材料与试剂

生物材料

70%–80% 汇合的 HeLa 细胞 (ATCC)

注意：我们使用 HeLa 细胞进行此分析，因为它们易于转染，并且对于内体运动的 2D 分析而言相当平坦；然而，也可以使用其他细胞系。

试剂

质粒CD8α-CI-M6PR-pIRES Neo2（Matthew Seaman教授赠送）
Gibco ^TM Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM)，高葡萄糖，含 GlutaMAX ^TM、丙酮酸钠（Thermo Fisher Scientific，目录号：10569-010），储存：2–8 °C
杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水 (DPBS)，不含钙和镁（Lonza Bioscience，目录号：17-512F），储存：15–30 °C
Opti-MEM ^®低血清培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11058021），储存：2–8 °C
热灭活胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10082147），储存：-20°C
抗生素抗真菌剂（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15240-062），储存：-20 °C
Gibco ^TM 1 M HEPES（Thermo Fisher Scientific，目录号：15630-080），储存：2–8 °C
Gibco ^TM 100× MEM 非必需氨基酸溶液（Thermo Fisher Scientific，目录号：11140050）
Gibco ^TM DMEM，高葡萄糖，HEPES，无酚红（Thermo Fisher Scientific，目录号：21063029），储存：2–8 °C
X-tremeGENE ^TM HD 转染试剂（Roche ^® Life Science Products，目录号：6366236001）
siRNA转染试剂Dharmafect-1（GE Healthcare，目录号：T-2001-03）
小鼠抗人CD8单克隆抗体（BD Pharmingen ^TM，目录号：555631），储存：4°C
Alexa Fluor 488 缀合的山羊抗小鼠 IgG（Thermo Fisher Scientific，目录号：A11029），储存：4 °C
无水柠檬酸盐（HiMedia，目录号：GRM-1023）
柠檬酸三钠二水合物（柠檬酸三钠二水合物）（Sigma，目录号：S4641）

解决方案

柠檬酸缓冲液，pH 4.5（参见配方）

食谱

柠檬酸缓冲液，pH 4.5

试剂体积

无水柠檬酸 100毫升

二水柠檬酸三钠 100毫升

全部的 200毫升

0.1 M 无水柠檬酸

试剂数量

无水柠檬酸 2.626克

全部的 125毫升

0.1 M 二水柠檬酸三钠

试剂数量

二水柠檬酸三钠 3.676克

全部的 125毫升

用柠檬酸钠将 pH 调节至 4.5。
完全培养基

Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM)，高葡萄糖，含 GlutaMAXTM、丙酮酸钠，辅以 10% FBS、10 mM HEPES、1× 抗生素抗真菌剂和 1× MEM 非必需氨基酸溶液

实验室用品

35 mm μ-dish，高玻璃底实时成像皿（ibidi，目录号：81158）
BD Falcon 15 mL 离心管（Corning，Falcon ^®，目录号：352096）
BD Falcon 35 mm 细胞培养皿（Corning，Falcon ^®，目录号：353001）

设备

细胞培养箱（Eppendorf，New Brunswick ^TM，型号：Galaxy®170 ^R）
共焦显微镜（蔡司，型号：LSM 710）
HulaMixer ^TM样品混合器（Thermo Fisher Scientific，目录号：15920D）

软件和数据集

斐济软件（https://imagej.net/software/fiji/）2.15.1
ZEN 软件，ZEN 2012 v. 8.0.1.273 (蔡司)

程序

实验装置

注意：该方案已从 CD8α-CI-M6PR 运输测定 [4] 修改而来，旨在评估表面标记的 CD8α-CI-M6PR 对用针对特定目标基因的 siRNA 处理的 HeLa 细胞中高尔基体的运动性。
1. 将大约 0.14 ×10 ⁶ HeLa 细胞播种在 35 mm 玻璃底实时成像皿中，并在细胞培养箱中孵育过夜。
  
