材料与试剂

生物材料

人胚肾（HEK）293T细胞（ATCC，目录号：CRL-11268）
人胚胎干细胞 (hESC) [美国国立卫生研究院 (NIH) 注册号：WIBR-2, #29]
小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）（ATCC NIH3T3，目录号：CRL-1658或来自其他实验室）
Stbl3化学感受态细胞（Invitrogen，目录号：C737303）
pgRNA 修饰（Addgene，目录号：84477）
Fuw-dCas9-Tet1-P2A-BFP（Addgene，目录号：108245）
Fuw-dCas9-dTet1-P2A-BFP（Addgene，目录号：108246）
PiggyBac 转座酶（实验室库存，可根据要求提供）
PiggyBac 转座子载体上的 dCas9-Tet1（实验室库存，可根据要求提供）
pCMV-dR8.74（Addgene，目录号：22036）
pCMV-VSVG（Addgene，目录号：8454）

试剂

DNA 寡核苷酸（Eton Bioscience，定制订单）
T4连接酶及其缓冲液（New England Biolabs，目录号：M0202）
T4多核苷酸激酶（PNK）（New England Biolabs，目录号：M0201）
AarI 酶（Thermo Scientific，目录号：ER1581）
琼脂糖（Fisher Scientific，目录号：BP1356-500）
Zymoclean 凝胶 DNA 回收试剂盒（Zymo Research，目录号：D4007）
SOC 培养基（Invitrogen，目录号：15544034）
mTeSR1 培养基（Stemcell，目录号：85850）
LB Broth，Miller（Fisher Scientific，目录号：BP1426-500）
琼脂（Fisher Scientific，目录号：BP1423-500）
羧卞西林二钠盐（Sigma Aldrich，目录号：C1389）
EZNA 质粒迷你试剂盒 I（Omega Biotek Inc，目录号：D6943）
EZNA 质粒迷你试剂盒 II（Omega Biotek Inc，目录号：D6945）
ZymoPURE II 质粒纯化试剂盒，Maxiprep（Zymo Research，目录号：D4203）
X-tremeGENE DNA 转染试剂（Sigma Aldrich，目录号：06365787001）
Opti-MEM I 减少血清培养基（Gibco，目录号：11058021）
DMEM，高葡萄糖（Gibco，目录号：11095092）
胎牛血清（FBS）（Gibco，目录号：10082-147）
200 mM L-谷氨酰胺（Gibco，目录号：25030081）
MEM非必需氨基酸溶液，100×（Gibco，目录号：11140076）
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）（Gibco，目录号：15140122）
胰蛋白酶-EDTA（0.25％），酚红（Gibco，目录号：25200056）
DMEM/F12 培养基（Invitrogen，目录号：11320-033）
敲除血清替代品（Invitrogen，目录号：10828028）
β-巯基乙醇（Life Tech，目录号：21985023）
成纤维细胞生长因子2（FGF2）（Gibco，目录号：PHG0263）
不含钙和镁的磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Gibco，目录号：10010023）
牛血清白蛋白（BSA）组分 V 溶液（7.5%）（Gibco，目录号：15260037）
0.5 M EDTA，pH 8.0（Invitrogen，目录号：15575038）
1 M HEPES（Hyclone，目录号：SH30237.01）
DNeasy 血液和组织套件（Qiagen，目录号：69504）
QIAamp DNA 微型试剂盒（Qiagen，目录号：56304）
EZ DNA 甲基化-Gold 试剂盒（Zymo Research，目录号：D5006）
PyroMark PCR Master Mix 试剂盒（Qiagen，目录号：978703）
PyroMark Q48 高级 CpG 试剂（4 × 48）（Qiagen，目录号：974002）
岩石抑制剂（Sigma-Aldrich，目录号：S4317）
强力霉素（Sigma-Aldrich，目录号：D9891）

解决方案

HEK293T 细胞培养基（参见食谱）
hESC 培养基（参见食谱）
FACS 缓冲液（参见配方）

食谱

HEK293T细胞培养基

试剂	最终浓度	体积
DMEM培养基	不适用	435毫升
胎牛血清	10%	50毫升
200 mM L-谷氨酰胺	2毫米	5毫升
非必需氨基酸	1%	5毫升
青霉素-链霉素	1%（100单位/毫升）	5毫升
全部的	不适用	500毫升

