材料与试剂

生物材料

BHY845 [ MAT a ura3Δ0 leu2Δ0 his3Δ1 act1Δ::Nat ^R (pBH839 = 2μ LEU2 GPD ^pr -HsACTB)]仅表达人 β 肌动蛋白的酿酒酵母菌株 (Haarer 等人，2023)；由于专利申请未决，可通过材料转让协议 (MTA) 获得（请参阅利益冲突声明）。
BHY848 [ MAT α ura3Δ0 leu2Δ0 his3Δ1 mfa1Δ:: MFA1 ^pr-SpHIS5 act1Δ::Nat ^R (pBH869 = 2μ LEU2 GPD ^pr -HsACTG1)]仅表达人类 γ 肌动蛋白的酿酒酵母菌株 (Haarer)等，2023）；可根据要求提供，如上所述。

试剂

细菌蛋白胨（BD-Gibco，目录号：211677）
Bacto酵母提取物（BD-Gibco，目录号：212750）
Bacto 琼脂（BD-Difco，目录号：214010）
葡萄糖（Sigma，目录号：G-7021；Mallinckrodt，目录号：4908）
冰醋酸（Fisher，目录号：A38-212）
盐酸（HCl）（Fisher，目录号：A144S-212）
Tris 碱（Fisher，BP152-5）或 Trizma 碱（Sigma，目录号：T6066）
乙酸钠（JT Baker，目录号：3470-01；Fisher，目录号：BP333-500）
氯化钠（NaCl）（Sigma，目录号：S7653）
碳酸氢钠（NaHCO ₃）（Sigma，目录号：S5761）
甲酰胺，去离子（Sigma，目录号：F9037）
氯化铵（NH ₄ Cl）（Sigma，目录号：A9434）
氯化钾（KCl）（JT Baker，目录号：3040-01）
二水氯化钙（CaCl ₂ ·2H ₂ O）（Fisher，目录号：BP510-500）
CNBr 激活的 Sepharose 4B（Cytiva，目录号：17-0430-01）
脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）（Worthington，目录号：LS002007）
Bio-Rad 蛋白质测定染料试剂（Bio-Rad，目录号：5000006）
Calbiochem蛋白酶抑制剂鸡尾酒IV（Millipore-Sigma，目录号：539136）
苯甲基磺酰氟（PMSF）（Sigma，目录号：P7626）
氯化镁，六水合物（MgCl ₂ ·6H ₂ O）（JT Baker，目录号：4003-01）
乙二醇-双（2-氨基乙醚）-N,N,N',N'-四乙酸（EGTA）（Sigma，目录号：E4378）
腺苷5'-三磷酸，三水合二钠（ATP）（GoldBio，目录号：A-081-25）
二硫苏糖醇（DTT）（Bio-Rad，目录号：161-0611；GoldBio，目录号：DTT25）
氢氧化钾（KOH）（Fisher，目录号：P250-500）
氢氧化钠（NaOH）（Fisher，目录号：BP359-500）
叠氮化钠（Fisher，目录号：BP922I-500）

解决方案

40% (w/v) 葡萄糖
1 毫摩尔盐酸
1 M Tris pH 8.0
1 M Tris pH 7.5
3M氯化钾
1 M 氯化镁₂
0.5 M CaCl ₂
5M 氯化钠
2%叠氮化钠
YPD 培养基 (1 L)，液体（参见配方）
YPD 培养基 (1 L)，平板（参见配方）
40% 葡萄糖 (1 L)（参见食谱）
偶联缓冲液 (250 mL)（参见配方）
低 pH 洗涤缓冲液 (100 mL)（参见配方）
高 pH 洗涤缓冲液 (100 mL)（参见配方）
0.5 M 乙酸钠，pH 4 (500 mL)（参见配方）
1 M tris，pH 7.5 或 pH 8.0 (1 L)（参见配方）
DNase I 存储缓冲液 (100 mL)（参见配方）
G-缓冲液 (50 mL)（参见配方）
裂解缓冲液 (50 mL)（参见配方）
肌动蛋白洗涤缓冲液 1 (50 mL)（参见配方）
肌动蛋白洗涤缓冲液 2 (50 mL)（参见配方）
肌动蛋白洗脱缓冲液 (20 mL)（参见配方）
20× F-缓冲液 (1 mL)（参见配方）
100 mM PMSF (100 mL)（参见配方）
0.5 M ATP (20 mL)（参见配方）
1 M DTT (50 mL)（参见配方）
0.5 M EGTA (100 mL)（参见配方）