  注意：对于转染，接种 0.25 × 10 ⁶ HeLa 细胞并在细胞培养箱中孵育过夜。
2. 第二天，通过在 200 μL Opti-MEM 中组合 100 nM siRNA 寡核苷酸和转染试剂 Dharmafect-1 (Dharmacon) 来制备 siRNA 转染混合物，并将混合物在室温下孵育 30 分钟。孵育后，将 siRNA 转染混合物滴加到细胞上并孵育 48 小时。
3. siRNA 处理 48 小时后，用 CD8α-CI-M6PR 转染细胞。为了准备转染混合物，将 2 μg CD8α-CI-M6PR-pIRES Neo2 质粒 DNA 以 1:1 的比例添加到 200 μL Opti-MEM 和 X-tremeGENE ^TM HD 转染试剂中（1 μg DNA：1 μL 转染液）试剂）。将转染混合物在室温下孵育 30 分钟，然后小心地将其滴加到细胞上。
4. 要荧光标记一抗，请将小鼠抗 CD8 抗体与 Alexa Fluor 488 缀合的抗小鼠 IgG 一起在 1 mL 无血清 DMEM 介质中于 4°C 下在管旋转器中孵育 30 分钟。
5. 转染 12-14 小时后，将抗 CD8α 与 Alexa Fluor 488 缀合 IgG 的复合物与活细胞成像培养皿中的细胞在冰上孵育 30 分钟，以标记表面 CD8-CI-M6PR 受体。
  
  注意：作为 Alexa Fluor 488 缀合抗体非特异性附着到质膜上的对照，使用未转染的细胞执行抗体标记和后续步骤。
6. 孵育后，小心吸出含有抗 CD8α/Alexa Fluor 488 偶联抗体复合物的 DMEM 介质。
7. 要去除任何未结合或非特异性附着的抗体，请用 DPBS 洗涤细胞一次，然后用冰冷的柠檬酸缓冲液（pH 4.5）洗涤两次。向细胞中添加约 1 mL 柠檬酸缓冲液，并在冰上孵育 5 分钟。丢弃缓冲液并用柠檬酸缓冲液重复洗涤步骤两次。最后，添加 1 mL 的 DPBS 以去除细胞中残留的柠檬酸缓冲液。
  
  注意：准备新鲜的柠檬酸缓冲液并用冰冷进行洗涤。
8. 洗涤后，在细胞上添加 2 mL 预热的不含酚红的 DMEM 培养基，并补充 10% FBS，并孵育 10 分钟。
9. 孵育后，将培养皿转移到保持在 37°C、5% CO ₂的湿润活细胞成像室中，并对显示标记的 CD8α-CI-M6PR 受体的转染细胞进行活细胞成像。 10 分钟追踪后，由于 CI-M6PR 细胞质尾部存在逆行分选信号，标记的 CD8α-CI-M6PR 受体出现在质膜上至 TGN 的运输中。
活细胞成像和视频采集
1. 使用 512 × 512 帧大小以获得更高的采集速度，并在没有任何时间间隔的情况下采集至少约 200–300 帧的细胞延时视频。
2. 在 10 分钟的追逐之后，记录标记的 CD8α-CI-M6PR 受体的视频，持续时间不超过 15 分钟，在此期间它们预计将达到 TGN。
使用 ImageJ/Fiji 进行图像分析和量化

注意：在手稿 [6] 中，我们使用半自动定制程序和 MATLAB 脚本 [7] 进行粒子跟踪分析。然而，在这个协议中，我们提出了一种使用 TrackMate 插件来分析 CD8α-CI-M6PR 颗粒的替代协议。
1. 使用 Fiji 打开视频文件。如果字段中有多个单元格，请使用 Fiji 工具面板中的徒手工具选择单个单元格。使用 Ctrl+shift+D 复制选区或转到“图像”菜单并选择“复制”选项。将出现一个弹出窗口；选择“复制堆栈”选项（图 2）。
  
  图 2. 复制视频堆栈并选择单元进行分析
2. 使用“编辑”菜单删除背景荧光。选择“清除外部”选项（图 3）。对进程堆栈选项选择“是”，允许它从所有帧中删除背景。
  
  图 3. 清除所有视频帧的外部
3. 从细胞中减去细胞质背景荧光以改善内体跟踪过程。在斐济工具栏的“处理”菜单中选择“减去背景”选项。根据视频文件中的背景荧光适当输入滚球半径值（图4）。
  
  注意：滚球半径的值应大于图像中最大的物体。
  
  图 4. 细胞中的背景扣除
4. 对视频文件执行粒子跟踪。选择插件>跟踪> TrackMate选项。将打开一个对话框，其中包含数据的空间和时间信息。它提供有关像素尺寸、帧数以及视频文件维度（2D 或 3D 延时视频）的信息。要继续跟踪，请按“下一步”按钮（图 5）。
  
