材料与试剂

生物材料

AAV-9:pGP-AAV-syn-GCaMP6s-WPRE.4.641（Vigene Biosciences，SKU BS1-NOSAAV9：美国）
AAV-5：pZac2.1 gfaABC1D-cyto-GCaMP6f（Addgene，52925，美国）
C57BL/6 小鼠（查尔斯河：英国）

试剂

异氟烷（Piramal 重症监护，目录号：2800025）
阿托品（Macarthys Laboratories Ltd.，目录号：PL01883/616R）
美洛昔康（Boehringer Ingelheim，目录号：Vm 04491/5025）
丁丙诺啡（Reckitt Benckiser，目录号：Vm 15052/4081）
Superbond 通用套件（Sun Medical Co，目录号：K058E）
PVA 胶（Hobbycraft Trading Ltd.，目录号：5672751000）或硅粘合剂（WPI，目录号：Kwik-Cast）
眼膏（Dr Gerhard Mann，目录号：MEVIS05）
润滑剂（Thornton & Ross Ltd.，目录号：24242902）
Vetscrub（NewGenn Ltd.，目录号：CD003）
70% 乙醇（VWR Chemicals，目录号：UN1170）
氯化钠（NaCl）（VWR International Ltd.，目录号：27788.297）
蒸馏水

解决方案

无菌 0.9% 盐水溶液（参见配方）

食谱

无菌 0.9% 盐水溶液

试剂最终浓度数量或体积

氯化钠 0.9% 9克

蒸馏水不适用高达 1,000 毫升

将 9 g NaCl 溶解在 600 mL 蒸馏水中，并将最终体积补足至 1 L。高压灭菌并将溶液在 15 psi 和 121 °C 下灭菌 15 分钟。

实验室用品

丁腈手套（Starlab International），高压灭菌
棉签（Dutscher，目录号：1504），高压灭菌
薄纸，高压灭菌
手术衣，高压灭菌
开销上限（Pal International Ltd.）
面罩（3M、FFP2）
手术刀刀片（Swann Morton Ltd.，目录号：BS2982）
毛细管（Drummond Scientific Company，目录号：2-000-001）
双刃刀片（Scientific Laboratory Supplies Ltd.，目录号：BH10）
强力胶（RS Components Ltd.，目录号：473-455）
钝针，24号（Becton Dickinson，目录号：MIC0067）
Eppendorf 0.2 mL PCR 管盖（Eppendorf，目录号：0030124332）
用于病毒注射的带注射器的硅胶管（Saint-Gobain Life Sciences，目录号：E-3603）
Aldasorber（Aston Pharma，目录号：AST501）
铝箔
保鲜膜

设备

nVista 落射荧光成像系统/相机（Inscopix，型号：nVista）
底板支架 (Inscopix)
带 DAC 盒的微型显微镜系统 (Inscopix)
ProView ^TM GRIN 透镜探头，直径 0.6 mm，长度约 7.3 mm（Inscopix，目录号：1050-002208）
底板（Inscopix，目录号：1050-002192）
底板盖（Inscopix，目录号：1050-002193）
手术工具（精细科学工具）
镜头支架（Inscopix，目录号：1000-004238）
带电极架的立体定位仪（Kopf，型号：940）
修剪器
带诱导室的麻醉机（VetTech Solutions Ltd.，目录号：AN003-K）
毛细管拉拔器（Sutter Instrument Co.，型号：P-97）
加热垫（梦境）
热电偶加热系统（Physitemp Instruments Inc.，目录号：TCAT-2LV）
带钻头的钻孔机（Foredom，目录号：SKU K.1070-21）
体积描记室（定制 0.5 L 有机玻璃，带进气口和排气口）
气体分析仪（Hitech Instruments，型号：GIR250）
NeuroLog 系统（数字计时器，型号：NL900D）
显微注射系统：通过将刻度玻璃移液管连接到硅管来定制，硅管的另一端连接到 1 mL 注射器。使用注射器手动控制管道中的压力，以达到所需的注射速度
手术显微镜

