材料和试剂

1. 培养皿，60 mm×15 mm（Corning，组织培养处理，目录号： CLS430166）

2. PVC OD 0.61 mm × ID 0.28 mm（SteriHealth，目录号： I-10317）

3. 聚乙烯管 OD 1.27 mm × ID 0.86 mm（Portex，目录号：800/100/260）

4. 15 mL收集管（Falcon，聚丙烯，目录号： 352096）

5. 1.5 mL 微量离心管（Starlab，目录号： S1615-5510)

6. 5 mL流式细胞术管（Falcon，圆底聚丙烯，目录号： 35200）

7. 96孔黑色板（Thermo Scientific，平底未处理，目录号： 237108）

8. 27 G 针（VWR，目录号：613-3834）

9. 25 G 针（VWR，目录号：613-4952）

10. 19 G 针（VWR，目录号：613-3938）

11. 1 mL皮下注射器（Terumo，目录号：SS-01T1）

12. 4-0弯针缝合线（Medisave，目录号： W586H)

13. 5-0 缝合线（Covidien，Sofsilk，目录号： S-182)

14. 2-0 缝合线（Covidien，Sofsilk，目录号： S-185)

15. 直式止血钳（Fine Science Tools，目录号：1301414）

16. C57/BL6 雄性小鼠（查尔斯河实验室，马盖特，英国）

17. J774A.1 巨噬细胞系（European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC), ECACC-91051511）

18. 脂多糖（LPS）（InvivoGen，Ultrapure Escherichia coli O111：B4，目录号： tlrl-3pelps）

19. 5'-三磷酸腺苷（ATP）（Bio-Techne，二钠盐，目录号： 3245）

20. 肝素钠（Wockhardt，1,000 IU/mL，目录号： FP1086）

21. 人血清白蛋白（HSA）（BioIVT，25％溶液，目录号： GEM-800-120-S）

22. 胎牛血清（FBS）（Sigma，热灭活/无菌过滤，目录号： F9665）

23. RPMI-1640 培养基（Sigma，目录号： R5886）

24. 青霉素-链霉素（Sigma，目录号： P4333-100mL）

25. 流式细胞术抗体（见表 1）

用于灌注液细胞流式细胞仪分析的荧光团偶联抗体。

26. AccuCheck Counting Beads（ThermoFisher Scientific，目录号： PCB100）

27. Vybrant ^{® DiD}细胞标记溶液（ ThermoFisher Scientific ，目录号： V-22887）

28. 稀释剂C（Sigma，目录号： CGLDIL-6X10mL）

29. 具有Ca ²⁺/Mg ^2+的磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma，目录号：D8662-500mL）

30. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）10 × （Fisher Scientific，20升，目录号：BP399-20）

31. ^2+/Mg ²⁺的 Hank 缓冲盐溶液（HBSS）（Sigma，目录号H6648）

32. ²⁺/Mg ²⁺的汉克缓冲盐溶液（HBSS）（Sigma，目录号： 55037C）

33. Triton ^TMX-100（Sigma，目录号：X100-500ML）

34. 乙二胺四乙酸（EDTA）（ThermoFisher Scientific，目录号： 15575020)

35. 叠氮化钠（ Sigma，目录号： S2002）

36. 灌注缓冲液（见配方）

37. 检测缓冲液（参见配方）

38. 流式细胞仪缓冲液（参见食谱）

设备

1. 注射泵（哈佛仪器，型号：11/55-1199）

2. 冷藏微量离心机（Eppendorf，型号：5417R；角转子：FA45-30-11）

3. 冷冻台式离心机（Heraeus，型号：Multifuge 3S-R）

4. 荧光酶标仪（ BioTek，型号： Flx-800 ）

5. 流式细胞仪（ Beckman-Coulter，型号： CyAn ADP ）

6. 血液试管旋转器（Stuart Scientific，型号： SB1）

7. 培养箱（Memmert，型号： IN55）

软件

1. KC4 数据分析软件（BioTek， https ://www.biotek.com/ ）

2. FlowJo ^TM软件版本 10.5.3（俄勒冈州阿什兰， https://www.flowjo.com/ ）

程序

A. 肺血管细胞的收获

1. 使用 27 G 针头和 1 mL 注射器通过尾静脉注射低剂量 LPS（PBS 中 0.2 mL 100 ng/mL 溶液中 20 ng）的 C57/BL6 小鼠。