人胚胎干细胞培养基

试剂	最终浓度	数量或体积
DMEM/F12 培养基	不适用	385毫升
胎牛血清	15%	75毫升
敲除血清替代品	5%	25毫升
200 mM L-谷氨酰胺	2毫米	5毫升
非必需氨基酸	1%	5毫升
青霉素-链霉素	1%（100单位/毫升）	5毫升
β-巯基乙醇	0.1毫摩尔	0.5毫升
成纤维细胞生长因子2	4纳克/毫升	2微克
全部的	不适用	500毫升

流式细胞仪缓冲液

试剂	最终浓度	体积
公共广播公司	不适用	142.62 毫升
7.5% 牛血清白蛋白	0.5%	5毫升
0.5 M乙二胺四乙酸	0.5毫米	150微升
1M HEPES	15毫米	2.25毫升
全部的	不适用	150毫升

实验室用品

1.5 mL 微量离心管（Axygen，目录号：MCT-175-C）
PCR 管（Axygen，目录号：PCR-0208-CP-C）
12孔板（Corning，目录号：3513）
96孔板（Corning，目录号：3596）
T-175 烧瓶（Corning，目录号：431080）
0.22 μm 过滤器（康宁，目录号：430513）
0.45 μm 低蛋白结合过滤器（Thermo Scientific，目录号：121-0045）
超速离心管（Beckman Coulter，目录号：344058）
0.4 cm 电穿孔比色皿（Bio-Rad，目录号：1652081）

设备

热循环仪（Applied Biosystem，ProFlex）
PyroMark Q48 Autoprep 测序仪（Qiagen，目录号：9002471）
Bio-Rad 基因脉冲发生器 Xcell 电穿孔系统（Bio-Rad，目录号：1652660）
FACSAria 细胞分选仪（BD，型号：BD FACSAria™ II）
荧光显微镜（尼康，型号：Eclipse TS2R）
离心机（Qiagen，型号：5810，带转子 A-2-DWP-AT）
超速离心机和转子（Beckman，型号：SW32Ti）

软件和数据集

PyroMark 检测设计（版本 2.0.2，2024 年 1 月 10 日）
PyroMark Q48 Autoprep（版本 4.3.3，2024 年 1 月 10 日）

程序

鉴定 sgRNA 靶序列并克隆到 sgRNA 支架结构中

靶向区域通常在给定基因的 CpG 岛 (CGI) 内选择，或者在不同细胞类型或条件之间选择感兴趣的差异甲基化区域 (DMR)，这些细胞类型或条件由公开可用的数据库确定或通过实验确定。
根据以下准则设计用于靶向 dCas9-Tet1 的 sgRNA 原型间隔序列：
1. 该序列应紧邻原型间隔子相邻基序 (PAM)，对于我们系统中使用的 dSpCas9，其为 5'-NGG-3'。请勿将 PAM 序列作为目标序列的一部分。
2. 长度通常为 20 nt，但也可以短至 17 nt。
3. 避免与 CpG 位点重叠，因为这样可以保护它们不被去甲基化。
4. 在大多数情况下，具有单个 sgRNA 的 dCas9-Tet1 的平均有效范围是下游 PAM 序列的 150-200 bp。可以设计多个原型间隔区序列以靶向靶向区域内尽可能多的CpG位点。
5. 我们根据目标区域内 NGG PAM 的可用性设计所有可能的 sgRNA，然后通过在线设计程序运行这些 sgRNA，例如 CRISPick ( https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public ) 和 Off-Spotter ( https) ://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/）通过 CRISPRa 模式挑选出具有高命中分数和较低脱靶预测的结果。
对于每个 sgRNA，合成两个带有突出端的寡核苷酸，以与 sgRNA 主链结构兼容。突出序列特定于所使用的 sgRNA 支架构建体。这里以我们实验室常用的（pgRNA 修饰）为例。

