材料和试剂

1. 25 G × 5/8 英寸针（Becton Dickinson，目录号：305122）

2. 1 mL注射器（Becton Dickinson，目录号：309659）

3. 1.7 mL微量离心管（Thomas Scientific，目录号：C2170）

4. Avant 1.7 mL 低结合管（Midland Scientific，目录号：AVSC1510）

5. 小鼠（目的基因的野生型和突变型）

6. 甲醛，16%，无甲醇，超纯（Polysciences Inc.，目录号：18814-10）

7. 甘氨酸（Fisher Scientific，目录号：BP381-500）

8. 磷酸盐缓冲盐水，10×（PBS）（Gibco，目录号：70011044）

9. Dynabeads蛋白A （Invitrogen，目录号：10001D）

10. Ythdc2 抗体，0.2 µg/µL（Bethyl Laboratories，目录号：A303-025A）

11. 牛血清白蛋白（BSA）（Gemini，目录号：700-100P）

12. 三乙醇胺（Sigma，目录号：90279）

13. 庚二酰亚胺二盐酸盐（DMP）（Sigma，目录号：D8388）

14. OmniPur TRIS盐酸盐（Millipore Sigma，目录号：9310-OP）

15. 氯化钾（Fisher Chemical，目录号：P333-500）

16. Triton X-100 （Sigma，目录号：T8787）

17. OmniPur 甘油（Millipore Sigma，目录号：4750-OP）

18. OmniPur十二烷基硫酸钠（SDS）（Millipore Sigma，目录号：7910-OP）

19. 脱氧胆酸钠（Sigma，目录号：D6750）

20. UltraPure 0.5 M EDTA （Thermo Fisher Scientific，目录号：15575020）

21. 氯化钠（Fisher Chemical，目录号：S271-500）

22. DTT （Thermo Fisher Scientific，目录号：P2325）

23. 完整的蛋白酶抑制剂片剂（CPI）（Roche，目录号：05892791001）

24. IGEPAL CA-630（NP-40）（Sigma，目录号：I8896）

25. 磺酰氟（PMSF）（Sigma，目录号：P7626）

26. RNaseOUT重组核糖核酸酶抑制剂（Invitrogen，目录号：10777019）

27. Bradford 试剂（Bio-Rad，目录号：500-0205）

28. 5 ×蛋白质加载缓冲液（Fermentas，目录号：R0891）

29. 10% Mini-PROTEAN TGX预制蛋白凝胶，50 μL （Bio-Rad，目录号：4561034 ）

30. 蛋白酶K （Invitrogen，目录号：AM2546）

31. TRIzoL （Invitrogen，目录号：15596026）

32. 氯仿（Millipore Sigma，目录号：3150）

33. GlycoBlue 共沉淀剂（Invitrogen，目录号：AM9515）

34. 异丙醇（EMD Millipore，目录号：PX1835）

35. RiboMinus 真核生物系统 v2 试剂盒（Ambion，目录号：A15026）

36. TruSeq RNA 样品制备试剂盒（Illumina，目录号：FC-122-1001）

37. UltraPure DNase/RNase-free 水（Thermo Fisher Scientific，目录号：10977015）

38. PBST（见食谱）

39. 0.1% 甲醛（见食谱）

40. DMP 交联溶液（见配方）

41. 珠偶联缓冲液（参见配方）

42. 裂解缓冲液（见配方）

43. 结合/洗涤缓冲液（见配方）

44. 洗脱缓冲液（参见配方）

45. PK 缓冲液（见配方）

设备

1. P200 移液器（Rainin，目录号：17008652）

2. -80°C 冰箱（Thermo Scientific）

3. 镊子（电子显微镜科学，目录号：72705-01）

