材料与试剂

生物材料

T222 细胞系是通过外部扩增人 PDAC 样本 PDA222 的肿瘤捐助而产生的 [7]
起源 PDAC 患者原发肿瘤样本的细胞系 [7]
鼠肿瘤细胞系 PDA30364 和 PDA30364-OVA [18]

试剂

T7 mScript标准mRNA生产系统（Cellscript，目录号：C-MSC100625）
适用于2100生物分析仪系统的RNA 6000纳米试剂盒（Agilent，目录号：5067-1511）
pcDNA ^TM 3.1(+)（Invitrogen，目录号：V79020）
抗人 HLA-A、B、C 抗体 APC，W6/32（BioLegend，目录号：311410）
抗人 HLA-DR 抗体 PE，LN3（BioLegend，目录号：327008）
X-VIVO 15（龙沙，目录号：BE02-060Q）
AB型人血清（Sigma-Aldrich，目录号：H4522）
庆大霉素（生命科技，目录号：15750045）
两性霉素B（Life Technologies，目录号：15290-026）
人Interleukin-2 Proleukin®S ^（ Clinigen Healthcare，目录号：17152.00.00）
窒息的抗人CD3（Invitrogen，目录号：16-0037-85）
二甲基亚衍生物（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）
人白蛋白20%（CSL Behring，目录号：PZN：1468366）
OptiMEM 低血清培养基（Thermo Fisher，目录号：31985062）
高级DMEM/F12（Gibco，目录号：12634010）
L-谷氨酰胺，200 mM（Gibco，目录号：25030-024）
青霉素-链霉素，10,000 IU/mL（Gibco，目录号：15140-122）
B-27补充剂，50×（Gibco，目录号：17504044）
HEPES，1 M，pH 7.0–7.6（Sigma-Aldrich，目录号：H0887）
素肝钠盐，IA级（Sigma-Aldrich，目录号：H3149）
溶液溶液，200 g/L（Gibco，目录号：A24940-01）
RPMI 1640（Gibco，目录号：52400-025）
胎牛血清（FBS）（Biowest，目录号：S181B-500）
DMEM，高引线（Gibco，目录号：41965-039）
丙酮，100 mM（Gibco，目录号：11360039）
重组人/鼠干扰素γ（IFNγ）（Immunotools，目录号：11343536/12343536）
MEKi，GDC-0623，丝裂原激活蛋白补充（Active Biochem，目录号：A-1181）
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A9418）
EDTA，超纯 0.5 M，pH 8.0（Invitrogen，目录号：15575020）
佛波醇12-肉豆蔻酯13-乙酰酯（PMA）（Sigma-Aldrich，目录号：P8139）
离子霉素钙盐（Sigma-Aldrich，目录号：I0634）
抗人CD107a抗体PE/APC，H4A3（BioLegend，目录号：328608/328620）
GolgiStop，蛋白质转运（BD Biosciences，目录号：554724）
GolgiPlug，蛋白质转运抑制剂（BD Biosciences，目录号：555029）
LIVE/DEAD 可固定水族死细胞染色试剂盒 (DCM)（Life Technologies，目录号：L34957）
抗小鼠 CD16/32, 93（BioLegend，目录号：101320）
抗小鼠 CD16.2，9E9（BioLegend，目录号：149502）
抗人 CD3 抗体 Brilliant Violet 711，OKT3（BioLegend，目录号：317328）
抗人CD4抗体APC/Fire 750，SK3（BioLegend，目录号：344638）
抗人 CD8a 抗体 Alexa Fluor 700，HIT8a（BioLegend，目录号：300920）
抗小鼠 TCR β链抗体 Brilliant Violet 421，H57-597（BioLegend，目录号：109230）
抗小鼠 CD8a 抗体 PerCP，53-6.7（BioLegend，目录号：100732）
抗小鼠CD8b抗体PE，YTS156.7.7（BioLegend，目录号：126608）
抗小鼠CD4抗体PE，GK1.5（BioLegend，目录号：100408）
Cytofix/Cytoperm 固定/透化试剂盒（BD Biosciences，目录号：554714）
烫发/洗涤缓冲液，包含在固定/透化试剂盒中（BD Biosciences，目录号：51-2091KZ）
抗人TNFα抗体Alexa Fluor 488，MAb11（BioLegend，目录号：502915）

解决方案

T 细胞扩增培养基（参见配方）
冷冻介质（参见食谱）
T 细胞培养基（参见食谱）
肿瘤细胞培养基 I：人（参见食谱）
肿瘤细胞培养基 II：小鼠（参见食谱）
FACS 缓冲液（参见配方）

食谱

T细胞扩增培养基

X-VIVO 15 补充有 2% AB 型人血清、100 IU/mL 青霉素-链霉素、20 µg/mL 庆大霉素、2.5 µg/mL 两性霉素 B 和 30 ng/mL 纯化抗人 CD3