软件和数据集

Inscopix 数据处理软件 (IDPS)（版本 1.6.0.3225）
Inscopix 数据采集软件（2.0 版）
Spike2（8.23 版）
ANY-maze视频跟踪软件（ANY-maze：爱尔兰）

程序

下面，我们描述了病毒转染的手术方案（如果使用依赖于 cre 的 GCaMP 报告小鼠，此步骤是可选的）、GRIN 透镜的植入和基板安装。接下来是在自由活动的小鼠中进行Ca ^{2+成像和数据分析的程序。}

术前校准
1. 在病毒注射之前计算并验证注射坐标，使用荧光珠或染料注射来确认病毒注射和晶状体植入的坐标。
2. 通过注射不同浓度的病毒并对 GCaMP 表达进行成像来计算病毒滴度。
  1. 理想情况下，细胞体应表达 GCaMP，但在细胞核中不表达太多（图 1）。这对于确保核心记录实验期间病毒滴度不会太低（因为它不会给出足够的信号）也不会太高（因为它会损害神经元活动和健康）至关重要。
  图 1. 病毒滴度和 GCaMP 表达。高 (A)、中 (B) 和低 (C) syn-GCaMP 表达细胞的示例。比例尺，20 μm。
无菌手术的术前准备
1. 对手术中使用的所有手术工具、手术单、棉签、箔纸和组织进行高压灭菌。
2. 用高压灭菌的手术单覆盖用于存放所有手术工具和无菌耗材的设备和区域。
3. 用无菌铝箔或保鲜膜覆盖手术期间将处理/触摸的所有表面，即显微镜头和杆、立体定位框架旋钮等。

病毒转染
1. 初始动物手术准备。
  1. 手术前检查并报告动物的体重。理想情况下，使用 8 至 12 周龄的成年雄性或雌性小鼠。
  2. 将动物放入麻醉诱导室（连接到清道夫）中，并用 4% 异氟醚与氧气平衡（4 L/min）。
  3. 一旦动物被麻醉，将其转移到立体定位仪。将动物俯卧在立体定位上，将牙齿放入咬合杆中，并连接到异氟醚鼻锥，以在整个手术过程中保持麻醉[纯氧中的 0.5%–2% 异氟醚 (1 L/min)]。
  4. 术前皮下注射用无菌 0.9% 盐水溶液配制的阿托品 (120 μg/kg) 和美洛昔康 (2 mg/kg)。阿托品减少支气管分泌，保持气管通畅。美洛昔康因其较长的半衰期（20 小时）而提供长期镇痛作用。
  5. 将热电偶探头涂在润滑油冻中，插入动物直肠以调节体温。体温保持在~33°C，以减少出血并促进恢复。
  6. 用眼药膏覆盖动物的眼睛，以防止干燥并避光。
  7. 将动物的头部固定到耳杆中。
  8. 修剪头上的头发。用双面剃须刀片湿剃手术区域，使用棉签涂抹 70% 乙醇或兽医擦洗剂。
  9. 用 vetscrub 和 70% 乙醇交替擦洗 3 次，对头部手术区域的皮肤进行消毒：始终从 vetscrub 开始，因为如果不使用乙醇去除，可能会导致接触性皮炎。
  10. 外科医生应穿着无菌手术衣：发网、面罩、无菌手套和高压灭菌手术服。在整个手术过程中，外科医生可能会得到非无菌助手的帮助。
  11. 用保鲜膜或无菌布盖住动物。
2. 病毒注射。
  1. 在头骨上做一个大约 1-1.5 厘米的矢状切口，以便能够接触到前囟和注射部位。
  2. 使用无菌棉尖涂抹器去除头骨顶部的所有结缔组织（图2A）。
  3. 将空毛细管放入支架中，调整头骨位置，使前囟与前囟尾部 2 毫米齐平。我们检查了头骨的左右水平，横向1毫米； ± 40 μm 的变化是可以接受的。
  4. 在前囟的立体定位指定位置钻一个孔。为了瞄准脑干核，将立体定位臂前后角改变至约 10°，以实现所需的靶向注射。例如，具有 9° 立体定位臂前后角的后梯形核的坐标是距前囟的侧向 -1.0 毫米和尾侧 -5.6 毫米，距小脑表面的腹侧 -5.5 毫米（图 2B）。
  5. 将病毒溶液装入毛细管并放入毛细管支架中。注射量取决于目标区域。一般来说，更小、更紧的进样 (50–200 nL) 更有利于特异性。
  6. 将毛细管连接到连接压力输送系统的塑料管，例如 1 mL 注射器或 picospritzer。
  7. 将尖端置于前囟处以计算坐标。将毛细管尖端移动到所需的注射部位（记住毛细管支架的角度）。将毛细管放入钻孔中。
    