2. 2 小时后，通过腹腔内戊巴比妥麻醉剂过量牺牲小鼠。检查踏板反射并通过切断股动脉确认死亡。

3. 进行中线开胸以暴露胸腔，将肋骨夹向两侧，并用止血钳将隔膜拉下。

4. 通过 27 G 针头和 1 mL 注射器将 20 个单位的肝素（0.1 mL 的 200 个单位/mL 溶液）注入右心室。

5. 进行气管切开术并用注射器注入 20 mL/kg 的空气以使肺部膨胀。

6. 将 4-0 弯针缝合线穿过心脏的顶点，将其固定到位，同时清晰地显示两个心室，以便随后进行插管（图 2，上面板）。

7. 在肺动脉和主动脉的扭曲下循环 5-0 缝合线并打一个松散的结。

8. 在心尖下循环 2-0 缝合线并打一个松散的结。

9. 用 25 G 针在右心室戳一个洞，将 PVC 管（外径 0.61 毫米×内径 0.28 毫米）插入肺动脉（轻轻拉动末端软化管端，确保管内充满灌注液）（图 2，下面板）。

10. 拧紧空心肺动脉周围的 5-0 缝合线，以确保流入插管。

11. 用 19 G 针在左心室戳孔，将聚乙烯管（外径 1.27 毫米× ID 0.86 毫米）插入左心室，注意不要使心脏破裂。

12. 拧紧心尖周围的 2-0 缝合线，以确保流出插管。

图 2. 显示肺动脉（灌注液流入）和左心室（灌注液流出）插管过程的图表。 使用 BioRender.com 创建。

13. 在注射泵中以 10 mL/h 的速度用灌注缓冲液（参见食谱）开始灌注 1 分钟，以观察血液流入冰上 15 mL 收集管的情况。

14. 将灌注增加到 50 mL/h 12 分钟，以收集 10 mL 体积的肺血管细胞。

15. ×离心细胞 G 在带有摆桶转子的冷藏台式离心机中 10 分钟。

16. 要去除任何残留的血浆，请用 5 mL 的检测缓冲液清洗灌注细胞两次（参见食谱）。

17. 将细胞重新悬浮在检测缓冲液（~1 mL）中并放在冰上。

18. 为了分析细胞回收率，将少量（例如，25 µL）移液到 5 mL 流式细胞仪管中，并添加等体积的荧光团偶联抗体混合物：抗 CD11b 以识别粒细胞和单核细胞；抗 F4/80 识别单核细胞；抗 Gr-1 可识别中性粒细胞和 Ly6C 阳性单核细胞（表 1）。我在冰箱中孵育30 分钟。

19. 用流式细胞仪缓冲液清洗细胞（参见食谱）。

20. 重悬于流式细胞仪缓冲液中，加入 10 μL Accucheck 计数珠，并通过流式细胞仪进行分析。

B. 体外MV 的产生和 DiD 荧光标记

1. 4 × 10 ⁶J774A.1 细胞置于 60 × 15 mm 培养皿中。在 37 °C 、5% CO ₂/空气中孵育过夜。

2. 取出培养基，用 5 mL 的 PBS（含 Ca ²⁺/Mg ²⁺）轻轻冲洗贴壁细胞 3 次。

3. ²⁺/Mg ^{2+ ）}中的 3 mL ATP（3 mM）轻轻移液到细胞上，并在 37 °C 、5% CO ₂/空气下孵育 30 分钟。细胞外 ATP 用于通过激活 P2X7 受体信号通路诱导巨噬细胞快速释放 MV。