食谱

YPD 培养基 (1 L)，液体

试剂	最终浓度	数量
细菌蛋白胨	2%（重量/体积）	20克
细菌酵母提取物	1%（重量/体积）	10克
水_分子		900毫升
葡萄糖（右旋糖）	4%（重量/体积）	100 mL 40% 库存（参见下面的注释*）

*注：将蛋白胨和酵母提取物溶液与 40% 葡萄糖溶液分开进行高压灭菌。这限制了介质焦糖化以及与介质成分的反应。因此，为了完成 YPD，请在无菌条件下将无菌蛋白胨-酵母溶液添加到无菌葡萄糖中（即 900 mL 蛋白胨-酵母溶液和 100 mL 40% 葡萄糖）。单独的培养基成分可在室温下保存数周，或在 4 °C 下保存更长时间。

YPD 培养基 (1 L)，板

试剂	最终浓度	数量
细菌蛋白胨	2%（重量/体积）	20克
细菌酵母提取物	1%（重量/体积）	10克
细菌琼脂	1.8%（重量/体积）	18 克（见注释*）
水_分子		900毫升
葡萄糖（右旋糖）	4%（重量/体积）	100 mL 40% 库存（参见下面的注释*）

*注：对于平板，将琼脂添加到蛋白胨和酵母提取物溶液中，添加磁力搅拌棒，然后高压灭菌。高压灭菌后，加入无菌40%葡萄糖溶液，置于搅拌盘上，缓慢搅拌，避免产生气泡；冷却至~55°C。小心地将培养基和琼脂溶液倒入（35-40）个无菌培养皿（10 cm）中，并在室温下在长凳上放置 1-2 天；板可以在室温下倒置在密封培养皿袋中保存数周，或在 4°C 下保存更长时间。

40% 葡萄糖 (1 L)

过滤灭菌或高压灭菌

试剂数量

葡萄糖（右旋糖） 400克

水_分子至 1 升

偶联缓冲液 (250 mL)

试剂	最终浓度	库存溶液	数量
碳酸氢钠	0.1M		2.1克
氯化钠	0.5M	5M	25毫升
氯化钙	0.1毫摩尔	0.5M	50微升
水_分子			最终体积达到 250 mL

低 pH 洗涤缓冲液 (100 mL)

试剂 最终浓度 库存溶液 数量

乙酸钠，pH 4 0.1M 0.5 M，pH 4 20毫升

氯化钠 0.5M 5M 10毫升

水_分子 70毫升

高 pH 洗涤缓冲液 (100 mL)

试剂 最终浓度 库存溶液 数量

三羟甲基氨基甲烷，pH 8 0.1M 1 M，pH 8 10毫升

氯化钠 0.5M 5M 10毫升

水_分子 80毫升

0.5 M 乙酸钠，pH 4 (500 mL)

试剂数量

乙酸钠 20.5克

冰醋酸至 pH 4.0

水_分子至 500 毫升

1 M tris，pH 7.5 或 pH 8.0 (1 L)

试剂数量

Tris碱基 121.1克

盐酸 pH 值 7.5 或 8.0

水_分子至 1 升

DNase I 存储缓冲液 (100 mL)

试剂	最终浓度	库存溶液	数量
三羟甲基氨基甲烷，pH 7.5	50毫米	1M	5毫升
氯化钠	0.5M	5M	10毫升
叠氮化钠	0.02%（重量/体积）	2%（重量/体积）	1毫升
水_分子			84毫升

G 缓冲液 (50 mL)

试剂	最终浓度	库存溶液	数量
三羟甲基氨基甲烷，pH 7.5	10毫米	1M	0.5毫升
氯化钙	0.2毫摩尔	0.5M	20微升
ATP	0.5毫米	0.5M	50 µL（参见下面的注释*）
数码地面电视	0.2毫摩尔	1M	10微升*
水_分子			49.4 毫升*