    我。将大脑表面的 Z 坐标归零。
    
    二.不要让毛细血管接触大脑表面太久，因为这可能会导致毛细血管被脑脊液中的角蛋白堵塞。
  8. 将毛细管插入所需的 Z 坐标。
  9. 通过系统轻轻施加压力。确保通过显微镜观察毛细管中病毒溶液半月板的运动。相应地调整压力，以大约 100 nL/min 的速度注射病毒溶液（图 2C）。
  10. 注射后将毛细管保持在原位 3-5 分钟，以防止毛细管回流，并为病毒在毛细管尖端扩散留出时间。
  11. 轻轻地取出毛细管。
  12. 将皮肤拉到一起并用组织粘合剂密封伤口。
  13. 将动物从立体定位框架中取出。
  14. 腹腔注射丁丙诺啡（100 μg/kg，在无菌 0.9% 盐水溶液中制备）。
  15. 将动物放回笼子中的加热垫上直至恢复。
  16. 观察动物直至完全康复，并每天监测术后恢复情况，持续时间长达两周。
  图 2. 病毒转染。 A) 皮肤切开和颅顶准备，通过去除结缔组织来注射病毒。 B) 校准的注射坐标。 C) 使用校准坐标注射 AAV9-Syn 或 gfaABC1D-GCaMP6s 病毒。缩写：7 N，面部运动核； Py，锥体束； MVe，内侧前庭核； sp5，三叉神经脊核； RTN，梯形后核； RMg，中缝大； RPa，中缝苍白； pFL，面旁外侧区域。

GRIN晶状体植入术
1. 按照步骤 B 和 C1 准备动物。
  1. 切口完成后，从切口边缘去除额外的 1 毫米组织（图 3A）。这为围绕镜头构建超级粘合创造了空间。使用无菌棉签涂抹器，去除头骨表面的所有骨膜和结缔组织（图 3A）。
  2. 将空毛细管放入支架中，调整头骨位置，使前囟与前囟尾部2毫米水平，头骨左右水平1毫米横向； ± 40 μm 的变化是可以接受的。
  3. 在前囟的立体指定位置钻一个孔，大小足以让 GRIN 透镜（图 3Be）穿过（至关重要）。在我们的手术中，我们使用直径为 0.6 毫米的镜片，大约 0.7 毫米的孔尺寸足以插入镜片（孔应比镜片直径大约 0.1 毫米）。可以通过将 GRIN 透镜尖端与孔对齐来检查孔的尺寸。至关重要的是，孔不能太大，因为这不会为晶状体提供颅骨支撑，并且会使超级粘合溶液进入伤口，导致术后并发症。
2. 为 GRIN 透镜创建轨迹（至关重要）。
  