冷冻介质

添加 10% DMSO 的 FBS

T细胞培养基

X-VIVO 15 添加 2% 人白蛋白

肿瘤细胞培养基 I：人

DMEM/F12+ 补充有 2 mM L-谷氨酰胺、100 IU/mL 青霉素-链霉素、2% B27 补充剂 (50×)、5 mM HEPES、12 mg/mL 肝素和 6 g/L 葡萄糖

肿瘤细胞培养基II：小鼠

DMEM 补充有 10% FBS、100 IU/mL 青霉素-链霉素和 1 mM 丙酮酸钠

流式细胞仪缓冲液

补充有 0.5% BSA 和 5 mM EDTA 的 PBS

实验室用品

T25组织培养瓶（TPP，目录号：TPP90026）
比色皿，0.4 cm 间隙基因脉冲器/微脉冲器电穿孔（Bio-Rad，目录号：1652088）
24 孔板，平底，TC 处理（VWR，目录号：734-2325）
96 孔 U 形底板，圆底，TC 处理（Avantor，目录号：734-2328）
96 孔板，平底，聚苯乙烯（TPP，目录号：TPP92096）
96 孔 V 形底板，锥形底，未经处理，无盖（Costar，目录号：3897）
巴斯德移液器，玻璃 230 mm，无过滤器（WU Mainz，目录号：200763）
15 mL 锥形底管（Greiner，目录号：188271-N）
50 mL 管锥形底，聚丙烯（Falcon，目录号：352070）

设备

2100 生物分析仪（安捷伦）
培养箱 Heracell 240i（Thermo Scientific，目录号：51032875）
冷冻离心机 5810R（Eppendorf，目录号：EPP-022628187）
电穿孔器，带有 ShockPod 比色皿室的 Gene Pulser Xcell 系统（Bio-Rad，目录号：1652660）
LSRFortessa ^TM细胞分析仪（BD Biosciences）

软件

FlowJo v10.9.0（FlowJo LLC，美国俄勒冈州阿什兰）
生物渲染（https://www.biorender.com/）

程序

TCR 克隆策略和用于转染的体外转录 mRNA 的生产

将 scRNAseq 数据集中鉴定的来自感兴趣的 TCR 克隆型的 T 细胞受体 V(D)J α 和 β 链核苷酸序列合成为 DNA 寡聚物。无缝 Golden Gate 组装用于将其插入双顺反子 TCR 表达盒 pTRAC，如图 1 所示。用于合成体外转录 mRNA 的模板是通过表达载体在位于表达下游的 NotI 位点的线性化生成的盒式磁带。 T7 mScript 标准 mRNA 生产系统用于生成加帽和聚 (A) 尾 mRNA，如制造商提供的方案中所述。使用 Agilent RNA 6000 Nano 芯片定期检查 mRNA 质量，以确保在 2100 生物分析仪系统上显示单峰。

图 1.带有 T7 启动子的 pcDNA3.1(+) 载体，能够在体外转录编码 TCRβ 和 TCRα 链的 mRNA。可变的 VDJβ 和 VJα 序列分别与小鼠 TCRβ 恒定区 (mTRBC) 和 TCRα 恒定区 (mTRAC) 结构域框内连接，形成双顺反子开放阅读框，其中 TCRβ 和 TCRα 编码序列被自裂解 P2A 位点，如 Kropp 等人详细描述的。 [19]。 mTRBC 和 mTRAC 序列分别包含先前描述的 T48C 和 S57C 突变，导致额外的链间二硫键 [20,21]。后者突变与鼠恒定区的使用相结合，减少了转染的 T 细胞受体 (TCR) 与人 T 细胞中内源表达的 TCR 链的错配。此外，这允许通过针对小鼠 TCRβ (mTCRβ) 恒定结构域的单克隆抗体，对 TCR 基因转导的细胞表面表达进行流式细胞术检测。该开放阅读框的下游是一个 3'UTR，由人类 β-珠蛋白基因的两个串联拷贝组成，可提高细胞中转录本的稳定性 [22]。表达盒嵌入 pcDNA3.1(+) 载体中，允许通过 T7 启动子序列进行体外转录。
测试 mRNA 转染的人 T 细胞中 CD8 ⁺ TCR 的抗肿瘤反应性