*注：使用当天添加ATP和DTT溶液；将含有 ATP 和 DTT 的 G 缓冲液储存在冰上或 4 °C 下。

裂解缓冲液（G 缓冲液和蛋白酶抑制剂；50 mL）

试剂	最终浓度	库存溶液	数量
三羟甲基氨基甲烷，pH 7.5	10毫米	1M	0.5毫升
氯化钙	0.2毫摩尔	0.5M	20微升
ATP	0.5毫米	0.5M	50微升
数码地面电视	0.2毫摩尔	1M	10微升
PMSF	0.1毫摩尔	0.1M	50微升
Calbiochem 蛋白酶抑制剂鸡尾酒 IV	0.2%（体积比）		100微升
水_分子			49.27 毫升

肌动蛋白洗涤缓冲液 1（G 缓冲液和 10% 甲酰胺；50 mL）

试剂	最终浓度	库存溶液	数量
三羟甲基氨基甲烷，pH 7.5	10毫米	1M	0.5毫升
氯化钙	0.2毫摩尔	0.5M	20微升
ATP	0.5毫米	0.5M	50微升
数码地面电视	0.2毫摩尔	1M	10微升
PMSF	0.1毫摩尔	0.1M	50微升
甲酰胺	10%（体积/体积）		5毫升
水_分子			44.37 毫升

肌动蛋白洗涤缓冲液 2（G 缓冲液和 0.2 M NH ₄ Cl；50 mL）

试剂	最终浓度	库存溶液	数量
三羟甲基氨基甲烷，pH 7.5	10毫米	1M	0.5毫升
氯化钙	0.2毫摩尔	0.5M	20微升
ATP	0.5毫米	0.5M	50微升
数码地面电视	0.2毫摩尔	1M	10微升
氯化铵	0.2M	0.5M	20毫升
水_分子			29.42毫升

肌动蛋白洗脱缓冲液（G 缓冲液和 50% 甲酰胺；20 mL）

试剂	最终浓度	库存溶液	数量
三羟甲基氨基甲烷，pH 7.5	10毫米	1M	0.2毫升
氯化钙	0.2毫摩尔	0.5M	8微升
ATP	0.5毫米	0.5M	20微升
数码地面电视	0.2毫摩尔	1M	4微升
甲酰胺	50%（体积/体积）		10毫升
水_分子			9.77 毫升

20× F 缓冲液 (1 mL)

10 mM tris pH 7.5、500 mM KCl、80 mM MgCl ₂、20 mM EGTA、10 mM ATP

试剂	最终浓度	库存溶液	数量
三羟甲基氨基甲烷，pH 7.5	10毫米	1M	10微升
氯化钾	0.5M	3M	167微升
氯化镁	80毫米	1M	80微升
EGTA	20毫米	0.5M	40微升
ATP	10毫米	0.5M	20微升
水_分子			683微升

100 mM PMSF (100 mL)

储存于-20°C

试剂数量

PMSF 1.74克

100%乙醇至 100 毫升

0.5 M ATP (20 毫升)

将过滤灭菌的冷冻等分试样储存在-20°C

试剂数量

ATP 6.05克

氢氧化钾 pH 值 ~ 7.2

水_分子至 20 毫升

1 M DTT (50 mL)

将过滤灭菌的冷冻等分试样储存在-20°C

试剂数量

数码地面电视 7.71克

水_分子至 50 毫升

0.5 M EGTA (100 毫升)

试剂数量

EGTA

氢氧化钠

19.0克

至 pH 8

水_分子至 100 毫升

实验室用品

50 mL 锥形管（Thermo Fisher Scientific，Falcon，目录号：1495949A）
15 mL锥形管（Thermo Fisher Scientific，Falcon，目录号：1495949B）
Pierce 5 mL 一次性柱，包括聚乙烯盘、塞子和端盖（Thermo/Pierce，目录号：29922）
适用于 Pierce 柱的漏斗（Thermo/Pierce，目录号：29923）
培养皿（Kord-Valmark，目录号：2900）
2 L 锥形瓶
注射器过滤器，0.45 μm（Genesee Scientific，目录号：25-242）
Slide-A-Lyzer 透析盒，7,000 或 10,000 MWCO（Thermo Fisher Scientific，目录号分别：66370 和 66380）
透析管，12,000–14,000 MWCO，25 mm 宽（Fisher Scientific，目录号：21-152-18）
蛋白质浓缩器：Vivaspin-6，5,000 MWCO（Sartorius，目录号：VS0611）；Amicon Ultra-4，10,000 MWCO（Millipore-Sigma，目录号：UFC801024）