  图 5. 使用 TrackMate 插件进行粒子跟踪
5. 接下来，将打开一个窗口，其中包含三个选项作为对象检测器。选择高斯差分(DoG) 检测器，旨在识别内体等圆形颗粒，对于小于 5 像素的颗粒尺寸特别有效。单击“下一步”按钮继续（图 6）。
  
  图 6.高斯差分(DoG) 检测器的选择
6. 在随后的 DoG 检测器窗口中，输入与要分析的粒子相关的一些参数的值，例如估计的斑点直径和质量阈值。对于估计的斑点直径，输入内涵体的近似直径或使用斐济的直线工具进行测量。质量阈值允许您将分析限制为特定数量的内体，排除质量低于阈值的点/内体。单击预览按钮可查看选定的内体并评估参数与数据的拟合程度。调整质量阈值以消除分析中的任何错误点强度。单击“预览”查看选定的点，并相应地调整阈值以选择所需的内体。您还可以看到为所选阈值选择的内体数量（此处以红色轮廓突出显示）（图 7）。完成调整后，转到下一个窗口。
  
  图 7.粒子的高斯 (DoG) 探测器参数差异
7. 接下来，选择 HyperStack 显示器，它允许您将最终结果覆盖在图像上（图 8）。
  
  图 8. 选择 HyperStack 显示
8. 此窗口允许您执行自动或手动阈值来选择粒子。此处选择自动。单击“下一步”（图 9）。
  
  图 9. 粒子/斑点的阈值
9. 此时，我们可以看到选择进行分析的点。我们可以运行视频并观察所有帧中移动的点。在此窗口中，您可以对点进行过滤；不过，目前我们将继续使用默认设置并单击“下一步”（图 10）。
  
  注意：您还可以根据强度、质量、粒子半径、框架或位置（X、Y）等参数过滤点，并对选择进行比较分析。
  
  图 10. 设置过滤器并选择颗粒或点进行分析
10. 现在，选择简单的 LAP（线性分配问题）跟踪器，非常适合进行布朗运动的粒子。该跟踪器通过链接视频中不同帧之间的粒子来创建轨迹（图 11）。
  
  图 11. 简单线性分配问题 (LAP) 跟踪器的选择
11. 接下来，将打开 LAP 跟踪器窗口，允许您输入粒子到粒子链接的参数。在“链接最大距离”选项中输入 2 μm ，它定义了两个帧之间链接的两个点的最大距离。将Gap-close max distance的值设置为 2 μm，这意味着它不会链接相距超过两帧的任何两个点。将间隙关闭最大帧间隙设置为 1，这是允许错过链接的最大帧差异（图 12）。
  
  图 12. 通过简单的 LAP 跟踪器链接粒子的配置
12. 下一个窗口允许对 LAP 跟踪器生成的轨迹进行可视化。单击下一步（图 13）。
  
  图 13. LAP 跟踪器生成的轨迹
13. 此窗口允许您在轨道上设置过滤器。您可以选择任何选项来查看轨迹，但在这里我们选择根据最大速度设置轨迹的颜色。单击“下一步”（图 14）。
  
  图 14. 用于轨迹可视化的滤色器
14. 下一个窗口允许进一步更改显示选项。在这里，您可以通过更改其半径来增大或减小光斑的大小。此外，您还可以更改曲目的显示。单击“下一步”按钮。将打开一个新面板，其中包含用于绘制与粒子运动相关的不同特征作为另一个函数的选项。要继续，请单击“下一步”（图 15）。
  
  图 15. 粒子和轨迹的显示选项
15. 在下一个窗口中选择“覆盖”选项，然后单击“执行”。将打开一个弹出窗口，显示帧总数。单击“确定”。您可以保存包含所有捕获轨迹的视频（图 16）。
  
  图 16. TrackMate 功能和分析
16. 要获取与粒子/点运动相关的测量值，例如距离、位移、最大速度和轨迹持续时间，请返回到“显示选项”窗口（如图 15 所示）并单击“分析”。将打开三个不同的窗口，提供与粒子运动相关的所有轨迹的定量参数信息（图 17）。
  