  创建晶状体轨道是非常重要且必要的步骤，因为在不创建轨道的情况下插入晶状体会对小脑和脑干核团施加压力，并导致严重的术后并发症。
  1. 通过从在所需坐标处钻出的颅孔插入空毛细管（至透镜轨道的〜3/4深度）来创建透镜轨道（图3C）。
  2. 将直径与 GRIN 透镜大致相似的钝针（图 3Bf）放入立体臂支架中。
  3. 调整前囟处的坐标并将针尖移到孔上。此时，在孔的边缘移动一根针，将其尖端接触到头骨表面，并将 Z 坐标归零。然后，将针移至所需的晶状体植入位置并降低针直至接触脑表面。计算颅骨表面和脑组织之间的距离。
  4. 将针尖接触大脑表面并使 Z 坐标为零。
  5. 缓慢（250 μm/min）将针插入脑组织直至 250 μm，将其拉回零，再次插入直至 250 μm，并将其放置到位约 3 分钟。最初的插入会对小脑产生压力，并为针边缘切割脑组织提供时间。
  6. 3 分钟后，将针向腹侧驱动 500 μm，然后缩回针 250 μm。这会产生 250 μm 的逐步针插入，不会对大脑产生过大的压力。连续执行 250 μm 插入-缩回步骤。
  7. 将针插入感兴趣的目标区域上方约 300–500 μm 或 GRIN 透镜尖端上方 100 μm 处。最后插入时将针保持在适当位置约 3 分钟。请记住，GRIN 透镜的焦平面距透镜底面约 300 ± 100 μm [10]。
  8. 轻轻地抽出针（图3D）。
  图 3. 为梯度折射率 (GRIN) 透镜创建轨迹。 A) 皮肤切割和颅顶准备，用于创建晶状体轨道和植入。 B) 成像套件包括 (a) 微型落射荧光相机、(b) 显微镜物镜盖、(c) 手术植入期间的透镜支架、(d) 底板盖板、(e) 透镜、(f) 钝针、(g)底板，(h) 用于手术植入的底板支架，以及 (i) DAC 盒。 C) 钝针穿过脑干的插入路径，D) 取出钝针后形成的轨迹。
3. GRIN 镜片植入。
  1. 将 GRIN 镜头（图 3Be）放入连接到立体定位臂的支架（图 3Bc）中，并通过拆下相机盖（图 3Bb）将相机（图 3Ba）放入支架（图 3Bc）中。调整前囟处 GRIN 透镜表面的中心。
  2. 将 GRIN 透镜移动到孔的边缘并将其降低，直到接触到头骨表面。然后，将镜头移动到所需的 XY 坐标，将其降低直至接触大脑表面 [通过上面 (2c) 计算的头骨和大脑表面之间的距离]，并将 Z 坐标归零。
  3. 使用步骤 D2f 中所述的相同插入-缩回 250 μm 步骤缓慢插入 GRIN 透镜。这样做直到 1 毫米深度，并在此时等待 3 分钟。
  4. 从 1 mm 开始，将透镜向腹侧驱动 200 μm，然后将其缩回 100 μm，并在下次插入前等待 1 分钟。
  5. 当镜片底面距离植入部位500μm（距离病毒注射部位约800μm）时，将插入速度降低至50μm/步（驱动100μm，回缩50μm，等待1分钟）（图 4A）。通过 Inscopix 数据采集软件和 DAC 盒打开相机（图 3Bi），在每个插入步骤中检查 GCaMP 表达，以便可以看到荧光。当 GCaMP 表达良好并显示与低信号（图 4C）相比增加的全 Ca ²⁺荧光（图 4B）时，停止镜头插入。这应该距离病毒注射部位约 300 μm。请记住，细胞 Ca ²⁺动力学在麻醉下受到抑制，并且在晶状体植入过程中不会很亮。这样做的目的是确保与感兴趣的细胞的最佳可能的晶状体植入距离。晶状体植入步骤可以与病毒注射相结合，但将这些步骤作为单独的外科手术进行可确保最佳的晶状体植入和最佳的细胞成像结果。
  6. 镜片安装到位后，用 Kimwipes 或棉签擦干头骨表面。按照套件说明将超级键聚合物与单体混合。添加催化剂并充分混合。等待混合物稍微变稠至凝胶状稠度。将混合物涂抹在镜片周围和底面。这是非常重要的一步。确保避免将混合物应用到透镜支架上（图3Bc）并使其远离动物的眼睛。第一次应用应覆盖头骨周围的镜片表面。等待 Superbond 干燥（这大约需要 10 分钟；另一种方法是使用 UV 固定 Superbond，这会加速聚合物和单体混合物的固化过程）。
  7. 当 Superbond 充分干燥后，从透镜支架（图 3Bc）上松开透镜（图 3Be）并将其取下。为此，请松开支架上将镜头牢固地固定在支架上的侧面螺钉。确保镜架与镜头连接处无超粘；否则，这会移动镜头。
  8. 混合第二批超键聚合物和单体。等到混合物达到凝胶状稠度，将其沿着皮肤边缘涂抹，并围绕镜片涂抹。确保超级粘合物不会高于透镜的顶面（图 4D）。等待超级债券干燥。
  9. 用切割成形状的 Eppendorf 盖覆盖透镜顶面，并用 PVA 胶（图 4D）将其粘附在那里（或者，可以使用硅粘合剂覆盖透镜顶面），可以在基板植入手术期间将其移除。这将在安装底板之前保护镜头。
  10. 第二次 Superbond 干燥且盖子与镜片密封良好后，将动物从立体定位框架上取下，腹腔注射丁丙诺啡，然后将其放回笼子中的加热垫上直至恢复。
  11. 观察动物直至完全康复，并每天监测术后恢复情况长达两周。
  图 4. 梯度折射率 (GRIN) 晶状体的植入。 A) 通过使用钝针创建的轨道缓慢插入 GRIN 透镜，直到看到良好的 GCaMP 表达和细胞 Ca ²⁺动态。良好 (B) 和不充分 (C) GCaMP 表达的示例。 D) 使用优质牙科水泥将 GRIN 镜片固定在某个位置。透镜顶部覆盖有按形状切割并用 PVA 胶粘着的 Eppendorf 盖。比例尺，50 μm。