sgRNA 有义：5'-TTGG(G)-N ₁_N 2 _N 3 _N 4 _N 5 _N 6 _N 7 _N 8 _N 9 _N 10 _N 11 _N 12 N ₁₃ N ₁₄ N ₁₅ N ₁₆ N ₁₇ N ₁₈ N ₁₉ N ₂₀ -3'

sgRNA-反义：5'-AAAC-N* ₂₀ N* ₁₉ N* ₁₈ N* ₁₇ N* ₁₆ N* ₁₅ N* ₁₄ N* 13 N* ₁₂ N* ₁₁ N* ₁₀ N* ₉ N* ₈_N * ₇ N* ₆ N* ₅ N* ₄ N* ₃ N* ₂ N* ₁ -(C)-3' （N _x和 N* _x互补）

将原型间隔序列克隆到 sgRNA 支架结构中。

寡核苷酸磷酸化和退火。在冰上的 PCR 管中设置以下反应（表 1）：

表 1. 寡核苷酸磷酸化和退火反应

试剂	数量
sgRNA 正义寡核苷酸 (100 μM)	1微升
sgRNA-反义寡核苷酸 (100 μM)	1微升
10× T4 连接缓冲液	1微升
无核酸酶水	6.5微升
T4 PNK	0.5微升
全部的	10微升

使用以下程序在热循环仪中孵育（表 2）：

表 2. 寡核苷酸磷酸化和退火反应的热循环条件

温度（°C）	期间
37	30分钟
95	5分钟
以 1 °C/min 的速度降温至 25 °C
4	无穷大

在无核酸酶水中按 1:50 稀释磷酸化和退火的寡聚双链体。退火的寡核苷酸可以储存在 -20 °C 下，并且在至少 2-3 个冻融循环中保持稳定。

通过限制性内切核酸酶 AarI 消化线性化 sgRNA 支架载体。在冰上微量离心管中的 PCR 管中设置以下反应（表 3）：

表 3. 通过 AarI 消化对 sgRNA 支架载体进行线性化的反应

试剂	数量
pgRNA 修饰（质粒 DNA）	1微克
10× AarI 缓冲液	2微升
50× 寡核苷酸 (0.025 mM)	0.4微升
无核酸酶水	高达 30 μL
阿尔I	1微升
全部的	30微升

37°C 孵育 1 小时。使用 Zymoclean Gel DNA Recovery 试剂盒对消化的质粒进行凝胶纯化并测定浓度。

使用标准 T4 连接酶反应将退火的寡双链体与原型间隔序列连接到消化的 sgRNA 支架结构。在 PCR 管或冰上的微量离心管中进行以下反应（表 4）：

表 4. 将退火的磷酸化寡核苷酸连接至 sgRNA 支架载体的反应

试剂	数量
稀释的磷酸化和退火寡聚双链体	1微升
AarI 消化的 pgRNA 修饰的 DNA	50纳克
10× T4 连接缓冲液	1微升
无核酸酶水	高达 10 μL
T4连接酶	1微升
全部的	10微升

室温孵育 30 分钟或 16 °C 过夜，然后在 65 °C 热灭活 10 分钟。在冰上冷却连接反应。

将连接产物转化至 Stbl3大肠杆菌细胞。
1. 在冰上解冻 Stbl3 感受态细胞。
2. 无菌添加 5 μL 连接反应液至 20 μL 感受态细胞中。
3. 在冰上孵育 30 分钟。
4. 42°C 热激 45 秒。
5. 立即将细胞置于冰上 2-3 分钟。
6. 添加 250 μL SOC 介质。 37°C 摇动 1 小时。
7. 将 100 μL 涂在含有羧苄青霉素的 LB 琼脂平板上。翻转板并在 37°C 下孵育过夜。
构建验证和放大。
1. 为每个 sgRNA 构建体挑选 2-3 个克隆，并将它们在 2 mL 含有羧苄青霉素的 LB 培养基中在 37°C 下摇动过夜进行繁殖。
2. 使用 Omega EZNA Plasmid Mini 试剂盒 I 或 II 并按照制造商的说明提取质粒 DNA。提交样本进行桑格测序。以下寡核苷酸可用作测序引物来读出每个克隆的最终原型间隔区序列：5'-GAAACTCACCCTAACTG-3'。