4. 将上清液收集到微量离心管中，放在湿冰上冷却，然后在角转子冷冻微量离心机中以 300 ×离心 G 在 4 °C下10 分钟以去除细胞。

5. 使用 0.2 mL 移液器小心收集上清液并转移到新管中。在 4 °C下，在角转子冷藏微量离心机中以 20,800 × g离心30 分钟以沉淀 MV。

6. 小心去除上清液并丢弃。用 1 mL 的检测缓冲液再次清洗，并使用 0.2 mL 的检测缓冲液重新悬浮 MV 颗粒。

7. 在 MV 悬浮液中加入 40 μL 的 30 μM DiD/稀释剂 C 库存溶液（最终 DiD 浓度：5 μM），并在室温下在黑暗中孵育 7 分钟。稀释剂 C 用作细胞膜亲脂性荧光染料标记的稀释剂。

8. 用 1 mL 的检测缓冲液在 20,800 ×下离心洗涤 MV 两次 G 在 4 °C 下30 分钟。

9. 小心去除上清液并在 0.2 mL 的检测缓冲液中重新悬浮 MV 颗粒。

10. 将 5 μL 的 MV 悬浮液转移到 96 孔黑色板中，并用 90 μL 的 PBS 稀释。通过添加 5 μL 的 Triton X-100 (10%) 来裂解 MV。在 Biotek FLx800 读板机中测定 635 nm/680 nm 激发/发射波长的 DiD 荧光。

11. 根据 DiD 荧光单位 (FU)/mL 调整 MV 浓度（参见数据分析）。

C. MV摄取试验

1. 将肺血管细胞分成微量离心管 (1.5 mL )，在 0.5 mL 体积中标准化为 Ly-6C^高单核细胞密度 (1 × 10 ^{5 /mL)。}

2. 将 DiD 标记的 MV 添加到单元格（请参阅数据分析）。

3. 用铝箔盖住管子，放在旋转轮上，在 37 °C下孵育长达 1 小时。

4. 将试管放在湿冰上冷却，然后在角转子冷冻微量离心机中以 300 × G 10 分钟沉淀细胞。

5. 弃去上清液，300 ×洗涤细胞两次 G 用冷 PBS 10 分钟。

6. 中用荧光团结合的抗 F4/80、抗 CD11b、抗 Ly6C 和抗 Ly6G（表 1）孵育细胞30 分钟。

7. 用流式细胞仪缓冲液清洗细胞。

8. 重悬于流式细胞仪缓冲液中并通过流式细胞仪进行分析。

9. 使用 Beckman Coulter CyAn ADP 流式细胞仪的 635 nm 激发激光和 FL8-665/20 nm 发射通道检测细胞相关的 DiD 荧光。

数据分析

A. 通过流式细胞仪分析灌注液细胞

在收集灌注液并在测定缓冲液中重新悬浮细胞后，取出一小部分用于单核细胞亚群和嗜中性粒细胞的定量。使用抗体组：抗 F4/80-FITC、抗 CD11b-PE 和抗 Gr-1-APC（表 1），我们鉴定了中性粒细胞（CD11b ⁺、Gr-1 ⁺、F4/80 ^–）， Ly-6C^高单核细胞（CD11b ⁺、Gr-1 ⁺、F4/80 ⁺）和 Ly-6C^低单核细胞（CD11b ⁺、Gr-1 ^–、F4/80 ⁺）（图 3）。与未处理的小鼠相比，低剂量 LPS 处理的小鼠的肺灌注液中中性粒细胞和 Ly-6C^{高单核细胞的比例明显增加，这与我们之前的发现一致，即在相同的低剂量 LPS 处理后肺部边缘增加（O'Dea}等人，2009）。灌注液中总细胞数的计算表明，在 LPS 处理的小鼠中，Ly-6C^高单核细胞的恢复增加了几倍（n = 5， P < 0.01）（图 4）。平均回收率为 4.8±1.3 × 10 ⁵Ly-6C^高单核细胞，因此可以仅使用单个 LPS 处理的小鼠供体进行多次体外测试。