基板植入
1. 动物将被麻醉以进行基板植入手术，并按照病毒注射方案的步骤 C1a-g 放置在立体定位框架中。然而，这是一种非侵入性手术，因此不需要与上述相同的无菌方案。
2. 植入底板。
  1. 剥掉 PVA 胶，取下镜头盖。
  2. 使用浸泡在乙醇中的 Kimwipes 清洁透镜顶面，以清除 GRIN 透镜表面上可能存在的污垢。
  3. 将底板 (图 3Bg) 连接到支架 (图 3Bh) 并将其放置在立体定位臂中的适当位置。
  4. 在此步骤中不可能进行立体定向颅骨调平；因此，尽量使头骨保持水平。
  5. 将相机连接到基板并将其移动到镜头表面附近（图 5A）。打开录制软件并观看实时成像。将 GRIN 镜头顶部表面调整到记录区域的中间，然后缓慢降低相机，直到看到镜头表面（在此步骤中采取预防措施，不要将相机镜头压到任何其他表面上，并在相机和镜头之间留下明显的间隙）梯度折射率透镜）。
  6. 当 GRIN 镜头的锐边可见时（图 5B）（在最低相机位置），通过移动鼻锥来调整所有边缘的锐度。这确保了相机和镜头表面彼此平行。
  7. 将基板位置移离镜头，以获得最佳视野（图 5C）。这通常距离锐边约 300 μm。可以通过轻轻触摸动物的背部来检查该视野，这可能会激活细胞来检查 Ca ²⁺信号（图 5C）。
  8. 病毒表达时间因病毒而异，因此可能需要额外的时间才能达到最佳表达。在这种情况下，动物可以放回笼子（通过将盖子盖在镜片上）并在一周后重新进行底板手术。
  9. 当基板处于最佳 GCaMP 表达的位置时，将超级键聚合物与单体混合并向其中添加催化剂。当混合物具有良好的稠度以在底板侧面和头骨上的超级粘合之间形成一层时，将其涂在边缘上，确保它不会在底板下方流动或接触相机镜头。这是关键的一步。第一次涂抹后，等待混合物充分干燥。松开固定相机的底板上的螺钉。向上收回相机并将其从立体定位支架上取下。
  10. 涂上第二层 Superbond 以覆盖并密封底板周围的所有间隙。如果 Superbond 颜色不深，则可以涂上黑色指甲油层，使其不透明并防止任何光线穿透底板下方。
  11. 底板固定好后，安装底板盖（图 3B-d）。将动物从立体定位框架上取下，然后将其放回加热垫上的笼子中，直至恢复。
  12. 观察动物直至完全康复，并在记录开始前至少一周每天对其进行监测。
  图 5. 基板的植入。 A) 基板通过梯度折射率 (GRIN) 透镜附着在头骨上，以便能够对最佳的细胞 Ca ²⁺动力学进行成像。 B) 当相机在基板植入过程中处于最低位置时，GRIN 镜头的锋利边缘可见。 C) 将基板位置移离镜头，以便可以在最佳视野下看到细胞。比例尺，50 μm。