将编码 dCas9-Tet1 和 sgRNA 的构建体递送至感兴趣的细胞中

考虑到不同细胞类型接受外源基因的能力不同，我们将描述三种最常用的基因递送方法：1）化学瞬时转染（以HEK293T细胞为例）； 2）电穿孔（以hESCs为例）； 3) 慢病毒转导（以 hESC 和 hESC 衍生的神经元为例）。这三种方法可以推广到任何其他组织培养，尽管可能需要优化反应条件才能实现最佳性能。
1. HEK293T 细胞的化学瞬时转染
  
  _{HEK293T 细胞在 37 °C、5% CO 2}下维持在 HEK293T 细胞培养基（参见配方 1）中。使用 X-tremeGENE 9 DNA 转染试剂在 12 孔板中进行 HEK293T 细胞的化学瞬时转染实验。
  1. 转染前 24 小时，将大约 1 × 10 ⁵至 2 × 10 ^{5 个}细胞/孔放入无菌 12 孔板中。确保转染时细胞处于最佳浓度（50%–80% 汇合）。
  2. 转染前，将转染试剂、还原血清培养基（Opti-MEM I 还原血清培养基）和质粒 DNA 置于室温。
  3. 将 700 ng 编码 dCas9-Tet1 (Fuw-dCas9-Tet1-P2A-BFP) 的质粒 DNA 和 300 ng 编码目标 sgRNA 的质粒 DNA 添加到无菌微量离心管中，并涡旋以充分混合。此外, 准备 dCas9 催化死亡 Tet1 (Fuw-dCas9-dTet1-P2A-BFP) + 目标 sgRNA, 和 dCas9-Tet1 + 扰乱 sgRNA 混合物作为实验对照组。蓝色荧光蛋白（BFP）基因与dCas9-Tet1或dCas9-dTet1共表达，嘌呤霉素抗性基因和编码红色荧光蛋白mCherry的基因与sgRNA共表达。
  4. 对于每个实验组，将 3 μL 转染试剂（转染试剂：DNA 比例 = 1:3）添加到 100 μL Opti-MEM I 减少血清培养基中。室温孵育 5 分钟。
  5. 添加质粒 DNA 混合物。用移液器充分混合。室温孵育 15 分钟。
  6. 将转染复合物逐滴添加到细胞中。轻轻摇动或旋转板以确保均匀分布在整个孔中。
  7. 转染后四十八小时，分离成功转染的细胞。
    1. 用胰蛋白酶/EDTA 解离细胞：除去并丢弃培养基。用 PBS 清洗细胞一次。将 300 μL 预热的胰蛋白酶/EDTA 溶液添加到每个孔中，并在 37°C 下孵育 5 分钟或直至细胞分离。
    2. 添加 600 μL 预热的生长培养基以灭活胰蛋白酶。通过移液器轻轻地分散培养基并将细胞悬浮液转移至试管中。
    3. 在室温下以 250× g旋转 5 分钟。取出并丢弃上清液。
    4. 通过在 FACS 缓冲液中重悬细胞沉淀来制备单细胞悬浮液。
    5. 执行 FACS 以分离活 BFP 和 mCherry 双阳性细胞。
    6. 将细胞分选到平板中，并在相同条件下再培养 3-5 天。
  8. 转染后五到七天，收获细胞用于进一步分析。
2. hESC 电穿孔
  