4. 用于超声处理的 Bioruptor（ Diagenode Bioruptor，型号： UCD-300 ）

5. 6管磁性支架（Ambion，目录号：AM10055）

6. 管旋转器， Labquake Shaker（Lab Industries Inc.，目录号：400-110 ）

7. 离心机（Eppendorf，型号： 5415C）

8. 加热块（VWR 科学产品）

9. 分光光度计（Beckman Coulter，型号： DU 640）

软件

1. 拼接转录本对齐参考 (STAR)（Dobin等人，2013， http://code.google.com/p/rna-star/ ）

2. HTSeq（Anders等人，2015， RRID：SCR_005514 ）

3. DESeq2（爱等人，2015， http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html )

程序

A. 交联小鼠睾丸

1. 解剖小鼠睾丸，取出外鞘，并使用细镊子仔细梳理曲细精管（图 2）。

图 2. 小鼠睾丸小管的解剖。

A. 安乐死小鼠并用 70% 乙醇对腹部进行消毒后，用剪刀和镊子打开腹部并暴露下腹膜腔中的脂肪垫（白色箭头）。 B. 轻轻拉动脂肪垫，直到露出睾丸（白色箭头）。 C. 切除睾丸下方的脂肪。 D. 在显微镜下工作时，切掉睾丸上的脂肪和附睾。 E. 用细镊子抓住睾丸周围的鞘膜。 F. 轻轻地将鞘膜从睾丸小管上拉开。 G. 用细镊子仔细梳理曲细精管。

2. 将分离的生精小管放入 1.7 mL 微量离心管中，在室温下在 PBS 中的 0.1% 甲醛中孵育 10 分钟，同时旋转。

3. 移液器逐滴添加甘氨酸至 125 mM 的最终浓度来停止交联。在室温下孵育 5 分钟，同时旋转。

4. × g旋转 5 分钟，使小管颗粒化。使用移液器取出上清液，用 4 °C PBS 洗涤两次。

5. 重新造粒小管，取出 PBS，并在液氮中快速冷冻。储存在 -80 °C 。

B. 将磁性 Dynabeads 与抗体交联

第 1 天

1. 通过移液重悬 Protein A 磁性 Dynabeads。

2. 转移 100 μL蛋白 A Dynabeads 以分离 1.7 mL 微量离心管。

3. 将管子放在磁铁上，取出上清液，用 1 mL 的 3% BSA 在 PBST 中洗涤珠子两次，在室温下旋转 5 分钟。每次洗涤后，使用磁铁捕获珠子，然后取出并丢弃上清液。

4. 中将珠子重新悬浮在 500 μL的 3% BSA 中。

5. 留出 200 μL用于预清除步骤并储存在 4 °C 。

6. 将剩余的 300 μL 放在磁铁上，取出上清液，并重新悬浮在 200 μL的珠子耦合缓冲液中。

7. 添加 2 μ g YTHDC2 抗体并在 4 °C下孵育过夜，同时旋转。

每次免疫沉淀 1-10 µg之间）测试交联组织的免疫沉淀效率来确定最佳抗体量。

第 2 天

8. 将珠抗体复合物放在磁铁上并丢弃上清液。旋转时在室温下用 1 mL 的 0.2 M 三乙醇胺 pH 8.2洗涤 3次5 分钟。每次洗涤后，使用磁铁捕获珠子，然后取出并丢弃上清液。

9. 将珠抗体复合物重新悬浮在 1 mL 的二甲基吡美酯 (DMP) 交联溶液中，并在室温下孵育 30 分钟，同时旋转。

10. 将管子放在磁铁上以捕获珠子，然后取出并丢弃上清液。

11. 在 1 mL 的 50 mM Tris、pH 7.5 中重新悬浮珠抗体复合物。在室温下孵育 15 分钟，同时旋转。

12. 旋转时在室温下用 1 mL PBST洗涤 3次5 分钟。每次洗涤后，使用磁铁捕获珠子，然后取出并丢弃上清液。

13. μL的 PBST中重新悬浮珠抗体复合物，并在 4 °C 下储存。

C. 组织裂解

1. 从冰箱中取出睾丸小管，并快速将 275 μL 的裂解缓冲液与 100 U/mL RNaseOUT 添加到每个样品中。

注意：我们使用来自两只出生后第 12 天 (P12) 小鼠的睾丸小管进行每次免疫沉淀。

2. 通过先用 1,000 μL 和 200 μL 移液器吸头上下移液，机械地分解睾丸小管，直到明显中断。使用 25 G × 5/8 英寸的针头，直到裂解液可以轻松通过针头（图 3）。