我们对多种 TCR 功能筛选的测定的成功与否取决于 T 细胞的选择和肿瘤细胞的制备，如本段中详细讨论的。如背景部分所述，我们通常使用人类 T 细胞系 T222 进行功能性 TCR 筛选实验。该 T 细胞系源自人类 PDAC 样本的原代 TIL 培养物。根据成熟的快速扩增方案 [16] 进行体外培养后，我们发现该 T 细胞系无限且持续生长。 T222 细胞在大约 90% 的细胞中通过 mRNA 转染有效表达大多数 TCR（图 2），但不匹配的 TCRα/β 对和一些罕见情况除外。我们发现 T222 在与绝大多数测试的人类肿瘤细胞共培养时缺乏背景反应性（参见图 2 中的示例），这使其非常适合对人类 TIL 样本的 scRNAseq 数据集中鉴定的 TCR 进行功能筛选。在本协议描述的背景下，这提出了两个需要解决的重要问题：
1. T222 细胞系有多独特？其他实验室是否可以轻松生成具有类似特性的 T 细胞系？
2. 生成类似 T 细胞系的最佳策略是什么？
图 2. 5 小时 T 细胞/肿瘤细胞共培养测定中的功能性 T 细胞受体 (TCR) 筛选。流式细胞术数据的代表性示例显示了四种不同的 CD8 ⁺ T 细胞衍生的 TCR的功能测试结果，这些 TCR 是从同一人胰腺导管腺癌 (PDAC) 肿瘤样本中分离出来的，转染到人 CD8 ⁺ T222 细胞后 [7]。从左到右：模拟转染的 T 细胞，然后是用非肿瘤反应性 (NTR) TCR 和三种不同的肿瘤反应性 (TR) TCR 转染的 T 细胞。肿瘤细胞与四个测试的 TCR 源自同一患者来源的肿瘤样本，并用 IFNγ 预处理。点图描绘了 CD3 ⁺ CD8 ⁺ T 细胞中小鼠 TCRβ 恒定结构域和细胞内 TNFα 的表达，从而证明 T 细胞反应性是由转染的 TCR 介导的。

在我们的工作过程中，我们评估了从其他人类肿瘤样本中获得的额外扩增 TIL 培养物的 TCR 筛选的适用性，包括来自同一患者的 TIL 和肿瘤细胞的设置，结果各不相同。其中一些 T 细胞系表现出与 T222 相似的品质，说明了在其他实验室生成合适的 TIL 衍生 T 细胞系的可行性。其他 TIL 衍生的 T 细胞系被发现对自体肿瘤保持强烈的反应性，我们发现这与肿瘤反应性 TCR 克隆型的持续存在有关，尽管有重复的扩增 [15] 和未发表的数据）。此外，一些 TIL 衍生的 T 细胞系表现出更广泛的抗肿瘤反应性，这可能是由于同种异体反应性。我们推测，与外周血单核细胞 (PBMC) 衍生的 T 细胞培养物相比，T222 和其他几种 TIL 衍生的 T 细胞系的理想特性可能与这些 T 细胞系的克隆性更强有关 [15] ，从而降低部分 T 细胞表达同种异体/交叉反应 TCR 的可能性，从而导致功能性 T 细胞测定中出现背景反应。

鉴于上述情况，生成相似 T 细胞系的最佳策略是对大约 10-20 个可用的 TIL 培养物进行重复快速扩增 [16]，将所得 T 细胞批次冷冻成等分试样，并评估所得 T-具有上述所需特征的细胞系。

我们研究中使用的人类 PDAC 肿瘤系 [7] 均源自 NSG 小鼠的患者来源异种移植 (PDX) 模型。最近，我们还成功地利用了作为类器官培养物启动的肿瘤细胞系。为了增加人肿瘤细胞系上 HLA I 类限制性抗原的呈递，通常用 333 IU/mL 人 IFNγ 预处理肿瘤细胞 48 小时。如图 3 所示，这显着增加了表面 HLA 表达，从而提高了测定的灵敏度，特别是对于弱反应性 TCR。

图 3. 肿瘤细胞 IFNγ 预处理对于有效检测 T 细胞受体 (TCR) 介导的 T 细胞激活的重要性。 (A) IFNγ预处理对细胞表面 HLA I 类和 II 类表达的影响，通过泛 HLA I 类和 II 类单克隆抗体（分别为 APC 缀合的 W6/32 和 PE 缀合的 LN3）检测。人胰腺导管腺癌（PDAC）肿瘤细胞系。 (B) 流式细胞术数据显示从同一人 PDAC 肿瘤样品中分离出的三种不同 CD8 ^{+ T 细胞衍生 TCR 转染至人 CD8}⁺ T222 细胞后进行5 小时共培养实验的功能测试结果。从左到右：模拟转染的 T 细胞，然后是用非肿瘤反应性 (NTR) TCR 和两种肿瘤反应性 (TR) TCR 转染的 T 细胞。点图描绘了 CD3 ⁺ mTCRβ ⁺ T 细胞中 CD107a 和 TNFα 的表达。数据表明，肿瘤细胞的 IFNγ 预处理强烈促进了 TCR 反应性的检测，特别是对于以 TCR1 为例的较弱 TCR。这同样适用于检测源自 CD4 ⁺ T 细胞克隆的 TCR 的反应性（甚至在更大程度上）（参见程序 C）。

T细胞系的维护和质量控制

根据 Dudley 等人描述的快速扩增方案培养细胞。 [16]。有关详细信息，请参见图 S1 和附加文本。
在用于 TCR 筛选实验之前验证每个批次的 CD8 ⁺ /CD4 ⁺比率和 TCR 转染效率。