设备

磁力搅拌板（可选；用于制作 YPD 板）
振荡培养箱能够在 30 °C 下容纳多个 2 L 烧瓶
用于细胞密度测量的分光光度计（Bio-Rad，型号：SmartSpec 3000）
摇杆或旋转器，最好在 4 °C 下（例如，在冷室或色谱柜中）
离心机：
1. 用于制备树脂的冷冻台式离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra X-15R）
2. 超高速离心机（Thermo Scientific/Sorvall，型号：Lynx 4000）和转子（Thermo Scientific，型号：F10-4x1000 LEX），用于收获 1–2 L 酵母
3. 用于澄清酵母裂解物的超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima LE-80K）和转子（Beckman Coulter，型号：70 Ti）
4. 用于澄清肌动蛋白溶液的台式超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima Max-XP）和转子（Beckman Coulter，型号：TLA100、TLA100.2、TLA100.3）
法国压力机和带 1 英寸直径活塞的压力传感器（美国仪器公司/SIM-Aminco）
蛋白质凝胶装置和电源（Bio-Rad，型号：Mini-Protean Tetra、PowerPac Basic Power Supply）
可选：用于测定蛋白质浓度的分光光度计（Thermo Scientific，型号：NanoDrop 2000）

程序

细胞生长
1. 将冷冻甘油原液中的 BHY845 和 BHY848（分别表达 β- 和 γ ₁ - 肌动蛋白）菌株划线到 YPD 平板（4% 葡萄糖）上，并在 30°C 下孵育直至菌落形成（4-6 天；这些菌株生长特别缓慢），倍增时间比野生型实验室菌株长约 4-6 倍）。
2. 将每个菌株的几个菌落接种到装有 50 mL YPD（4% 葡萄糖）的烧瓶中；在 30°C 的摇床上生长过夜。
3. 使用步骤 A2 中的 25–40 mL 培养物接种 1 L YPD 培养物；在 30°C 的摇床上孵育。
4. 将菌株培养至 OD ₅₉₅ ~1.5–2，可能需要约 1.5–2 天。
5. 通过离心收获酵母细胞，例如，在 250 mL 瓶中使用 Beckman JA12 转子以 7,000 rpm (7,900× g ) 离心 7 分钟。
6. 倒出培养基并在 10 mM Tris、pH 7.5、0.2 mM CaCl ₂中重悬细胞（例如，通过涡旋）；转移至 50 mL 锥形管。颗粒通常填充管中 6-7 mL 的空间。
7. 在 4 °C 下以 3,500× g旋转10 分钟，倒出，然后在 -80 °C 下冷冻沉淀。

将 DNase I 与 Sepharose 4B 偶联（DNase I-树脂制剂）
1. 将 3 g CNBr 活化的 Sepharose 4B 在 50 mL 锥形管中的冰冷 1 mM HCl 中溶胀；放置在摇杆或旋转器上以驱散持久的团块。
2. 通过约 2,000× g离心2 分钟收集活化的珠子；用 1 mM HCl 洗涤两次，每次洗涤时使体积达到 50 mL。
3. 将 100 mg DNase I 重悬于偶联缓冲液中，终浓度为 5 mg/mL；保存一小份 (~100 μL) DNase I 悬浮液，以便稍后计算偶联效率，并将剩余部分添加到树脂中。在摇杆或旋转器上于 4°C 孵育偶联反应过夜。
4. 让树脂在冰上沉降或通过约 2,000× g离心2 分钟收集；除去并保存上清液用于计算偶联效率。
5. 添加 25 mL 冷 0.1 M Tris pH 8.0 以封闭珠子上未反应的位点。4°C 摇动 2 小时。
6. 通过以约 2,000× g离心2 分钟收集树脂。清洗树脂，使用以下每种溶液 25 mL 交替三次：
  1. 低 pH 值洗涤缓冲液。
  2. 高 pH 值洗涤缓冲液。
7. 用 25 mL DNase I 存储缓冲液清洗树脂两次；重悬于 DNase I 储存缓冲液中并储存于 4 °C。
8. 通过比较偶联前（步骤 B3）和偶联后（步骤 B7）溶液的 DNase I 浓度来确定偶联效率；这可以使用标准蛋白质测定试剂[例如，Bio-Rad 蛋白质测定试剂、Bradford 试剂、Lowry 试剂或直接 A ₂₈₀测量（A ₂₈₀ of 1 = 0.5 mg/mL DNase I）] 来完成。耦合效率应约为 95%–98%。