图 3. 未经处理和经 LPS 处理的小鼠肺灌注液中髓系白细胞的流式细胞仪分析。

从未经处理和低剂量 LPS（20 ng，2 小时）处理的小鼠获得的肺灌注液对 CD11b、F4/80 和 Gr-1（抗 Ly6C和-Ly6G）进行染色。流式细胞术用于根据其表面标志物表达区分每个细胞群：单核细胞被鉴定为 CD11b ⁺和 F4/80 ⁺，其子集为 Gr-1 ⁺(Q2) 或 Gr-1 ^–(Q3)，其中根据它们的 Ly6C 抗原表达来区分它们。中性粒细胞被鉴定为 CD11b ⁺、F4/80 ^-和Gr-1 ⁺种群 (Q1)。计数珠用于计算样品中的细胞数。请注意，嗜酸性粒细胞 (CD11b ⁺) 表达 F4/80，但通过使用 CD11b ⁺/低侧向散射 (SSc) 父门（未显示）与 F4/80 ^{+单核细胞分离。}

图 4. 从未处理和 LPS 预处理小鼠的肺灌注液中回收的髓系白细胞总数。

通过流式细胞术对来自未处理和低剂量 LPS（20 ng，2 小时）处理的小鼠的肺灌注液中的Ly-6C^高单核细胞、Ly-6C^{低单核细胞和中性粒细胞进行量化。}与未处理的对照小鼠相比，低剂量 LPS 处理的小鼠的肺灌注液中存在更多数量的 Ly-6C^{高单核细胞。}平均值 ± SD，n = 2-5，** P < 0.01，双尾非配对t检验。

B. MV 生成和标记

通过 ATP 刺激 P2X7 受体信号通路，从小鼠 J774.1 巨噬细胞系产生 MV。该方法产生早期释放的 MV，其表面标记表达谱与 J774.1 亲代细胞相似，表明它们直接来源于质膜（O'Dea等人，2020，参见图 1B）。通过 MV 的抗 CD11b+ 免疫亲和分离评估 DiD 标记在洗涤的 MV 制剂中的结合（O'Dea等人，2020，图 1C），发现大部分 DiD 荧光与 CD11b ⁺MV 部分相关(>90%) 并且在未结合部分中只有少量 (<3%)。 DiD 标记的 MV 制剂的连续稀释表明，使用荧光读板器方法测量的总 DiD 荧光与流式细胞术测定的 DiD 阳性 MV 计数之间存在线性关系（O'Dea等人，2020，图 1D） .使用这些协议，1,000 个 DiD 荧光单位相当于 ~5 × 10 ⁵MV。请注意，由于 MV 大小的异质性（~0.1-1.0 µm 直径），我们更喜欢通过 DiD 荧光而不是 MV 计数来标准化 MV 浓度。