  图 17. 显示与粒子运动相关的不同动力学参数的轨迹分析表

数据分析

从轨迹统计文件或表中提取的数据，我们可以获得LAP跟踪器识别的所有轨迹的轨迹持续时间、位移、平均速度和最大速度等值。在视频中，随着时间的推移，我们通过链接两个点检测到大约 1,000 个轨迹。每个轨迹包含位移、持续时间和速度的值。位移表示连续帧中点之间的距离，而持续时间表示时间跨度。速度值表示为两个点之间的每个链接定义的链接速度。随后，我们可以计算并绘制不同条件或处理下的链路速度的中值、最大、最小和平均速度。分析大约 7-10 个细胞的轨迹，并根据各种处理绘制每个定量参数的值。此外，分别利用不成对的双尾学生 t 检验或方差分析 (ANOVA) 来计算两个或多个条件之间平均值差异的统计显着性。当数据近似服从正态分布并满足方差齐性等假设时，这些检验适用。对于缺乏对称性的非正态分布，使用 Mann-Whitney U 检验在两组中位数之间进行统计比较。

协议验证

该协议已在以下研究文章中使用并发表：

拉瓦特，S.等人。（2022）。 RUFY1 结合 Arl8b 并介导内体到 TGN CI-M6PR 检索，以将货物分选到溶酶体。 J.细胞生物学。（图 10，面板 D）

注意：本文使用了半自动化的自定义程序和 MATLAB 脚本 [7]，但在这里我们采用了另一种方法，使用 TrackMate 插件进行粒子分析。

致谢

作者根据之前发表的研究 [4] 改编和修改了该协议，并在最近描述的研究 [6] 中对其进行了验证。作者要感谢 Matthew Seaman 教授（英国剑桥大学）分享 CD8α-CI-M6PR 构建体。 S. Rawat 感谢大学教育资助委员会的奖学金支持。 M. Sharma 感谢生物技术部 (DBT)/惠康信托印度联盟高级奖学金 (IA/S/19/1/504270)、SERB-POWER 赠款 (SPG/2021/002790) 和 Janaki 的资助Ammal-国家女性生物科学家奖 (BT/HRD/NWBA/39/01/2018-19)。 M. Sharma 还感谢 IISER Mohali 提供的基础设施和财务支持。

利益争夺

作者声明不存在竞争的经济利益。

参考

Calcagni, A.、Staiano, L.、Zampelli, N.、Minopoli, N.、Herz, NJ、Di Tullio, G.、Huynh, T.、Monfregola, J.、Esposito, A.、Cirillo, C. 等等人。（2023）。 Batten 病蛋白 CLN3 的缺失会导致 M6PR 的错误运输和自噬溶酶体重组的缺陷。纳特。交流。 14（1）：3911。https://doi.org/10.1038/s41467-023-39643-7
Cui, Y.、Yang, Z.、Flores-Rodriguez, N.、Follett, J.、Ariotti, N.、Wall, AA、Parton, RG 和 Teasdale, RD (2021)。逆转录酶转运载体的形成被帕金森病相关的 Vps35 D620N 变体破坏。交通22(4)：123–136。https://doi.org/10.1111/tra.12779
Hirst, J.、Futter, CE 和 Hopkins, CR (1998)。 HEp-2 细胞内吞途径中甘露糖 6-磷酸受体运输的动力学：受体进入并快速离开多泡内体，而不在前溶酶体区室中积累。摩尔。生物。单元格9(4)：809–816。https://doi.org/10.1091/mbc.9.4.809
明尼苏达州西曼 (2004)。用于检索高尔基体的货物选择性内体分选需要逆转录酶。J.细胞生物学。 165（1）：111-122。https://doi.org/10.1083/jcb.200312034
McKenzie, JE、Raisley, B.、Zhou, X.、Naslavsky, N.、Taguchi, T.、Caplan, S. 和 Sheff, D. (2012)。 Retromer引导STxB和CD8-M6PR从早期到回收内体，EHD1引导STxB从回收内体到高尔基体。交通13(8)：1140–1159。https://doi.org/10.1111/j.1600-0854.2012.01374.x
Rawat, S.、Chatterjee, D.、Marwaha, R.、Charak, G.、Kumar, G.、Shaw, S.、Khatter, D.、Sharma, S.、de Heus, C.、Liv, N. ，等人。（2023）。 RUFY1 结合 Arl8b 并介导内体到 TGN CI-M6PR 检索，以将货物分选到溶酶体。J.细胞生物学。 222（1）。https://doi.org/10.1083/jcb.202108001
Mohan, N.、Sorokina, EM、Verdeny, IV、Alvarez, AS 和 Lakadamyali, M. (2019)。去酪氨酸化的微管在空间上限制溶酶体，促进溶酶体-自噬体融合。J.细胞生物学。 218（2）：632-643。https://doi.org/10.1083/jcb.201807124