柱填充：2 × 3 mL 柱
1. DNase I-Sepharose 树脂将装入两个 Pierce 聚丙烯柱中，该柱由两个 5 mL 聚丙烯柱、两个过滤盘、两个柱端盖和两个柱顶漏斗组装而成。
2. 使用倒置的 1 mL 移液器吸头，将一个过滤盘推至每根柱的底部，并让 5 mL 的 ddH ₂ O 通过每个柱。
3. 将漏斗/储液罐连接到色谱柱顶部：使用封口膜密封漏斗颈和色谱柱之间的潜在泄漏点（图 1A 和 1B）。
  
  图 1. 一次性色谱柱组件图。(A) 示意图和 (B) 描述柱装置的照片。详细信息请参见协议 D 部分。
4. 盖上柱子，添加 3 mL 水，并使用标记记下柱子上的顶部水位。打开柱盖并通过重力流除去水。
5. 逐渐将树脂添加到柱中，使其随着柱的流动通过重力缓慢沉降。添加足够的树脂以达到 3 mL 标记。
6. 用 DNase I 存储缓冲液冲洗色谱柱和储液槽，通过重力流沉淀剩余的树脂。
7. 用 3–5 倍柱体积 (CV) 的 DNase I 存储缓冲液清洗柱；然后，盖上柱子（例如，用封口膜覆盖）并储存在 4°C 下直至使用（D 部分）。
8. 色谱柱通常可重复用于多次（3-5）次纯化。每次纯化后，应使用至少 5 个 CV 的 G 缓冲液清洗柱，然后清洗（3-5 个 CV）并储存在 DNase I 储存缓冲液中。

肌动蛋白纯化 [修改自 Goode (2002) 和 Aggeli 等人。(2014)]
1. 在 ~15 mL 裂解缓冲液中解冻从 1 L 培养基获得的细胞沉淀。
2. 通过压力设置为 1,000 psi 的法压机 2 次裂解细胞（在具有 1 英寸直径活塞的压力单元中为 16,000 实际 psi）。
3. 在 4 °C 下以 ~17,000–20,000× g旋转裂解物30 分钟（例如，在 Beckman JA20 转子中以 12 krpm 旋转）。
4. 将上一步的上清液在 Beckman Ti70 转子中以 50,000 rpm (256,600× g ) 在 4°C 下旋转 50 分钟。
5. _{用 15 mL（5 个 CV）补充有 0.2 M NH 4} Cl的 G 缓冲液清洗每 3 mL 的 DNase I-Sepharose 柱，然后用补充有 0.1 mM PMSF 的 15 mL G 缓冲液清洗。
6. 通过 0.45 μm 注射器过滤器过滤澄清的上清液（图 2A，泳道 1 和 2）。
  
  图 2. β- 和 γ-肌动蛋白纯化步骤的考马斯染色 SDS-PAGE 凝胶。(A–B) 两张凝胶显示 β- 和 γ-肌动蛋白的纯化步骤。50% 甲酰胺洗脱后的相对量如下：泳道 7 和 8：总洗脱液的 1/900；泳道 9 和 10：透析后浓缩样品的 1/100；泳道 11 和 12：G-肌动蛋白沉淀的 1/10（悬浮在凝胶上样缓冲液中后）；泳道 13 和 14：KCl 处理的 F-肌动蛋白上清液的 1/75；泳道 17 和 18：1/10 的 G-肌动蛋白沉淀（悬浮在凝胶上样缓冲液中后）；泳道 19 和 20：最终肌动蛋白制剂的 1/200。缩写：MW，分子量标记；HSS，高速上清液；Sup，上清液；F-肌动蛋白，丝状肌动蛋白；G-肌动蛋白，球状（单体）肌动蛋白。
7. 将上清液加载到 DNase I 柱上并允许滴过（图 2A，泳道 3 和 4）。
  