C. 灌流细胞对 MV 的摄取

在微量离心管中的 0.5 mL 测定培养基中，将 DiD 标记的 MV 添加到标准化为总共 5 × 10 ⁴Ly-6C^{高单核细胞的灌注细胞中。}先前报道了 MV 摄取剂量反应和动力学的数据（O'Dea等人，2020，补充图 S2：C 和 D）。对于最终方案，使用 DiD 标记的 MV 孵育 1 小时，最低浓度为 25,000 FU/mL (~1.25 × 10 ⁷MVs/mL)，或最高浓度为 100,000 FU/mL (~5 × 10 ⁷MV/mL)。使用抗 Ly6C 和抗 Ly6G 抗体，而不是抗 Gr-1 抗体（表 1），比较未处理和 LPS 处理的供体小鼠的肺灌注液中的 MV 摄取，以确定单核细胞亚群和中性粒细胞（图 5 和 O 'Dea等人，2020 年，图 6A）。作为摄取方法评估的一部分，我们对 DiD 标记的 MV 制剂与不溶性 DiD 进行了并排比较，后者是通过与测定缓冲液/稀释剂 C 孵育和在没有 MV 的情况下离心制备的。尽管用等量的 DiD 荧光 (25,000 FU/mL) 孵育灌注液细胞，但与 Ly-6C对 DiD 标记的 MV 的^高单核细胞摄取相比，不溶性 DiD 的摄取量很小 (图 5C) (图 5B，R2)，表明未结合的 DiD 染料对 MV 制剂的轻微污染（<3%，见上文）不太可能对 DID 标记的 MV 摄取的测量产生重大影响。

图 5. 骨髓灌洗液细胞对 MV 摄取的流式细胞仪分析。

在 37°C 下，将灌注液细胞与 DiD 标记的 MV (25,000 FU/mL) 一起孵育 1 小时，同时持续混合。一个。在 CD11b ⁺门控事件 ( R1 ) 中，Ly-6C^高单核细胞定义为 F4/80 ⁺、Ly6C-高 ( R2 )、Ly-6C^低单核细胞定义为 F4/80 ⁺、Ly6C-低 ( R3 ) 和中性粒细胞F4/80 ^-, Ly6C-中 ( R4 ), Ly6G ⁺( R5 )。 B.具有代表性的直方图，显示每个细胞群的细胞相关 DiD 荧光，单独孵育后（灰色填充）或使用 DiD 标记的 MV（红线）。 C.具有代表性的直方图，显示每个群体的细胞相关 DiD 荧光，单独孵育后（灰色填充）或通过孵育和离心制备的 DiD 没有 MV（红线）。请注意，出于比较目的，仅使用了过量的 DiD 制剂（25,000 FU/mL），并且未结合的 DiD 对 DiD 标记的 MV 制剂的污染通常小于总荧光的 3%（O'Dea等人。 , 2020,补充图 S2C)。

这种优化的测定允许对 MV 摄取机制进行详细研究（O'Dea等人，2020，图 6B 和 6C）并使用阻断试剂阐明细胞表面受体依赖性摄取（O'Dea等人，2020，图7）。

食谱

1. 灌注缓冲液

HBSS （不含 Ca ²⁺/Mg ²⁺）

4% 有

2. 检测缓冲液

HBSS（含 Ca ²⁺/Mg ²⁺）0.5% HSA

青霉素 (100 units/mL)-链霉素 (10 µg/mL)

3. 流式细胞仪缓冲液

磷酸盐缓冲盐水（1 × ，由 10 ×原液制备）

2% 胎牛血清

0.1 mM 叠氮化钠

2毫米乙二胺四乙酸

致谢

这项工作得到了英国伦敦切尔西和威斯敏斯特健康慈善机构（拨款号 P67555）和医学研究委员会/英国麻醉杂志（拨款号 P54008）的资助。

该协议是作为已发表文章的一部分开发的：O'Dea KP、Tan YY、Shah S、B VP、K CT、Wilson MR、Soni S、Takata M。级全身炎症。 J 细胞外囊泡。 2020；9(1):1706708。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

所有协议均由英国内政部根据 1986 年英国动物（科学程序）法进行审查和批准。

参考

1. Doherty, DE 和 Worthen, GS (1994)。脂多糖诱导的兔肺单核细胞滞留。细胞硬度和 CD11/CD18 白细胞粘附复合物的作用。胸围105（增补 3 件）：108S。

2. Hamon, P.、Loyher, PL、Baudesson de Chanville, C.、Licata, F.、Combadiere, C. 和 Boissonnas, A. (2017)。 CX3CR1 依赖性内皮边缘调节小鼠炎症后 Ly6C^高单核细胞全身部署。血129（10）：1296-1307。