  hESC 可以使用 mTeSR1 培养基保存在 Matrigel 包被的板上，也可以保存在使用标准 hESC 培养基的辐照 MEF 上（参见配方 2）。使用 Bio-Rad Gene Pulser Xcell 电穿孔仪进行电穿孔。为了便于实验，我们通常使用PiggyBac转座子系统来创建稳定的细胞系。
  1. 电穿孔前一天，对于每个实验组，用含有 Rock 抑制剂 (10 μM) 的培养基喂养汇合的 hESC 6 孔板。
  2. 制备单细胞悬液：
    1. 除去培养基并用PBS洗涤一次。
    2. 向每个孔中添加 1 mL Accutase。 37°C 孵育 5 分钟。
    3. 通过轻轻移液分离细胞来收获细胞，并用补充有 Rock 抑制剂的 1 mL hESC 培养基收集。
    4. 以 250× g将细胞旋转5 分钟。
    5. 用冰上预冷的 450 μL PBS 重悬细胞沉淀，使最终体积为 500 μL。
  3. 在无菌微量离心管中，添加 11 μg 编码 PiggyBac 转座酶的质粒 DNA 和 33 μg 编码 dCas9-Tet1 并靶向 sgRNA 的质粒 DNA。添加 PBS 至 300 μL，涡旋充分混合。此外，准备 dCas9-dTet1 + 目标 sgRNA 和 dCas9-Tet1 + 扰乱 sgRNA 混合物作为实验对照组。 dCas9-Tet1/dTet1 受 TRE3G 启动子控制，在存在反向四环素控制反式激活因子 (rtTA) 的情况下，添加多西环素 (Dox) 可以诱导其表达。该质粒还含有编码rtTA 的组成型表达基因和选择标记（例如，用于嘌呤霉素选择的PuroR）。
  4. 进行电穿孔：
    1. 对于每个实验组，在冰上预冷电穿孔比色皿。
    2. 将 DNA 混合物添加到单细胞悬液中，轻轻移液以充分混合。
    3. 将总共 800 μL 混合物转移至预冷的 0.4 cm 电穿孔比色皿中。
    4. 将比色皿置于冰上 5 分钟。
    5. 将比色皿按所需方向放入腔室中。使用以下设置进行电穿孔：
      
      指数设置
      
      电压=250V
      
      电容=500μF
      
      电阻=无穷大
      
      比色皿 = 4 毫米
      
      预期时间为 12–14 µs 的一个脉冲
    6. 将比色皿置于冰上 5 分钟。
    7. 将比色皿中经过处理的细胞接种到装有含有 Rock 抑制剂的培养基的 6 孔板中。
  5. 将细胞保持在含有 Rock 抑制剂的培养基中。
  6. 电穿孔三天后，改用不含 Rock 抑制剂的标准培养基。
  7. 第二天，添加选择化学物质（例如，对于接受具有 PuroR 基因的构建体的细胞，添加嘌呤霉素）。
  8. 保持选择较长时间，直到形成可见的集落。在此过程中每天更换介质。
  9. 添加 Dox 以诱导 dCas9-Tet1/dTet1 的表达 5-7 天，并收获细胞用于进一步分析。
3. hESC 和神经元的慢病毒转导
  1. 慢病毒包装：
    1. _{HEK293T 细胞在 37 °C、5% CO 2}下维持在 HEK293T 细胞培养基（参见配方 1）中。尽早通过是首选。
    2. 转染前一天，在每个 T-175 烧瓶中接种约 800 万个细胞，并为每个构建体接种两个烧瓶。确保转染时细胞处于最佳浓度（70%–80% 汇合）。
    3. 转染前，将转染试剂、还原血清培养基和质粒 DNA 置于室温。
    4. 将 28 μg pCMV-dR8.74 质粒 DNA、4.7 μg pCMV-VSVG 质粒 DNA 和 37.3 μg dCas9-Tet1/dTet1 或 19 μg sgRNA 质粒 DNA 添加到无菌微量离心管中，并涡旋充分混合。
      