T 细胞预培养（检测时间线的第 0 天，如图 4 所示）

图 4. 检测时间线

转染前 72 小时解冻 T 细胞。预培养增加了电穿孔后的活力。请参阅注释 1 和图 S2，了解所需 T 细胞数量的估计，同时考虑到 72 小时培养期间的潜在增殖和电穿孔导致的细胞损失。
将 3 × 10 ⁶ T 细胞（用台盼蓝染色计数的活细胞，例如使用 Vi-CELL 计数器）接种到 24 孔板中的 1 mL T 细胞培养基 + 300 IU IL-2 中。在电穿孔之前汇集所有孔的细胞。
_{在 37°C 和 5% CO 2}下培养 T 细胞 72 小时。

肿瘤细胞的 IFNγ 预处理（第 1 天）

将 333 IU/mL 的人 IFNγ 添加到肿瘤细胞培养物中并孵育 48 小时。如图 4 所示，IFNγ 预处理应在 T 细胞/肿瘤细胞共培养开始前 72 小时开始。 IFNγ 浓度参见注释 2。

T 细胞的 mRNA 转染（第 3 天）

^{T 细胞按每个 TCR 2.5 × 10 6} –7 × 10 ^{6 个}细胞分批转染。待转染的细胞数量取决于 T 细胞/肿瘤细胞共培养期间每个 TCR 待筛选的条件数量。对于每种条件，共培养当天需要2 × 10 ⁵转染的活 T 细胞。考虑到相关 T 细胞系电穿孔导致的细胞损失（注 1）。计算示例参见图 S2。以下步骤描述了用 5 µg TCR 编码 mRNA转染 5 × 10 ⁶细胞。该设置基于对试点实验中不同 T 细胞数量和 mRNA 浓度的广泛评估。根据转染细胞的实际数量调整 TCR-mRNA 的量和转染体积。方向请参见表 1。

表 1. T 细胞转染体积计算示例

参数	实施例1	实施例2	实施例3
每次 TCR 转染的 T 细胞	2.5×10 ⁶	5×10 ⁶	7×10 ⁶
T细胞受体mRNA	2.5微克	5微克	7微克
T细胞转染体积	125微升	250微升	350微升

电穿孔当天在 4 °C 下预冷比色皿和 OptiMEM。
将 T 细胞培养基预热至 37°C。
将所有含有 RNA 的制剂/溶液置于冰上以避免降解。
准备 RNA-OptiMEM 混合物 (4 °C)：

每个 TCR使用 5 µg（每 5 × 10 ⁶细胞）体外转录的带帽和尾部 mRNA。用 OptiMEM 填充至 25 µL，以达到总转染体积的 1/10。
将预培养的 T 细胞从 24 孔板收集到 50 mL 管中，并用冰冷的 OptiMEM 在 350× g、4 °C 下洗涤两次 5 分钟。
在 OptiMEM 中将浓度设置为 20 × 10 ^{6 个}细胞/mL。将细胞置于冰上。
将 250 μL T 细胞悬浮液（5 × 10 ^{6 个}细胞）移入预冷的比色皿中。添加 25 µL 含有 5 µg TCR-mRNA 的冰冷 RNA-OptiMEM 混合物。通过移液彻底混合，避免气泡。将比色皿盖上以保持无菌。
用纸巾小心地将比色皿外部擦干；潮湿的比色皿可能会导致电穿孔装置故障。
将比色皿放入 Bio-Rad ShockPod ^TM比色皿室中，并使用 500 V 的方波脉冲电穿孔细胞 5 ms。
电穿孔后，立即将 1 mL 预热（37°C）T 细胞培养基添加到 T 细胞中，并用巴斯德吸管将它们从比色皿转移到 24 孔板的一个孔中。
对每个 TCR-RNA 重复并收集在单独的孔中。
电穿孔不超过四次后，将带有电穿孔 T 细胞的板转移至培养箱。细胞应在电穿孔后最迟 5 分钟转移至培养箱中，以避免细胞活力过度丧失（注 3）。
在开始 T 细胞/肿瘤细胞共培养之前，将转染的 T 细胞培养 20-24 小时。

T 细胞/肿瘤细胞共培养的肿瘤细胞接种（第 3 天）

有关 96 孔板布局的示例，请参见图 5。
在共培养前 24 小时，将 IFNγ 预处理的贴壁肿瘤细胞接种到 96 孔平底板的相关孔中。目标是肿瘤细胞培养物在共培养当天达到 90%–100% 汇合，以获得最佳检测灵敏度（见图 S4A）。请参阅注释 4 和注释 5，了解如何设置非贴壁或新鲜胰蛋白酶处理的肿瘤/靶细胞的测定。

图 5. 共培养板布局示例。第 1-12 列通常用于测试用不同 T 细胞受体 (TCR) 转染的 T 细胞。在这种情况下，A-H 行用于测试 TCR 转染的 T 细胞在不同条件下的反应性，例如，仅使用培养基（阴性对照）、存在 PMA/离子霉素（阳性对照）、存在一种或更多不同的肿瘤细胞系，和/或存在免疫调节物质，例如抗 PD-L1 抗体 [23]。建议将 PMA/离子霉素条件下的行与测试肿瘤细胞反应性的行分开，以避免含有 PMA/离子霉素的培养基意外溢出。如果使用板上的所有行，请分别使用 A 行和 B 行作为 PMA/离子霉素和介质对照，如图所示。如果使用六行或更少的行，则使用 A 行作为介质对照，使用 B-F 行作为测试条件，使用 H 行作为 PMA/离子霉素对照。使用 BioRender.com 创建的人物。