3. Joop, K.、Berckmans, RJ、Nieuwland, R.、Berkhout, J.、Romijn, FP、Hack, CE 和 Sturk, A. (2001)。来自多器官功能障碍综合征和败血症患者的微粒通过多种机制支持凝血。血栓血红蛋白 85（5）：810-820 。

4. Kuebler, WM 和 Goetz, AE (2002)。保证金池。 Eur Surg Res 34（1-2）：92-100。

5. Nieuwland, R., Berckmans, RJ, McGregor, S., Boing, AN, Romijn, FP, Westendorp, RG, Hack, CE 和 Sturk, A. (2000)。脑膜炎球菌败血症中微粒的细胞来源和促凝血特性。血液95(3)：930-935。

6. O'Dea, KP, Young, AJ, Yamamoto, H., Robotham, JL, Brennan, FM 和 Takata, M. (2005)。肺边缘单核细胞在早期内毒素血症期间调节肺微血管损伤。 Am J Respir Crit Care Med 172（9）：1119-1127。

7. O'Dea, KP, Wilson, MR, Dokpesi, JO, Wakabayashi, K., Tatton, L., van Rooijen, N. 和 Takata, M. (2009)。亚临床内毒素血症期间骨髓 Gr-1^{高单核细胞的动员和边缘化使肺易发生急性损伤}。免疫杂志 182(2)：1155-1166。

8. O'Dea, KP, Porter, JR, Tirlapur, N., Katbeh, U., Singh, S., Handy, JM 和 Takata, M. (2016)。严重烧伤后循环微泡急剧升高，并与临床严重程度相关。公共科学图书馆一号11（12）：e0167801。

9. O'Dea, KP, Tan, YY, Shah, S., B, VP, K, CT, Wilson, MR, Soni, S. 和 Takata, M. (2020)。在低度全身炎症期间，单核细胞介导循环微泡向肺血管系统的归巢。 J 细胞外囊泡9（1）：1706708。

10. Shi, C., Jia, T., Mendez-Ferrer, S., Hohl, TM, Serbina, NV, Lipuma, L., Leiner, I., Li, MO, Frenette, PS 和 Pamer, EG (2011)。骨髓间充质干细胞和祖细胞响应循环 toll 样受体配体诱导单核细胞迁移。豁免34(4)：590-601。

11. van Eeden, SF, Kitagawa, Y., Klut, ME, Lawrence, E. 和 Hogg, JC (1997)。从骨髓释放的多形核白细胞优先隔离在肺微血管中。微循环4（3）：369-380。

12. Willekens, FL, Werre, JM, Kruijt, JK, Roerdinkholder-Stoelwinder, B., Groenen-Dopp, YA, van den Bos, AG, Bosman, GJ 和 van Berkel, TJ (2005)。肝枯否细胞通过清道夫受体迅速从循环中去除红细胞衍生的囊泡。血液105（5）：2141-2145。

13. Wiklander, OP, Nordin, JZ, O'Loughlin, A., Gustafsson, Y., Corso, G., Mager, I., Vader, P., Lee, Y., Sork, H., Seow, Y.,等人。（2015 年）。细胞外囊泡在体内的生物分布由细胞来源、给药途径和靶向决定。 J Extracell 囊泡4：26316。

14. Yanez-Mo，M.，Siljander，PR，Andreu，Z.，Zavec，AB，Borras，FE，Buzas，EI，Buzas，K.，Casal，E.，Cappello，F.，Carvalho，J. ，等. （2015 年）。细胞外囊泡的生物学特性及其生理功能。 J Extracell 囊泡4：27066。

15. Yipp，BG，Kim，JH，Lima，R.，Zbytnuik，LD，Petri，B.，Swanlund，N.，Ho，M.，Szeto，VG，Tak，T.，Koenderman，L.，等。（2017）。肺是即时中性粒细胞介导的血管保护的宿主防御利基。科学免疫学2（10）。