      注意：所有质粒DNA均应使用无内毒素的Maxi-prep试剂盒（例如，ZymoPURE II质粒纯化试剂盒，Maxiprep）制备。
    5. 对于每个构建体，将 210 μL 转染试剂添加到 5 mL Opti-MEM I 减少血清培养基中。室温孵育 5 分钟。
    6. 添加预混合的质粒 DNA。充分混合。室温孵育 15 分钟。
    7. 以逐滴方式将转染复合物添加到细胞中（2.5 mL/烧瓶）。轻轻摇动或旋转板以确保均匀分布在整个烧瓶上。
    8. 第二天，换成新鲜培养基。从现在开始，考虑到与细胞接触的所有东西都含有传染性的慢病毒颗粒。使用有关 PPE、塑料器具和介质净化等的 BSL2 安全协议。
    9. 更换培养基两天后，收获培养基并更换新鲜培养基。将收集的介质储存在 4°C 下。
    10. 第一次培养基收集后两天，收获培养基。将收集的介质储存在 4°C 下。
  2. 慢病毒浓度
    1. 用带有低蛋白结合膜的 0.45 μm 过滤器过滤收集的介质。
    2. 在 4°C 下以 90,000× g旋转慢病毒1 小时 45 分钟。
    3. 丢弃上清液。每个离心管中重悬病毒沉淀于 200 μL PBS 中。
    4. 将组合病毒在 4°C 的 PBS 中旋转过夜。等分至一次性使用所需的体积，以避免冻融循环。
  3. 慢病毒滴定
    1. 提前一天在 96 孔板中播种 1 × 10 ^{4 HEK293T 细胞/孔。}
    2. 将慢病毒颗粒梯度稀释至100 μL 培养基终体积中的1:10、1:10 ²、1:10 ³、1:10 ⁴、1:10 ⁵和 1:10 ^{6 。}
    3. 应将总共 100 μL 的病毒颗粒混合物添加到每个孔中，每种病毒至少重复 3 个。
    4. 感染两天后，使用荧光显微镜对荧光阳性细胞进行计数，并选择具有适当荧光阳性比例（10%–30%阳性细胞/孔）的稀释因子。计数一式三份并平均阳性细胞数。
    5. 使用以下公式估计功能性慢病毒滴度：
      
      根据 HEK293T 细胞的感染效率计算病毒滴度 (T)，其中 T = (P*N)/(V)，T = 滴度 (TU/μL)，P = 根据荧光标记的感染阳性细胞的百分比，N = 转导时的细胞数，V = 使用的病毒总体积。
      
      注：TU 代表转导单位。
  4. 慢病毒转导：
    1. 根据细胞类型，将病毒添加到每个孔中，感染复数 (MOI) 为 10-100。对于有丝分裂后神经元，建议使用 50-100 的高 MOI 来实现高转导效率和编辑性能，而 10 的 MOI 对于 HEK293T 细胞等分裂细胞效果很好。
    2. 将细胞与病毒在 37°C 下孵育 15 分钟。
    3. 在室温下将细胞与病毒一起以 800× g旋转 1 小时（Qiagen 5810，配有转子 A-2-DWP-AT）。
    4. 孵育 24 小时，然后进行一半介质更换。
    5. 二十四小时后，进行一次完整的培养基更换。
    6. 通过 FACS 分离感染的细胞或通过化学选择消除未感染的细胞，具体取决于所用病毒载体上的选择标记。
    7. 收获细胞用于进一步分析。

通过焦磷酸测序检查编辑结果

按照制造商的说明，使用 Qiagen DNeasy 血液和组织试剂盒或 Qiagen QIAamp DNA 微试剂盒提取编辑细胞的基因组 DNA。
按照制造商的说明，使用 EZ DNA 甲基化-Gold 试剂盒对基因组 DNA 进行亚硫酸氢盐转化。未甲基化的胞嘧啶 (C) 在亚硫酸氢盐转化过程中转化为尿嘧啶，在 PCR 扩增过程中将被读取为胸腺嘧啶 (T)。甲基化胞嘧啶 (mC) 保持不变。
焦磷酸测序测定设计。
1. 该测定是使用 Qiagen PyroMark 测定设计软件按照软件指导进行设计的。
2. 选择没有非特异性结合的高分引物组（正向和反向 PCR 引物和测序引物）。

使用 PyroMark PCR 试剂盒通过 PCR 扩增亚硫酸氢盐转化的基因组 DNA 中感兴趣的基因组区域。在冰上设置反应（表 5）：

表 5. 焦磷酸 PCR 反应

试剂	数量
2× PyroMark PCR 预混液	12.5微升
10× CoralLoad 浓缩液	2.5微升
正向引物 (5 μM)	0.5微升
反向引物 (5 μM)	0.5
无核酸酶水	最多 25 个
亚硫酸氢盐转化的基因组 DNA	（10–20 纳克）
全部的	25微升