图 3. 睾丸小管的机械破坏。

交联的睾丸小管 (A) 之前和 (B) 在裂解缓冲液中机械破坏之后。

3. °C 下孵育裂解物15 分钟。

4. 在 4 °C水浴中对裂解物进行声波处理（1 个循环，介质上的 30 s 脉冲）。

注意：可能需要在 fRIP 之前测试多个超声处理循环数。本实验中使用的 1 个循环超声步骤足够温和，不会降解 RNA 和蛋白质，同时会轻微碎裂 RNA。应该能够在超声处理后轻松移取裂解液。

5. °C下以 16,000 × g旋转碎片15 分钟。

6. 收集上清液并将其转移到新的 1.7 mL微量离心管中，然后通过添加等体积的 100 U/mL RNaseOUT 结合/洗涤缓冲液进行稀释。

7. 使用布拉德福德法计算蛋白质浓度。

注意：我们通常从每个裂解液（两只 P12 小鼠的睾丸小管）中获得大约 1.5-2 毫克的总蛋白。

8. 每个 IP 使用 1-2 mg 总蛋白。

D. 预澄清裂解物

1. 将先前放在 B 部分中的珠子放在磁铁上进行预清除步骤，并去除上清液。旋转时在 4°C 下用 1 mL 的 3% BSA 在 PBST 中清洗珠子两次 15 分钟。使用磁铁捕获珠子，然后取出并丢弃上清液。

2. 对于每个 IP，将 ±1 mg 总蛋白添加到预清除珠中，并在旋转时在 4 °C下孵育裂解液 1 小时。

3. 使用磁铁捕获 preclear 珠子，然后收集裂解液并将其转移到新的 1.7 mL微量离心管中。将预清除的裂解液保持在4 °C。

4. 留出 1% 的预清除裂解液体积用于蛋白质印迹分析。加入蛋白质加载缓冲液，在 100 °C 下煮沸 5 分钟，然后冷冻。

5. 为 fRIP INPUT留出10% 的预清除裂解液体积。将 fRIP 输入保持在 4 °C 。

E. 珠抗体制备

1. 要去除任何非交联抗体，请将 B 部分的交联珠子-抗体复合物放在磁铁上，弃去上清液，然后通过倒置管子将珠子快速重悬于 1 mL 的 100 mM 甘氨酸 pH 2.5 中。立即将磁珠放回磁铁上，弃去上清液，重复甘氨酸洗涤。

2. 在室温下旋转时用 1 mL PBST洗涤珠抗体复合物 3次5 分钟。每次洗涤后，使用磁铁捕获珠子，然后取出并丢弃上清液。

3. 在旋转时在 4 °C下孵育 30 分钟。

4. 在室温下，在 1 mL 的 PBST 中快速清洗珠抗体复合物三次。每次在 PBST 中重新悬浮后，使用磁铁捕获珠子，然后取出并丢弃上清液。

5. 在 PBST 中重新悬浮珠抗体复合物，并转移到 1.7 mL 低结合管中进行免疫沉淀。

F. 免疫沉淀 (IP)

1. 将 E 部分的珠抗体复合物放在磁铁上，弃去上清液，然后添加 D 部分中预先清除的裂解液。

2. 旋转时在 4 °C 下孵育 4 小时。

3. 使用磁铁捕获带有感兴趣的结合蛋白的珠子，收集上清液，并储存在 -80 °C以通过西方印迹检查 IP 效率（可选）。为下一步保留珠子。

4. 用 1 mL 的结合/洗涤缓冲液清洗珠子四次，每次在 4 °C 下旋转10 分钟。每次洗涤后，使用磁铁捕获珠子，然后取出并丢弃上清液。在最终洗涤之前将悬浮珠转移到新的 1.7 mL 低结合管中。