小鼠训练

在将记录它们的环境中用虚拟相机训练小鼠（图 6A）。培训可持续 10 至 60 分钟，具体取决于研究方案的持续时间。一到三个培训课程可以至少间隔一天进行。

自由活动小鼠的Ca ^2+成像
1. 通过将成像相机对接在底板上并拧紧底板上的侧面螺钉，将成像相机连接到动物的头部。
2. 成像：
  1. 根据需要设置记录参数，以确保最小的 LED 功率以防止漂白。设置最佳记录帧速率 [神经胶质 Ca ²⁺瞬态比神经元慢，因此可以以较慢的帧速率 (< 10 FPS) 记录] 并调整焦平面以实现记录所需的视场（图 6C， D）。这已在之前的协议中详细讨论过，并且可以在制造商手册中找到[12]。
  2. 将动物置于记录环境中，例如，在体积描记室中，通过测量呼吸潮气量和频率的变化来测试高碳酸呼吸反应（图 6B）。
  3. 应根据研究方案开始记录。该研究可能要求在记录开始之前将动物安置在记录环境中，或者可能需要在将动物放入环境中后立即记录活动。为了测量化学敏感神经元或神经胶质细胞的高碳酸呼吸反应，将允许动物定居在连接到气体分析仪（以分析CO ₂和O ₂）和压力传感器以测量呼吸量的体积描记室中。动物安定后，开始 [通过 TTL（晶体管-晶体管逻辑）脉冲] 进行Ca ^{2+成像，并记录基线呼吸，然后进行高碳酸血症挑战和恢复。}
  4. ^{Ca 2+}成像的持续时间取决于方案。然而，建议保持记录持续时间尽可能短，以避免荧光团漂白。在我们的研究中，我们已成功多次记录同一只小鼠每次最多 15 分钟的时间（记录之间保持一周的间隔）。然而，成像频率和持续时间取决于 GCaMP 指示器的类型和相机成像设置。
3. 同步视频录制：
  1. 可以使用 TTL 脉冲脚本记录实时动物视频并与成像数据同步。设置 TTL 脉冲的详细说明可以在 CED-Spike2 网站上找到。 TTL 脉冲可以传送到 DAC 盒以触发 Ca ²⁺成像，并且这些可以在分析过程中同步。要启动 TTL 脉冲，请从 Spike 软件发出命令，这将允许查看命令何时发送。该命令将启动 Ca ²⁺记录，随后，Ca ²⁺成像轨迹与尖峰记录上的 TTL 脉冲命令对齐（尖峰记录可以是 EEG 或任何其他特征，例如体积描记轨迹）。
  图 6.自由活动动物的训练和 Ca ²⁺成像。 A) 在一个将被记录的环境中用虚拟相机训练动物，以便它们习惯。 B) 脑干神经元和神经胶质细胞的Ca ²⁺成像以及行为反应，例如对高碳酸血症的呼吸反射。脑干梯形后核 (RTN) 神经元 (C) 和星形细胞 (D) Ca ²⁺动力学荧光图像示例。比例尺，50 μm。
数据分析

