支持信息：

补充表1。元信息和分析用于推导 Lys-C 或胰蛋白酶产生的平均肽长度的差异，就像在硅蛋白酶中消化整个生命树的特征核糖体蛋白质组一样。 At =拟南芥，Sc =酿酒酵母，Hs =智人，Ec =大肠杆菌。选项卡 A 包含精心策划的核糖体蛋白质组的 FASTA 序列。选项卡 B 包含使用 lys-C 对选项卡 A 中的蛋白质组进行计算机消化的结果，并由此获得 200 至 6000 道尔顿之间的肽单同位素质量。选项卡 C 包含与选项卡 B 相同的内容，但使用胰蛋白酶作为蛋白酶（无 P 作为消化规则）。表 D 包含两种消化的比较结果，即 Log ₂倍变化和每个蛋白质条目的肽平均长度的P _adj值。
补充表2。使用 BCA 试剂盒测定实验样品中的蛋白质含量，并随后在大肠杆菌对照核糖体中进行核糖体蛋白质组分析。选项卡 A 包含执行的测量。选项卡 B1 和 B2 分别包含来自 UniProt 的完整且经过审查的大肠杆菌核糖体蛋白质组。选项卡 C 包含 MaxQuant 搜索的输出 ProteinGroups 文件，使用 SwissProt大肠杆菌核糖体蛋白质组作为 FASTA 目标。选项卡 D 包含所有核糖体蛋白的丰度及其图形分析。
补充文件 1。 ProtSynthesis 包版本 0.1.0 中概述的函数和方法的 R 文档。该文档在安装后会自动保存到您的 R 库中，并且可以通过 R 控制台中包的特定功能的帮助调用来访问。要安装该软件包，请访问 GitHub 中的本地存储库 ( https://github.com/MSeidelFed/ProtSynthesis )。
补充文件 2。开发 R 包 ProtSynthesis 的完整使用示例，以获得 Martinez-Seidel 等人 (2022) 的结果。补充数据也可用于独立运行相同的示例，并且可以在安装 R 包后通过 ext_data 方法访问。 .html 文件中的嵌入图像需要网络连接才能显示，因为它们的路径是 GitHub 中 R 包的本地存储库 ( https://github.com/MSeidelFed/ProtSynthesis )。