  注意：可以通过蛋白质印迹收集和分析“耗尽”的流出液，以确定结合程度以及肌动蛋白是否已饱和 DNase I 树脂。
8. 用以下清洗每列：
  1. 15 mL（即 5 个 CV）肌动蛋白洗涤缓冲液 1（图 2A，泳道 5 和 6）。
  2. 15 mL 肌动蛋白洗涤缓冲液 2。
  3. 15 mL G 缓冲液。
9. 用肌动蛋白洗脱缓冲液从每根柱上洗脱肌动蛋白（甲酰胺会破坏肌动蛋白与 DNA 酶 I 的相互作用，可能使一种或两种蛋白质变性）；对于 3 mL 树脂，向柱中添加 2 mL（<1 CV）肌动蛋白洗脱缓冲液，并丢弃所得的流出液，然后再添加 4 mL 并收集流出液，滴入含有 2 mL G 缓冲液的管中（此有助于立即降低甲酰胺浓度和整体肌动蛋白变性）（图 2A，泳道 7 和 8）。
10. 在 Slide-A-Lyzer 盒 (10,000 MWCO) 或透析管 (12,000–14,000 MWCO) 中于 4 °C 下对 2 L G 缓冲液透析过夜；此步骤将甲酰胺浓度降低至约 0.1%，并将新鲜的 G 缓冲液引入肌动蛋白溶液中。
11. 使用基于离心的蛋白质浓缩器将透析后的肌动蛋白溶液浓缩至约 0.5–1.5 mL（图 2A，泳道 9 和 10）；我们已成功使用 Vivaspin 5000 MWCO 和 Amicon Ultra 10,000 MWCO 离心浓缩器完成此步骤。
12. 分配到 1 mL 超速离心管中，并在 213,000× g（Beckman TLA100.2 转子中 70,000 rpm）下澄清肌动蛋白 30 分钟，4°C。此步骤去除聚集的肌动蛋白（图 1B，泳道 11 和 12）。
  
  注意：使用更高容量的 TLA100.3 转子和相关管，可以在此处和后续步骤中容纳更大的体积。
13. 将每管最多 760 μL 的 G-肌动蛋白上清液分配到新的 1 mL 超速离心管中。
14. 在每个 1 mL 超速离心管中添加 20× F-缓冲液至 1× 最终浓度（即，将 40 μL F-缓冲液添加到步骤 D13 管中已存在的 760 μL G-肌动蛋白中）。在室温下孵育管 20 分钟以聚合 F-肌动蛋白。
15. 将 KCl 添加到 600 mM 最终溶液中（即，将 200 μL 3 M KCl 库存添加到步骤 D14 中的 800 μL 混合物中）。室温孵育 1 小时。此步骤促进潜在宿主肌动蛋白丝切蛋白污染物的解离。
16. 通过在 20°C 下以 213,000× g离心30 分钟收集 F-肌动蛋白。取出并丢弃上清液（图 2B，泳道 13 和 14）。
17. 用约 200 μL 的 G 缓冲液冲洗 F-肌动蛋白颗粒（图 2B，泳道 15 和 16），然后重悬于约 500 μL 的 G 缓冲液中。在冰上解聚肌动蛋白丝过夜或至少 3 小时。使用 P200 移液器或杜恩斯均质化机械剪切肌动蛋白丝将进一步加速解聚。
18. 通过在 4°C 下以 213,000× g离心30 分钟去除解聚不合格的肌动蛋白和肌动蛋白聚集体（图 2B，泳道 17 和 18）。
19. 将上清液（G-肌动蛋白）转移至新的 1 mL 超速离心管中。确定浓度和产量（例如，使用 Bio-Rad 蛋白质测定试剂并与已知量的 BSA 进行比较）。
20. 在 10%–15% 聚丙烯酰胺凝胶上运行 200–300 ng 肌动蛋白以评估纯度（图 2B，泳道 19 和 20）。
21. 为了进一步提高肌动蛋白的纯度，请进行 2-3 个额外的聚合/解聚“循环”（浓度允许）。要循环肌动蛋白，添加 20× F-缓冲液至 1× 最终浓度，在室温下孵育 20 分钟，然后重复上述步骤 D16–D19。在 SDS-PAGE 凝胶上运行小等份的上清液和重悬沉淀可用于跟踪每个聚合循环中肌动蛋白的最终纯度和/或损失。重复步骤 D17 时添加的 G 缓冲液的量将取决于产量和所需的最终浓度（例如，将 500 μg 肌动蛋白悬浮在 500 μL G 缓冲液中会产生 24 μM 肌动蛋白溶液）。
22. 通过以下两种方式之一存储肌动蛋白单体：
  1. 对于长期储存，将 G-肌动蛋白分成小份 (20–50 μL)，在液氮中快速冷冻，并储存在 -80 °C。
  2. 对于短期储存（1-2 周），添加 20× F-缓冲液（即每 95 μL G-肌动蛋白添加 5 μL 20× F-缓冲液）并将聚合的 F-肌动蛋白储存在 4 °C。
23. 准备使用时：
  1. 解冻等分试样并通过在 4°C 下以 213,000× g离心30 分钟澄清单体，以去除聚集物。
  2. 在 20°C 下以 213,000× g旋转 F-肌动蛋白30 分钟，将肌动蛋白沉淀重新悬浮在新鲜的 G 缓冲液中，并在冰上孵育以解聚（参见步骤 D17）。

