材料和试剂

1. 白色平底96孔板（Corning，目录号：3990）

2. 15 mL离心管，PP，螺帽（品牌，目录号：114818）

3. 1.5 mL微量离心管（Eppendorf Safe-Lock，目录号：EP0030123611）

4. Filtermax 过滤器顶部（TPP，目录号：99505）

5. 预无菌 50 mL 一次性储液罐（Biotix，目录号：SR-0050-1SC）

6. Listeria innocua ŽM39 用 pMSP::Nluc 转化（Jožef Stefan Institute 收藏）（图 1）

图 1. pMSP::Nluc 质粒方案。 PnisA：乳链菌肽启动子。

ErmR：红霉素抗性标志物。 RepD-G：复制基因。 NisRK：乳链菌肽反应基因。 ColE1：大肠杆菌复制基因。 Nluc：纳米卢克。

7. 胰蛋白酶大豆肉汤（Merck，目录号：1.05459.0500）

8. 琼脂（Formedium，目录号：AGA03）

9. 红霉素（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：E5380）

10. Nisin（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：72535）

11. Nano-Glo 萤光素酶测定系统（Promega，目录号：N1120）

12. 氯化钠

13. 氯化钾

14. Na ₂HPO ₄· 2H ₂O

15. KH ₂PO ₄

16. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（参见食谱）

17. TSA （见食谱）

设备

1. 培养箱（粘合剂）

2. 摇床/培养箱 (Braun Certomat H )

3. 发光读板机（ Tecan，型号：Infinite M-1000 ）

4. 移液器组（ Eppendorf，目录号：Z683892 ）

5. 多道移液器（ Eppendorf，目录号：2231300048；型号：Research Plus ）

6. 生物安全柜（Labcaire）

7. 冷冻柜（三洋，型号：MDF-U53V ）

8. 分光光度计（Perkin Elmer，目录号： L7110187；型号：Lambda Bio+）

9. 离心机（Hettich，目录号： 1706；型号：Rotina 380R）

程序

A. 无害乳杆菌的甘油储备

1. 从深冰箱中取出用 pMSP::Nluc 转化的无害李斯特菌ŽM39永久培养小瓶，并将其置于冰上。

2. 将培养物无菌转移到含有 10 μg/mL 红霉素和无菌环的 TSA 板上。

3. 在 37°C 下孵育 24 小时。

B. 用于生物膜接种物或校准曲线培养物制备的过夜培养物

1. 在 15 mL 管中制备 5 mL 的 TSB 培养基，其中含有 10 μg/mL 红霉素。

2. 从 TSA 琼脂板上转移相当于三个中等大小菌落的生物量，并将其接种到上面制备的培养基中。

3. 在 37°C 下摇动 (190 RPM) 孵育 18-24 小时。

C. 在微量滴定板中设置生物膜

1. ×离心过夜培养 g和 4°C 10 分钟。

2. 用 10 μg/mL 红霉素和 5 μL 乳链菌肽将颗粒重新悬浮在 5 mL 的 TSB 培养基中，用于 Nluc 诱导（库存溶液浓度：1 mg/mL）。

3. 稀释悬浮液，直到其 OD ₆₀₀值对应于 1 × 10 ⁷CFU/mL（见注 1）。

4. 根据需要稀释来自步骤 C3 的细菌悬浮液 [例如，在 TSB 中用 10 μg/mL 红霉素和 5 μL 乳链菌肽（原液浓度：1 mg/mL）稀释 100 倍，以获得对应于 1 × 10 ⁵CFU/mL的稀释度]。

5. 将每孔 50 μL 的细菌悬浮液移液到微量滴定板上，一式三份。

6. 在 30°C（见注 2）下孵育选定的时间段（例如，4 小时、8 小时、24 小时、48 小时或 72 小时）。

7. 使用 80 μL 的 PBS 清洗生物膜三次。最后一次洗涤后，在每口井中加入 50 μL 的 PBS。继续进行生物发光测量。

D. 校准曲线的制备（见注3）

1. 在测量 (8 小时) 之前, 在 15 mL 管中制备 5 mL 的 TSB 培养基, 其中含有 10 μg/mL 红霉素和 5 μL 乳链菌肽 (库存溶液浓度: 1 mg/mL)。

2. 将100 µL 过夜培养物（在 B 部分中制备）转移到培养基中，并在 37°C 下摇动（190 RPM）孵育 8 小时。

3. 在测量之前，将悬浮液的 OD _600校准为对应于 5 × 10 ⁷CFU/mL。这是校准曲线的细菌输出悬浮液。

4. 在 1.5 mL 管中，准备五个连续的五倍稀释液，作为校准曲线。

5. 将 50 μL 的稀释液一式两份地转移到生物膜板上。

E. 生物发光测量

1. 例如，200 μL 底物在 10 mL 缓冲液中）混合，制备适量的底物。使用前，将底物在 37°C 下孵育至与样品温度相等。

2. 使用多通道移液器快速添加每口井 50 μL 的底物。等待 3 分钟，然后使用读板器首次测量生物发光（例如，Infinite M-1000，设置：发光模式；积分时间，1 秒；稳定时间，150 毫秒；图 2）。

3. 每隔 10 分钟再测量生物发光 3 次（见注 4）。

图 2. 用于测量 Nluc 生物发光的酶标仪设置屏幕截图。

F. 计算生物膜中的细菌浓度

1. 使用 Excel 计算细菌浓度的对数和相应的平均生物发光的对数，并用它们绘制校准曲线。具有代表性的校准曲线如图 3 所示。

2. 使用线性回归（Excel 函数：斜率和截距）从测量的生物发光中计算生物膜细胞浓度。

图 3 。无害李斯特菌生物膜测定法的代表性校准曲线。

LogC：细菌浓度的对数。 LogLI：发光强度的对数。

数据分析

生物发光测量以 Excel 格式保存，Excel 可用于分析数据。确定校准曲线的决定系数 (R ²)，仅当 R ²大于 0.95 时才考虑对数据进行分析。所有测量都在两个生物学重复中重复，每个重复在三个技术重复中重复。

笔记

1. _{600和 CFU 数}之间的关系应提前建立，通过电镀不同 OD ₆₀₀（连续稀释）的细菌悬浮液并计算菌落数（CFU）。测得的 OD ₆₀₀值取决于所使用的分光光度计，因此未指定。

2. 李斯特菌在 37°C 下培养以获得最佳细胞生长。然而，由于细胞的运动性更高，建议在 30°C 下培养来研究生物膜形成（Lemon等人，2007）。

在生物膜生长的时间过程实验中，每个时间点（或测量的每个板）都需要一条新的校准曲线，该曲线由从过夜培养物中接种的 8 小时培养物制备。通常选择前 10 分钟后的测量进行计算；但是，应考虑信号强度和再现性，也可以考虑 20 分钟和 30 分钟后的测量。

3. 小心移液对于可重复的结果至关重要。

食谱

1. PBS

PBS 是通过 10 × PBS 的 10 ×稀释和无菌过滤制备的。

10 × PBS：

80 克氯化钠

2克氯化钾

17.8 克 Na ₂HPO ₄· 2H ₂O

2.7 克 KH ₂PO ₄

₂O填充至 1 L。

2. 运输安全管理局

30 克 TSB

15克琼脂

_{2 O}填充至 1 L，并在 121°C 高压灭菌 15 分钟。在无菌条件下将琼脂倒入培养皿中，让琼脂凝固。

致谢

这项研究由斯洛文尼亚研究机构资助（授权号 P4-0127、J4-9327、J4-1771）。该协议源自Berlec等人。（2021 年）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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