在热循环仪中运行以下程序（表 6）：

表 6. PCR 反应的热循环条件

步	温度。 (°C)	期间	循环次数
初始变性	98		1
变性	98	10秒	45
退火	56	30秒
扩大	72
最终延期	72		1
抓住	4	无穷大	-

取一小份 PCR 产物 (10 μL) 在琼脂糖凝胶中进行电泳。确保只有一条单一且密集的条带，其大小与预测相符。
执行焦磷酸测序以量化检测区域内每个 CpG 位点的 T:C 比率，并转换为 DNA 甲基化的百分比。
1. 按照制造商的说明，使用 PyroMark Q48 Autoprep 软件对测序运行进行编程。
2. 根据测序仪软件计算的体积，将 PyroMark Q48 高级 CpG 试剂 (4 × 48) 试剂盒提供的试剂（核苷酸、测序引物、缓冲液、底物和酶混合物）添加到试剂盒的相应孔中。将 PCR 产物装入焦磷酸测序盘的相应孔中，并将盘放入测序仪中。
3. 开始跑步。
4. 测序完成后，使用 PyroMark Q48 Autoprep 软件分析结果。

数据分析

通过焦磷酸测序对 DNA 甲基化进行分析已有报道[11,12]。我们使用 Qiagen 的 PyroMark Q48 Autoprep 软件。测序仪生成的结果文件直接由 PyroMark Q48 Autoprep 软件在默认设置下打开和分析。图 1 显示了分析小鼠 Snrpn 基因启动子区域 11 个 CpG 的典型程序。甲基化百分比显示在以蓝色突出显示的条形上方，它代表分析区域内 CpG 背景下的每个胞嘧啶。百分比的背景颜色显示软件的质量评估：蓝色表示通过QC，黄色表示检查，红色表示未通过。我们通常只使用测序质量高的（蓝色和黄色）。橙色背景的条是亚硫酸氢盐处理对照，用于评估成功的亚硫酸氢盐处理；它通常是非 CpG 环境中的胞嘧啶位点，并且已知未甲基化。由于亚硫酸氢盐转化反应成功，这种未甲基化的胞嘧啶在 PCR 后将完全转化为 T，并在焦磷酸测序中测序为 T。确保所检查的 DNA 被有效地转化为亚硫酸氢盐。

图 1. 分析小鼠 Snrpn 启动子启动子区域中 11 个胞嘧啶-磷酸-鸟苷 (CpG) 的示例程序。 y 轴显示任意单位的信号强度，而 x 轴表示分配顺序。与所测定的 CpG 的胞嘧啶相对应的分配以蓝色突出显示。各个 CpG 位点的甲基化百分比显示在相应条形上方。百分比背景颜色显示软件的质量评估：蓝色表示通过，黄色表示检查，红色表示未通过。

要检查编辑结果，请比较不同处理的样本之间具有高测序质量的 CpG 的 DNA 甲基化百分比。如果目标基因组区域被成功编辑，则来自 dCas9-Tet1 + 目标 sgRNA 处理的细胞的 CpG 的 DNA 甲基化水平应低于来自未处理细胞或 dCas9-dTet1 + 目标 sgRNA- 或 dCas9-dTet1 + 乱序 sgRNA 的 DNA 甲基化水平-处理的细胞。为了进一步检查 DNA 甲基化变化的直接结果，可能需要 RT-qPCR 和蛋白质印迹法分别量化编辑基因的 RNA 和蛋白质水平的变化。

协议验证

该协议或其部分内容已在以下研究文章中使用和验证：

钱等人[10]。 MECP2 的多重表观基因组编辑可拯救 Rett 综合征神经元。科学转化医学（图 1，c 组）。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