T 细胞/肿瘤细胞共培养的启动（第 4 天）

不同测定条件的设置如图5所示：
1. 在第3天小心地从接种肿瘤细胞的孔中除去上清液，而不影响肿瘤细胞的粘附。
2. 用 200 µL PBS 清洗，小心去除上清液，并向含有肿瘤细胞的孔中添加 50 µL T 细胞培养基。
3. 为阳性对照培养物准备 PMA/离子霉素主混合物，由含有 400 ng/mL PMA 和 2 µg/mL 离子霉素钙盐（离子霉素）的 T 细胞培养基组成。
4. 将 50 µL PMA/离子霉素主混合物添加到每个阳性对照孔中，如图 5 所示。共培养期间的最终浓度为 100 ng/mL PMA 和 500 ng/mL 离子霉素。
5. 将 50 µL T 细胞培养基添加到每个阴性对照孔中，如图 5 所示。
添加 TCR 转染的 T 细胞：
1. 在 T 细胞培养基中将转染 T 细胞的浓度调整为 2 × 10 ^{6 个}细胞/mL。在许多情况下，这可以在转染后培养 T 细胞的 24 孔板中完成。
2. 根据图 5 所示的布局，将含有 2 × 10 ⁵ T 细胞的 100 μL T 细胞悬浮液添加到每个孔中。
添加抗 CD107a 和 IL-2：
1. 准备 CD107a/IL-2 主混合物，由含有 1:20 抗 CD107a-PE 抗体（参见注释 6）和 1200 IU/mL IL-2 的 T 细胞培养基组成。
2. 将 50 µL CD107a/IL-2 混合物添加到所有孔中，从而达到每孔 200 µL 的最终体积。共培养期间的最终稀释度为 1:80 抗 CD107a-PE 抗体和 300 IU/mL IL-2。
通过在室温 (21°C) 下以 50× g离心板 1 分钟来旋转 T 细胞。
_{在 37°C 和 5% CO 2}下孵育 1 小时。
共培养第一小时后添加 GolgiStop 和 GolgiPlug：
1. 准备由 T 细胞培养基与 1:100 GolgiStop 和 1:100 GolgiPlug 溶液组成的主混合物。
2. 每口井小心添加 20 µL GolgiStop 和 GolgiPlug 混合物。不要通过移液混合，因为这会旋转细胞并干扰 T 细胞/靶细胞相互作用。
_{在 37°C 和 5% CO 2}下再孵育 4 小时。
立即继续进行流式细胞术染色方案。

流式细胞仪染色（第 4 天）

在 4°C 下以 700× g进行所有离心步骤2 分钟。为了避免荧光团光漂白，请使用安全工作所需的最小曝光量，并避免阳光直射样品。

死细胞标记物 (DCM) 染色：
1. 准备 DCM 混合物，由 PBS 中的 1:40 DCM 组成（注 7）。
2. 当根据平底板中的默认方案进行测定时，重新悬浮 T 细胞并小心地转移到 V 形底板中，以尽量减少染色过程中的细胞损失。如果出现脱落的肿瘤细胞，这没有问题。（有关在 U 形底板中进行的共培养测定，请参阅注释 8。）
3. 将细胞向下离心并轻弹板以弃去上清液。
4. 添加 200 μL 的 PBS。
5. 离心并轻弹板以弃去上清液。
6. 通过离心和轻弹再次用 200 μL PBS 清洗。
7. 将颗粒重新悬浮在每口井 100 μL 的 DCM 混合物中。
8. 4°C 避光孵育 15 分钟。
9. 添加 100 μL 的 FACS 缓冲液。
10. 离心并轻弹板以弃去上清液。
11. 添加 200 μL 的 FACS 缓冲液。

细胞外染色（ECS）：

准备 ECS 抗体混合物。例如，请参见表 2。
离心并轻弹板以弃去上清液。
在 100 μL ECS 抗体混合物中重新悬浮颗粒。
4°C 避光孵育 25 分钟。
添加 100 μL 的 FACS 缓冲液。
离心并轻弹板以弃去上清液。

添加 200 μL 的 FACS 缓冲液。

表 2. 细胞外 (ECS) 抗体混合物。滴定抗体以确定我们的细胞系和流式细胞仪设置的理想染色浓度。

每个样品的电压	目标	荧光团	克隆
2.5微升	hCD3	BV711	OKT3
2.5微升	CD8a	AF700	命中8a
0.5微升	hCD4	APC/Cy7	SK3
2.5微升	mTCRβ	BV421	H57-597
92微升	流式细胞仪缓冲液
100微升	总容积