协议验证

该协议已在以下研究文章中使用和验证：

哈勒等人。（2023）。从芽殖酵母中纯化人 β- 和 γ-肌动蛋白。细胞科学杂志136：jcs260540。土井：10.1242/jcs.260540。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

BHY848 呼吸功能不全（娇小）。我们建议用 4% 葡萄糖培养两种菌株（BHY848 和 BHY845）。
平行制备β-和γ-肌动蛋白制剂很方便。我们建议为每种亚型配备专用的 DNase I 色谱柱，以避免交叉污染。
在聚丙烯酰胺凝胶上运行纯化的每个步骤（包括柱清洗和旋转上清液和沉淀），以评估有效性、肌动蛋白损失和相对纯度（见图 2）。
DNase I 亲和柱会随着时间的推移而失效。我们建议使用色谱柱进行 3-5 次纯化。
在没有带压力单元的法式压滤机的情况下，可以使用替代的酵母裂解物制备方法，包括微流化器、球磨机或珠磨机。
纯化肌动蛋白的方法有很多种。我们认为替代方法没有理由不适合从澄清的酵母裂解物中纯化 β- 或 γ-肌动蛋白。
在生物反应器或一般规模> 1 L 的培养物中培养酵母允许额外的聚合/解聚循环和凝胶过滤方法。

故障排除

问题 1：由于细胞裂解（步骤 D2）导致蛋白质产量低。

可能原因：细胞裂解不完全。

解决方案：通过法式压榨机（或类似的破碎程序）后，在显微镜下观察细胞；如果许多细胞未破碎，则再进行一到两次破碎程序。

问题2：DNase I结合能力低。

可能的原因：DNase I 与新树脂的低效偶联或重复使用的色谱柱饱和/损坏。

解决方法：更换色谱柱。

问题 3：甲酰胺相关的肌动蛋白变性。

可能原因：Formide与actin的比例过高。

解决方案：通过稀释限制甲酰胺的暴露（为步骤 D9 中的溶液留出空间）。尽可能将样品放在冰上。

问题 4：肌动蛋白的最终浓度太低（步骤 D19 以后）。

可能的原因：骑行期间肌动蛋白丢失。

解决方案：确保 F-肌动蛋白颗粒有足够的时间和搅拌来转化为 G-肌动蛋白。为了最大限度地回收低产肌动蛋白，请在转化为 F-肌动蛋白之前，将 F-肌动蛋白沉淀重新悬浮在 G 缓冲液中至至少 1 μg/μL。

致谢

图形概述的组件是通过 BioRender.com 创建并导出的，该网站是纽约州立大学北部分校购买的付费订阅。这项工作得到了 JLH-R R35GM133485 的支持，并得到了纽约州立大学上州医科大学和纽约州立大学研究基金会对 DCA 的支持。我们感谢托马斯·J·布莱克的尖刻智慧、精力和桃子。该协议改编自我们之前发表的研究（Haarer 等人，2023）。

利益争夺

本协议中描述的菌株及其用于纯化人细胞质肌动蛋白亚型的用途是作者和纽约州立大学研究基金会临时专利申请的主题（申请号：63/399,088）。

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