材料和试剂

1. 带凸轮的60毫米培养皿（Sarstedt，目录号：82.1194.500）

2. 1.5 mL微量离心管（Axygen，目录号：MCT-150-C）

3. 15 mL锥形离心管（Fisher Scientific，目录号：14-959-53A）

4. 用于校准的微毛细管移液器的吸气管组件（Sigma，目录号：A5177-5EA）

5. 50 µL 玻璃微量移液器（VWR，目录号：53432-783）

6. 1.7 mL塑料移液管（Fisher Scientific，目录号：13-711-41）

7. 200 µL 移液器吸头（带直径，目录号：DIATEC520-6752）

8. 1,250 µL 移液器吸头（带直径，目录号：DIATEC520-6501）

9. 单刃剃须刀片

10. 细尖镊子/镊子

11. 实验室胶带（Fisher Scientific，目录号：15-901-10R）

12. 18 × 18 mm #1.5（0.16-0.19 mm）方形盖玻片（VWR，目录号：CA48366-205-1）

13. 显微镜载玻片（Fisher Scientific，目录号：12-55-15）

14. Whatman 3 MM Chr 吸墨纸（VWR，目录号：21427-411），切成约 3 cm条

15. KIMTECK Kimwipes 11.2 × 21.3 厘米

16. 1孔玻璃凹陷载玻片（VWR，目录号：470235-728）

17. 通过光刻对硅晶片进行微图案化，形成一系列具有规定深度和宽度的平行凸起脊（图 2B-2C；见注 1；以下称为“硅模具”）

18. 蜗杆 [99.95% 铂，0.05% 铱丝，0.01 英寸直径（Tritech，目录号：PT-9901），一端像抹刀一样扁平，并安装在玻璃巴斯德移液器（Fisher Scientific，目录号：13- 678-20A），或蜗杆镐柄（Tritech，目录号：TWPH1）]

19. 蠕虫睫毛夹（见注2）

20. 带有荧光蛋白 (FP) 标记的中心体标记 (如果使用 CentTracker) 的首选基因型线虫菌株, 有或没有额外的 FP 标记蛋白 (图 1C-1D;本协议中使用的菌株列于表 1 ）。

注意：我们发现通过 Mos1 介导的单拷贝插入（MosSCI； Zeiser et al., 2011) ，或 CRISPR-Cas9 与单个导向 RNA (sgRNA) 靶向靠近已建立 Mos1 插入位点的区域(Dickinson et al., 2013) ，并在 mex-5 启动子下表达 FP 标记的蛋白质, 和 tbb-2 3' UTR 调控序列为适合实时成像的种系特异性表达产生最佳结果。

表 1.本协议中使用的线虫菌株。

21. 大肠杆菌菌株 OP50 (Brenner, 1974)

22. 大肠杆菌菌株 HT115 (Timmons and Fire, 1998)

23. 线虫生长培养基(NGM) (Stiernagle, 2006 ; 进行以下修改：每升培养基 20 g 琼脂和 3 g 蛋白胨)

24. 蒸馏水 (dH ₂O)