细胞内染色（ICS）：
1. 离心并轻弹板以弃去上清液。
2. 将沉淀重悬于 100 µL Cytofix/Cytoperm 中。
3. 4°C 避光孵育 15 分钟。
4. 当日继续步骤 3e 进行染色或暂停过夜，如下所示：
  
  暂停点：
  
  我。添加 100 μL 的 FACS 缓冲液。
  
  二.离心并轻弹以丢弃上清液。
  
  三.添加 200 μL 的 FACS 缓冲液。
  
  四.离心并轻弹以丢弃上清液。
  
  v. 将沉淀重悬于 200 µL FACS 缓冲液中。
  
  六. 4°C 避光保存过夜。
  
  七.准备烫/洗工作溶液 (WS)：用 Milli-Q H ₂ O按 1:10 稀释。
  
  八.离心并轻弹板以弃去上清液。
  
  九.将颗粒重新悬浮在 100 μL 的 Perm/Wash WS 中。
  
  X。 4°C 避光孵育 15 分钟。
  
  xi.继续步骤 3e。
5. 添加 100 µL 烫发/清洗 WS。
6. 离心并轻弹板以弃去上清液。
7. 用 200 µL Perm/Wash WS 再次清洗。
8. 根据您的科学问题准备 ICS 抗体混合物。例如，请参见表 3。
9. 离心并轻弹板以弃去上清液。
10. 将颗粒重新悬浮在 100 µL ICS 抗体混合物中。
11. 4°C 避光孵育 25 分钟。
12. 添加 100 µL 烫发/清洗 WS。
13. 离心并轻弹板以弃去上清液。
14. 用 200 µL Perm/Wash WS 再次清洗。
15. 离心并轻弹板以弃去上清液。
16. 将颗粒重新悬浮在 100–200 µL FACS 缓冲液中。
17. 通过样品的流式细胞术分析获取数据。
  
  表 3. 细胞内 (ICS) 抗体混合物。滴定抗体以确定我们的细胞系和流式细胞仪设置的理想染色浓度。
  
  每个样品的电压目标荧光团克隆
  
  4微升人TNFα AF488 单克隆抗体11
  
  96微升流式细胞仪缓冲液
  
  100微升总容积

^{CD8 +}与 CD4 ⁺ T 细胞克隆衍生的 TCR 的功能测试

如图3A所示，许多人类肿瘤细胞，包括PDAC细胞，在用IFNγ预处理后，可以被诱导在细胞表面表达HLA II类。这使得能够对源自 CD4 ⁺ TIL 的 TCR 的抗肿瘤反应性进行功能筛选，这对于表达耗尽或 Treg 相关基因特征的CD4 ⁺ TIL尤为重要[3,24–27]。图 6 所示的实验表明，我们的功能性 TCR 筛选测定可以有效地识别源自 CD8 ⁺和 CD4 ⁺ T 细胞克隆的肿瘤反应性 TCR，前提是所使用的 T 细胞表达与 T-细胞克隆相匹配的共受体。从中分离 TCR 的细胞克隆（参见注释 9）。鉴于后者，我们通过 FACS 分选和随后的扩展，生成了主要 (> 90%) 由 CD8 ⁺或 CD4 ⁺ T 细胞组成的 T222 系，并在我们的研究中包括了 CD8 ⁺ /CD4 ⁺比率的测定。细胞批次生成的常规质量控制。

图 6.CD8/CD4 共受体表达对于有效检测 T 细胞受体 (TCR) 介导的 T 细胞激活的重要性。 5 小时共培养实验的代表性示例，其中肿瘤反应性 (TR) 和非肿瘤反应性 (NTR) TCR，源自单个胰腺导管腺癌 (PDAC) 的人 CD8 ⁺和 CD4 ⁺肿瘤浸润 T 细胞）肿瘤样本，测试了针对自体、IFNγ预处理的肿瘤细胞的反应性。 TCR 转染人 CD8 ⁺（上图）或 CD4 ⁺（下图）T222 细胞。点图描绘了 CD3 ⁺ mTCRβ ⁺ T 细胞中 CD107a 和 TNFα 的表达，从而表明，正如预期的那样，CD107a 是 CD8 ⁺ T 细胞的主要激活标记，而 TNFα 是 CD4 ⁺ T 细胞的主要激活标记。此外，这些数据表明，通过使用表达与来源 T 细胞相匹配的共受体的人 T 细胞，可以强烈促进 TCR 反应性的检测。

来自同基因小鼠肿瘤模型的 TCR 的功能测试

在一项与从人类 PDAC 样本的 scRNAseq 数据集中筛选 TIL 衍生 TCR 并行的研究中，我们使用人类 T222 细胞的功能筛选测定，基于可移植小鼠 PDAC 肿瘤模型 [18] 进行了类似分析。如上所述（Kehm 等人[28]）。我们的方案，如程序 B 中所述，对于源自小鼠 CD8 ⁺ T 细胞（图 7）和 CD4 ⁺ T 细胞（未显示）的 TCR 同样有效，前提是应用以下三个修改：