5. 最后一次洗涤后，将珠子重新悬浮在 1 mL 的结合/洗涤缓冲液中，然后转移到新的 1.7 mL 低结合管中。

6. 保存 10% 的每个珠子悬浮液用于西方印迹，以确认成功的 IP，并使用 90% 的 RNA 分离。

7. 对于蛋白质印迹样本（每个 IP 的 10%）（图 4）：

a. 使用磁铁捕获珠子并去除上清液。将珠子重新悬浮在 100 μL的裂解缓冲液中，然后转移到新的 1.7 mL 低结合管中。

b. 将磁珠放在磁铁上并去除上清液。将 40 μL的新鲜洗脱缓冲液添加到珠子中，并在 70 °C的热块上孵育30 分钟。在洗脱步骤中每 5 分钟对样品进行一次短暂涡旋。

c. 在室温下以 16,000 × g旋转管子 10 秒。

d. 使用磁铁捕获珠子并将 40 μL的上清液转移到新管中。加入 10 μL 的 5 ×蛋白质加载缓冲液，在 100 °C 下煮沸 5 分钟，然后冷冻。

e. 在 Mini-PROTEAN 预制凝胶上运行样品。

图 4. 确认免疫沉淀成功的蛋白质印迹。

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 分离来自野生型 (wt) 的输入和 10% 的免疫沉淀 (IP) 样品，然后转移到聚偏二氟乙烯 (PVDF) 膜上进行蛋白质印迹分析。 IP重复执行。用抗YTHDC2抗体探测印迹。

注意：免疫沉淀后立即进行 RNA 释放步骤。

G. RNA的释放

第 1 天

1. 将 90% 的珠子放在磁铁上的步骤 F6 中用于 RNA 分离，并去除上清液。在 93 μL的 PK 缓冲液中重新悬浮珠子，然后添加 5 μL的 20 mg/mL 蛋白酶 K、1 μL的 40 U/ μL RNaseOUT 和 1.5 μL的 1 M DTT（总体积100 μL ）。

2. 向步骤 D5 中的 fRIP INPUT 样品添加 43 µL PK 缓冲液，然后添加 5 µL 20 mg/mL 蛋白酶 K、1 µL 40 U/ µL RNaseOUT 和 1.5 µL 1 M DTT（总体积100 µL ） .