我们根据目标区域内 NGG pam 的可用性设计所有可能的 sgRNA，然后通过在线设计程序运行这些 sgRNA，例如 CRISPick ( https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public ) 和 Off-Spotter ( https) ://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/）通过 CRISPRa 模式挑选出具有高目标得分和较低脱靶预测的目标。需要考虑的两个关键点是：1）此处描述的 dCas9-Tet1 编辑窗口位于 PAM 位点下游 150-200 bp 内，2）sgRNA 靶序列内的 CpG 位点通常受到保护，免受甲基化编辑。
与经典的 CRISPR-Cas9 敲除系统中 sgRNA 总是设计在编码区内以破坏基因表达相比，建议将用于去甲基化编辑的 sgRNA 设计在转录起始位点的上游，以避免 dCas9 介导的空间阻碍和转录干扰。
为了达到最高的编辑效率，可以进行小规模筛选来测试多种sgRNA及其组合，以鉴定最有效的sgRNA。
dCas9-Tet1 的表达水平对于实现高编辑效率至关重要。 dCas9-Tet1 表达的周期对于控制脱靶效应至关重要。因此，选择合适的表达系统（诱导型或组成型）并控制编辑器（dCas9-Tet1和sgRNA）的表达时间是特异性编辑各种靶细胞中DNA甲基化的关键。
神经元中的去甲基化比分裂细胞中的去甲基化要慢。需要表达 dCas9-Tet1 和 sgRNA 的高滴度慢病毒编辑器来编辑神经元中的甲基化。为了避免慢病毒转导时神经元细胞死亡，优选高密度的神经元培养物。或者，可以在 hESC 中设计 Dox 诱导的 dCas9-Tet1 表达盒，并在神经元分化后实现神经元中 DNA 甲基化的编辑。
dCas9-Tet1 介导的去甲基化的动态很大程度上取决于细胞类型。一般来说，剪辑效果在剪辑5-7天后达到顶峰。然而，在非分裂细胞（例如有丝分裂后神经元）中，它可能会更慢，因为被动和主动去甲基化都可以在分裂细胞中进行，但只有主动去甲基化发生在不分裂的细胞中。
持续时间和可逆性是位点特异性的，并受局部染色质环境和细胞类型的影响。一般来说，编辑的DNA去甲基化可以在分裂细胞中维持，但在有丝分裂后细胞（例如神经元）中不稳定。例如，活性X染色体上的FMR1的去甲基化状态可以在体外维持数周[9]，而非活性X染色体上的MECP2的去甲基化状态在有丝分裂后神经元中并不稳定[10]。
进行慢病毒转导时，MOI 将取决于每次实验的目的和细胞系的类型。我们对有丝分裂后神经元使用较高的 MOIs（50-100），对分裂细胞（例如 HEK293）使用较低的 MOIs（大约 10）。请注意，此 MOI 基于病毒滴度 (T)，病毒滴度是根据 HEK293T 细胞的感染效率计算得出的，其中 T = (P*N)/(V)，T = 滴度 (TU/μL)，p =根据荧光标记的感染阳性细胞的百分比，N = 转导时的细胞数，V = 使用的病毒总体积。请注意，TU 代表转导单位。

故障排除

问题一：焦磷酸测序检测甲基化编辑效率较低。

可能原因：慢病毒dCas9-Tet1滴度太低，无法诱导甲基化编辑。

解决方案：通过对从转染的 HEK293T 细胞中收获的至少 38 mL 病毒上清液进行超速离心，然后在 100 μL PBS 中复溶以进行有效感染，将 dCas9-Tet1 递送到靶细胞中，以提高慢病毒 dCas9-Tet1 的滴度。

致谢

资金来自 NIH 拨款 R00MH113813 (XSL)、雷特综合症研究信托拨款 (XSL) 和哥伦比亚大学启动拨款 UR011118（JQ 和 XSL）。该协议先前在Qian 等人中进行了描述和验证。 [10]。 MECP2 的多重表观基因组编辑可拯救 Rett 综合征神经元。科学转化医学。图形摘要是使用 BioRender.com 创建的。

利益争夺

XSL 是 Epitor Therapeutics 的联合创始人。

参考

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史密斯，ZD 和迈斯纳，A. (2013)。 DNA 甲基化：在哺乳动物发育中的作用。纳特。吉内特牧师。 14（3）：204-220。https://doi.org/10.1038/nrg3354。
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