当在人 T 细胞中表达时，源自小鼠 CD8 ⁺和 CD4 ⁺ T 细胞的 TCR 有效识别抗原需要分别共转染小鼠 CD8 ⁺和 CD4 ⁺共受体。鉴于此，将人类 T 细胞与编码 mRNA 的小鼠 TCR（每 5 × 10 ⁶细胞 5 µg）和小鼠 CD8A 和 CD8B（每 5 × 10 ⁶细胞各 2.5 µg）或 CD4（每 5 × 10 6 细胞 5 µg）共转染。 × 10 ^{6 个}单元）。
为了增强 MHC 限制性抗原呈递，请用 3,000 IU/mL 小鼠 IFNγ 预处理小鼠肿瘤细胞 48 小时，同时考虑注释 2 下的注意事项。为了在小鼠肿瘤细胞上实现 MHC II 类的充分诱导以进行筛选CD4 ⁺ TCRs，用 IFNγ 联合 MEK 抑制剂 (100 nM MEKi GDC-0623) 预处理肿瘤细胞，如 Baumann 等人所述。 [18]。

调整流式细胞术染色面板以包括抗小鼠 CD8a 和 CD8b 或 CD4。请参阅表 4 了解我们的染色面板。如果小鼠肿瘤细胞（例如 B 细胞肿瘤）表达 Fc 受体，则在细胞外染色之前进行小鼠 Fc 受体阻断 [18]。

表 4. CD8 ⁺小鼠 T 细胞受体 (TCR) 的细胞外 (ECS) 抗体混合物。滴定抗体以确定我们的细胞系和流式细胞仪设置的理想染色浓度。在共培养过程中使用抗人 CD107a-APC 以避免与 mCD8b-PE 光谱重叠。在筛选小鼠 CD4 ⁺ T 细胞衍生的 TCR时，我们使用抗小鼠 CD4-PE (1:100) 代替 mCD8b 来验证共受体表达。

每个样品的体积	目标	荧光团	克隆
2.5微升	hCD3	BV711	OKT3
1微升	mCD8a	聚氯乙烯	53-6.7
1微升	mCD8b	聚乙烯醇	YTS156.7.7
2.5微升	mTCRβ	BV421	H57-597
93微升	流式细胞仪缓冲液
100微升	总容积

图 7. 小鼠来源的 T 细胞受体 (TCR) 的功能测试需要小鼠共受体的共转导。实验的代表性例子涉及对从表达鸡卵清蛋白 (OVA) 新抗原的可移植小鼠胰腺导管腺癌 (PDAC) 模型中分离的 TCR 进行功能测试 [18]，其中大约 50% 被发现针对 OVA [28]。鉴于我们对人类肿瘤衍生 TCR 的 TCR 筛选装置的可靠性已得到证实，我们应用相同的方案来测试 > 100 个小鼠 PDAC 肿瘤衍生 TCR 的抗肿瘤反应性。该图显示的是与来自 OT-1 TCR 转基因小鼠的 OVA/SIINFEKL 特异性 TCR 相比，用来自肿瘤浸润 CD8 ^{+ T 细胞克隆的 TCR 转染的人 CD8}⁺ T222 细胞的反应性菌株针对经 IFNγ 预处理的表达 OVA 的小鼠 PDAC 肿瘤细胞和 OVA 阴性亲代细胞。点图描绘了CD3 ⁺ mTCRβ ^{+ T 细胞中 TNFα 和小鼠-CD8a}⁺的表达，从而表明两种 TCR 仅介导针对表达 OVA 的肿瘤细胞的 T 细胞反应性。此外，数据表明，在没有小鼠 CD8 ⁺共受体共转染的情况下，很容易检测到强 OT-1 衍生的 TCR 的反应性，而小鼠 CD8 显着促进了较弱 TCR 反应性的检测。共转染。值得注意的是，这并没有显着增加 T 细胞对 OVA 阴性肿瘤细胞的反应性。

数据分析

^{使用 LSRFortessa TM}采集样品并使用 FlowJo 软件进行分析。我们的门控策略见图 S3。

协议验证

该协议用于以下研究文章：

孟等人。 [7]。基于转录组的人类胰腺癌中肿瘤反应性和旁观者 CD8 ^{+ T 细胞受体克隆型的鉴定。}科学。译。医学。 15（722）：eadh9562。
孙等人。 [23]。 ROTAC 利用信号无能的 R-spondin 进行靶向蛋白质降解。细胞化学。生物。 30（7）：739–752.e8。
奥夫林加等人。 [29]抗原反应性T细胞受体，国际专利WO 2022/200457 A1
Kehm，H.，Baumann，D，Meng，Z.，Zens，S.，Riemer，A.，Volkmar，M.，Poschke，I，Offringa，R.肿瘤反应性和旁观者 T 细胞库的解剖胰腺癌小鼠模型（手稿正在准备中）[28]
Rodriguez Ehrenfried，A，Steffens，LK，Meng，Z.，Poschke，I.，Volkmar，M.，Offringa，R。人类胰腺癌中肿瘤反应性 CD4 ⁺效应子和调节性 T 细胞亚群的鉴定和功能分析。（手稿正在准备中）[27]