数据分析和细胞分类
1. 有多种方法可以处理原始数据，例如半手动 ROI 分析、PCA/ICA 分析、显微内窥镜数据的约束非负矩阵分解 (CNMF-E) 以及集成到开源包中的 CNMF-E：钙成像分析（CaImAn）。所有这些方法都有其优点和缺点，超出了本协议的范围，并且之前已报告过[23]。我们使用 Inscopix 数据处理软件 (IDPS)，该软件结合了其中一些选项来分析成像数据并识别细胞。预处理步骤后，通过 Inscopix 运动校正软件校正大多数记录过程中明显的视野运动，以允许基于 ROI 的荧光测量在记录过程中保持与细胞对齐。这可以纠正过度的 XY 平面移动。
2. 无论使用哪种方法来识别细胞，脑干成像的主要挑战仍然是运动伪影。大多数 Ca ²⁺成像方法可以纠正由于动物或轻型相机运动引起的刚性运动伪影。然而，脑干运动不是刚性的，不能用先前记录的方法进行校正，这些方法是这些分析方法工作流程的内置部分。因此，我们设计了一个细胞包含/排除标准，使我们能够识别和折扣/拒绝由人为因素引起的细胞（图7）。
3. 在特定方法中使用给定标准识别细胞后，我们将所有细胞与视频数据对齐。我们使用 ANY-maze 视频跟踪软件将 Ca ²⁺成像轨迹与视频记录中动物的身体运动对齐，并将这些运动转换为颜色编码的超声波图。提取的细胞只有满足以下条件才可以进行分类：（1）可以清楚地看到细胞的特征（如体细胞、大突起）； (2) 它们发生在动物没有运动的情况下或不受动物运动的影响； (3) 荧光相对于背景发生变化； (4) 焦平面保持恒定，如其他非荧光标志（例如血管）所示。对于第二个标准，不排除细胞仅在身体运动期间显示荧光变化。然而，钙信号传导的发生应与身体运动无关（运动相关的神经元或胶质细胞活动除外），并且当细胞被提取并与身体运动对齐时，身体运动过程中看到的荧光变化（Ca ²⁺信号的幅度）运动时的变化不应与动物安静时的变化有显着差异。
4. 这种方法使我们能够纳入满足上述标准的细胞（图7Aa），并拒绝由运动伪影引起的细胞，因为在头部、颈部或身体运动期间脑干位于颅外空间（图7A-b）。这是脑干成像的一个非常具体的问题，在从其他大脑区域记录时不会引起问题，因此之前在其他成像研究中没有讨论过。
5. 先前的研究已使用粘在 GRIN 透镜上的锚定钨丝来稳定脑干成像视野 [17,24,25]。这种额外的措施也可能有助于减少运动伪影，但仍然无法消除由运动伪影引起的细胞亮度的变化。
6. 胶质脑干 Ca ²⁺动力学非常缓慢且短暂（图 7B），这使得使用上述标准可以轻松包含或排除这些细胞。
  
  图 7. 使用设定标准进行数据分析和细胞分类。 A) 满足 (a) 和不满足 (b) 我们处理脑干运动伪影的细胞纳入/排除标准的神经元 GCaMP 荧光迹线示例。 B) 星形胶质细胞 GCaMP 荧光迹线示例。来自灰色矩形的扩展 GCaMP6 信号（3 s），以伪彩色荧光图像的蒙太奇形式呈现，显示脑干神经胶质细胞中缓慢的 Ca ²⁺动态（从 0 s 处没有荧光，到中间达到峰值并在 3.0 s 处衰减）。比例尺，20 μm。缩写：WBP，全身体积描记法；动，运动。
协议验证