3. °C 下孵育 1 小时，然后在 55 °C 下再孵育一小时。

4. 加入 1 mL TRIzol，倒置混合，在室温下静置约 5 分钟。

5. 加入 200 μL的氯仿，剧烈摇晃 15 秒。

6. °C下以 16,000 × g离心 20 分钟。

7. 收集水层并加入 1 μL的 GlycoBlue 和 750 μL的异丙醇。

8. °C 下孵育过夜。

第 2 天

9. °C下以 16,000 × g离心 40 分钟。

10. 的 75% 冷乙醇清洗 RNA 颗粒 3次，在两次洗涤之间以约 7,000 × g的速度旋转 15 分钟。

11. × g和风干颗粒下再旋转 5 分钟。

12. 在 10 μL的UltraPure DNase/RNase-free 水中重悬沉淀。

H. 图书馆建设

1. 根据制造商的说明，使用 RiboMinus Eukaryote System v2 Kit 从 INPUT 和 fRIP 样本中去除核糖体 RNA。

2. 按照制造商的说明使用 TruSeq RNA 样品制备试剂盒制备文库，并进行以下修改：不要用 FPF 溶液对 RNA 进行片段化。

I. 高通量测序

使用 Illumina NextSeq 进行 2 × 75 bp 循环运行的序列库。

注意：在整个 fRIP-seq 协议中，所有工作都必须在无 RNase 的环境中进行。只能使用不含 RNase 的溶液。

数据分析

等人的方法部分所述分析数据。（2017）。简而言之，过滤所有样本的读数以获得质量分数，并映射到 rRNA 以去除 rRNA 读数。使用 STAR 将剩余的读取映射到适当的基因组组件。使用包含 piRNA 前体的自定义注释以及编码和长非编码转录本，使用 HTseq 提取映射到每个转录本的读取。使用DESeq2确定通过 IP 富集的转录本多因素分析。包含无效突变样本允许识别非特异性相互作用。

食谱

1. PBST

PBS + 0.1% Tween-20 从 20% 储备溶液中稀释。

在室温下储存。

2. 0.1% 甲醛

5 mL 的 PBS + 31.25 μL 的 16% 甲醛库存溶液。

制作新鲜并立即使用。

3. DMP交联液

5.4 mg 庚二酸二甲酯 (DMP)在1 mL 的 0.2 M 三乙醇胺 pH 8.2 中。

制作新鲜并立即使用。

4. 珠耦合缓冲液

5. 裂解缓冲液

**新鲜添加 100 单位/mL RNaseOUT。

6. 结合/洗涤缓冲液

**新鲜添加 100 单位/mL RNaseOUT。

7. 洗脱缓冲液

8. PK缓冲液

致谢

该协议改编自Hendrickson等人。（2016 年）。我们感谢斯坦福功能基因组学设施的高通量测序。这项工作得到了美国国立卫生研究院 (NIH T32 AR007422) 到 ASB、美国国家癌症研究所、美国国立卫生研究院到 PJB 的校内研究计划、美国国立卫生研究院 (NIH R01 HG004361) 到 HYC 和美国国立卫生研究院的支持。健康（R01 GM122951 和 R35 GM136433）和 MTF 人类生物学 Reed-Hodgson 教授这个改编的协议最初发表在我们之前的手稿中（Bailey等人，2017； Doi：10.7554/eLife.26116 ）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

该实验得到了斯坦福大学动物护理和使用委员会 (IACUC) 协议 (#21656) 的批准。

参考

1. Anders, S.、Pyl, PT 和 Huber, W. (2015)。 HTSeq——一个处理高通量测序数据的 Python 框架。 生物信息学31（2）：166-169。

2. Bailey，AS，Batista，PJ，Gold，RS，Chen，YG，de Rooij，DG，Chang，HY 和 Fuller，MT（2017 年）。保守的 RNA 解旋酶 YTHDC2 调节生殖细胞从增殖到分化的转变。生命6 : e26116

3. Dobin, A.、Davis, CA、Schlesinger, F.、Drenkow, J.、Zaleski, C.、Jha, S.、Batut, P.、Chaisson, M. 和 Gingeras, TR (2013)。 STAR：超快通用 RNA-seq 对齐器。 生物信息学29（1）：15-21。

4. Glisovic, T., Bachorik, JL, Yong, J. 和 Dreyfuss, G. (2008)。 RNA结合蛋白和转录后基因调控。 FEBS Lett 582（14）：1977-1986。

5. Hendrickson, DG , Kelley, DR, Tenen, D., Bernstein, B. 和 Rinn, JL (2016)。染色质相关蛋白的广泛 RNA 结合。 基因组生物学 17：28 。

6. Love, MI, Huber, W. 和 Anders, S. (2014)。使用 DESeq2 对 RNA-seq 数据的倍数变化和分散进行适度估计。 基因组生物学15（12）：550。

7. Majumder, M. 和 Palanisamy, V. (2021)。揭示体内RNA-蛋白质相互作用的方法纲要。 方法协议4(1) ：22 。

8. Ramanathan, M., Porter, DF 和 Khavari, PA (2019)。研究 RNA-蛋白质相互作用的方法。 Nat 方法16（3）：225-234。