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

对于我们的 T222 系，我们观察到在 72 小时预培养阶段细胞数量增加了 2 倍，并且由于电穿孔导致细胞损失 25%–50%。对于其他 TIL 衍生的 T 细胞系，我们发现了其他增益/损失比。为了最终获得足够数量的活 TCR 转染 T 细胞用于预期实验，重要的是要充分了解这种增益/损失比率，并在此基础上决定总共需要多少 T 细胞被转染。请参见图 S2，了解整个检测方案中 T 细胞数量发展的示例。
IFNγ 制剂的生物活性可能有很大差异。鉴于此，以 IU/mL 定义的浓度仅应作为粗略指示，建议进行试点实验来测试 IFNγ 增加肿瘤细胞 HLA/MHC 表面表达的最佳浓度。为了保持一致性，将 IFNγ 库存溶液分装成等份，并避免重复冷冻/解冻。注意：IFNγ浓度过高会影响肿瘤细胞的活力。
尽可能高效地工作。转染后细胞对温度特别敏感。较短的处理时间对于细胞活力至关重要。因此，细胞应在电穿孔后最迟 5 分钟转移至培养箱中，以避免细胞活力过度丧失。
虽然我们的默认测定设置涉及预先接种肿瘤细胞以使其粘附，但也可以通过接种非粘附肿瘤/靶细胞或新鲜胰蛋白酶处理的细胞，然后立即添加 T 细胞来成功进行测定。在这种情况下，在共培养当天（第 4 天；参见图 4）收集肿瘤/靶细胞。用 T 细胞培养基清洗两次，在室温 (21°C) 下以 350× g离心 5 分钟，并弃去上清液。以所需浓度重悬于 T 细胞培养基中，每孔接种 50 µL 细胞悬浮液。使用 U 形底 96 孔板代替平底板。根据图 5 所示的测定布局，将肿瘤细胞添加到 T 细胞/肿瘤细胞共培养物中。为了获得最佳的测定灵敏度，使用效应器与靶细胞的比例范围为 1:1 至 1:8；有关这方面的进一步指导，请参见图 S4。
为了评估肿瘤反应性 TCR 是否针对特定 T 细胞表位，例如通过肿瘤突变组分析预测的新表位，我们的测定装置可以轻松适应不同靶细胞的使用，例如肽脉冲或小基因-转染的抗原呈递细胞[7]。
我们发现，在培养过程中添加抗 CD107a 抗体会产生更强的累积信号，同时不会影响细胞活力。值得注意的是，该程序符合大多数已发布的 CD107a 染色方案。
在 500 µL DMSO 中重建死细胞标记物 (DCM)，并储存在 10 µL 等分试样中，以避免冷冻/解冻循环。
如果使用非贴壁或新鲜胰蛋白酶处理的肿瘤/靶细胞进行测定，请勿将细胞转移到 V 形底板中，而是在 U 形底板中进行染色。这将避免转移过程中不必要的细胞损失。
我们发现，从具有基于基因特征的预测肿瘤反应性（显示针对自体肿瘤细胞的反应性）的 TIL 克隆中分离的 TCR 比例，CD4 ⁺克隆型低于 CD8 ⁺克隆型。这种差异很可能与 HLA I 类和 II 类抗原加工途径之间的关键差异有关 [11]。因此，大多数HLA II类限制性表位仅由专业抗原呈递细胞（例如树突状细胞和肿瘤相关巨噬细胞）呈递在肿瘤微环境中，而只有一小部分也由肿瘤细胞直接呈递。

致谢

该协议改编自我们之前的工作，如孟等人所述。 [7]。

资金来源：KH Bauer 基金会（RO、IP 和 MV）。德国教育和研究部（BMBF；IP，项目 TIL-REP，01ZY1403A）。美因茨亥姆霍兹转化肿瘤学研究所（HI-TRON；ARE 和 MV）。中国留学基金委（ZM）。德国癌症研究中心研究生院（LS 和 HK）。德国癌症研究中心与科学技术和航天部以及德国-以色列亥姆霍兹国际研究学院/Cancer-TRAX计划（SZ）的合作研究计划。亥姆霍兹基金会免疫学和炎症项目（CL，胰腺癌 TCR 基因治疗项目）。德国综合癌症中心（CL，项目 NEO-ATT）。中德胰腺癌个体化医疗实验室（ZM和RO）。约阿希姆·赫兹基金会 (LS)。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

道德考虑

PDAC样本及其肿瘤浸润淋巴细胞由海德堡大学医院在知情书面同意的基础上通过欧洲胰腺中心提供。该研究得到了当地伦理委员会的批准（Nr. S-708/2019），并按照赫尔辛基宣言进行。

所有动物程序均得到政府当局（德国卡尔斯鲁厄地区行政当局）的批准，并遵守机构实验动物研究指南。

参考

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