该协议或其部分内容已在以下研究文章中使用和验证[10,26]：
1. 班达尔等人。（2022）。分析自由活动小鼠呼吸化学敏感性的脑干回路。 eLife（图 1-7）[10]。
2. 班达尔等人。（2023）。慢性癫痫期间呼吸系统化疗敏感性降低的神经相关性。细胞神经科学前沿（图 1、2、4、5 和 7）[26]。
一般注意事项和故障排除

一般注意事项
1. 尽管该协议已在小鼠中得到验证，但它也可能适用于大鼠。
2. 体内成像在技术上具有挑战性，因此没有任何一步是至关重要的；相反，本协议中的所有步骤都很重要，必须认真执行。所有步骤的优化有助于成功成像。
3. 在开始该协议之前，验证目标核的大脑坐标以及病毒的最佳浓度非常重要。
4. 活体显微镜成像会产生大量数据（以千兆字节为单位，因此需要大量存储空间），并且还需要高性能计算机（高 CPU 速度、大量 RAM）来处理数据。
5. 植入 GRIN 透镜和底板后，必须考虑畜牧业和住房，因为头座可能会卡在食物料斗中，或者共同住房可能会损坏它。
6. GCaMP指标的选择很重要；有必要考虑细胞的放电特性以及在研究开始之前需要回答的问题[27]。
7. 基板的重复使用是非常有可能的；然而，GRIN 透镜的重复使用取决于从之前的实验中恢复后透镜的质量。底板和透镜都可以在丙酮中放置过夜，并在第二天使用软刷轻轻清洁。
故障排除

问题 1：成像中的过度移动看起来不符合生物特征。

可能的原因：成像过程中的生物运动是由颈部运动引起的，其中晶状体表面下方的组织在 XY 方向上移动其位置（在 XY 方向上将细胞位置移动最多 5 μm），有时在 Y 平面上移动，其中运动纠正是困难的。 XY类型的生物运动可以通过数据分析软件中内置的运动校正选项进行校正。非生物运动是由于镜头、底板或相机等植入物松动造成的。如果底板侧螺钉没有足够拧紧到摄像机上，则可能会导致摄像机与底板空腔的配合松动。这些类型的非生物运动导致整个视场在 XY 方向移动超过 20 μm，或者视场同步上下移动（视场进入和离开焦点）。

解决方法：检查底板螺丝并固定。如果是底板种植体，那就有点复杂了；要么重新植入底板，要么如果是由于牙科水泥质量低下，则重新考虑优质替代材料。

^{问题2：Ca 2+}信号不足。

可能的原因：图 1 显示了高、中、低 syn-GCaMP 表达细胞的示例。在自由活动的小鼠中，GCaMP 成像期间的低 Ca ²⁺信号可能是由于注射病毒的浓度或体积低所致。雷森德斯等人。 [12] 在图 4 中描述了最佳病毒表达。这也可能是由于错过病毒注射和晶状体植入而发生，如 Resendez 等人所示。 [12] 图 6，面板 C、D。

解决方案：首先，尝试改变焦平面并调整LED功率和帧率。如果仍然不能解决问题，则处死动物并检查 GCaMP 表达。有时，问题可能是由于病毒的血清型和细胞类型趋向性造成的[28]。确保根据您的目的选择正确的病毒和血清型。

致谢

这项工作得到了 MRC 发现奖（拨款号：MC_PC_15070）和英国癫痫研究 (ERUK) 项目拨款（拨款号：P1903）的支持。 AB 是癫痫研究所 (ERI) 的新兴领袖研究员（授权号：F2203）。 RH 得到生物科学研究委员会的支持（拨款号：BB/X008290/1）。该协议改编自 Bhandare 等人。 [10]并且也被Bhandare等人使用。 [11]。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

道德考虑

实验是根据欧盟委员会指令 2010/63/EU（欧洲保护用于实验和其他科学目的的脊椎动物公约）和英国内政部（科学程序）法案（1986）进行的，并获得了项目批准华威大学的 AWERB。

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