25. 10 M NaOH（Bioshop，目录号：SHY700.1；溶解在 dH ₂O 中的粉末）

26. 商业漂白剂（Bioshop，目录号：SYP001.4；次氯酸钠，12% 溶液）

27. Vaseline ^®100% 纯凡士林

28. 羊毛脂（Sigma，目录号：L7387-250G）

29. 石蜡（Bernardin Parowax Canning Wax，454g）

30. 四咪唑（Sigma，目录号：L9756-5G）

31. 琼脂糖粉末（Sigma，目录号：A9539-500G）

32. M9 缓冲器（见配方）

33. 漂白溶液（见食谱）

34. Valap（见食谱）

35. 2% w/v Tetramisole 溶液（见配方）

36. 3% w/v 体积琼脂糖粉末溶液（见配方）

设备

1. 带透射光支架的体视显微镜（徕卡，型号：S6 E，尼康，型号：SMZ 745 或同等产品）

注意：我们更喜欢带有外部或 LED 光源的立体显微镜，以避免在安装过程中加热我们的蠕虫。

2. 两个加热块，一个设置为 95 °C ，另一个设置为 65 °C （VWR，型号：标准干块加热器或同等产品）

3. 用于 1.5-2 mL管的带转子的台式微量离心机（Eppendorf，型号： 5415 D 24 管，带转子 F45-24-11，或同等产品）

4. 涡流混合器（Scientific Industries ，型号： Vortex-Genie 2，或同等产品）

5. 培养箱设置为 20°C（三洋，型号： MIR-553，或同等产品）

6. 试管摇杆（Thermo Scientific ，型号： Vari-Mix M48725Q，或同等产品）

7. 用于 10-1,000 µL 体积的单通道移液器（Gilson，型号：Pipetman Classic P20、P200 和 P1000，或同等产品）

8. 微波

9. S针盘共聚焦显微镜（Zeiss，型号：Cell Observer，Quorum，型号：WaveFX-X1，或同等产品），具有适用于 GFP 和/或 mNeonGreen 和 mCherry 荧光蛋白（例如35-50 mW 488 ）的激发波长和发射滤光片nm 或 491 nm，以及 561 nm 或 568 nm 二极管激光器，带 ET525/50 和 FF593/40 单带通，或 466/523/600/677 四带通发射滤光片）和高数值孔径 (NA) 63 ×油镜（例如，Leica，型号：63 × /1.40-0.60 油 HCX PL APO，或 Zeiss，型号：63 × Plan-Apochromat DIC UV VIS-IR）。

根据样品的不同，高 NA 水浸物镜（例如，徕卡，型号：HC PL APO 63 × /1.20 W CORR CS2）可能更可取。

10. 转盘扫描仪（横河电机，型号：CSU-X1）

11. 科学 CMOS 相机（Zeiss，型号：AxioCam 506 Mono，Photometrics，型号：Prime BSI，或同等产品）

软件

1. Conda 4.9.0 或别有用心的版本（Anaconda， https: //anaconda.org/anaconda/conda ）

2. CentTracker Github 仓库： https ://github.com/yifnzhao/CentTracker

3. 斐济 1.52v 或包含 TrackMate 的其他版本（Schindelin等人，2012；Tinevez等人，2017）

4. MATLAB 2020b 或其他版本（MathWorks， https://www.mathworks.com/products/matlab.html ）

程序

A. 为 GSC 实时成像做准备的C. elegans菌株的培养

1. 根据标准方案(Brenner, 1974) ，在接种了大肠杆菌菌株 OP50 的线虫生长培养基 (NGM) 上维持秀丽隐杆线虫动物。

2. 定期转移蠕虫，以确保健康且相对同步的种群。我们使用蠕虫挑选（图 2A）每周（约每 2 代）从保持在 20 °C 的盘子中转移几个小聚集体 ~L1 幼虫（总共约 50 只动物），就像细菌草坪正在枯竭一样。然而，最佳维持方法将取决于动物的基因型和它们生长的温度（Stiernagle，2006）。

3. 表 1 列出了本研究中使用的菌株。要使用 CentTracker 进行分析，动物必须携带适用于荧光显微镜的中心体标记。我们使用带有 GFP 或 mCherry 标记的β-微管蛋白，它标记有丝分裂纺锤体并在中心体富集。如果需要更特异的中心体标记，FP 标记的中心体或中心体周围成分（例如，SAS-4 或 SPD-2； Magescas等人。 , 2019)可能更合适。

B. L1 阶段幼虫的同步

1. 提前三天，通过将 2-3 个最近饥饿的 L1 幼虫的较大聚集体从库存盘转移到新鲜的 NGM/OP50 盘中，使用蠕虫挑选来设置盘子。这应确保在执行同步程序时，盘子里装满了健康、喂养良好和怀孕的成年人。

°C ，三天是合适的时间；如果菌株需要在另一个温度下维持，则相应地调整此时间（Stiernagle，2006） 。

2. mL的无菌 M9 来收集妊娠成人。一旦大多数动物漂浮，使用 P1000 移液器将 M9 和蠕虫转移到 1.5 mL微量离心管中。

3. 在设置为 4,000 ×的台式微量离心机中旋转试管 1 分钟 g，将动物收集成松散的颗粒而不损坏它们。

4. 取出 M9 上清液并丢弃。

5. 添加 1 mL的漂白溶液（参见食谱）。

6. 使用涡流混合器搅拌动物约 6-7 分钟。该反应时间不应超过 10 分钟。每约 1-2 分钟使用立体显微镜检查动物的状况，并在蠕虫开始裂解/破裂后立即停止反应。

7. ×离心 1 分钟克。

8. 从蠕虫尸体和胚胎颗粒中取出漂白溶液，加入 1 mL无菌 M9。

9. ×离心 1 分钟克。

10. 取下 M9 并再重复此清洗程序两次。

11. 最后一次旋转后，将 750 μL 的无菌 M9 添加到蠕虫颗粒中。

12. 在 15 °C 下孵育管子约 24 小时，以允许 L1 孵化。在没有食物的情况下孵化的 L1s 将保持发育滞育，从而产生同步种群，可在 15 °C下保持 5-7 天。

13. 在使用当天，通过计算 M9 的 10 μL 中存在的颠簸动物的数量和在倒置管数次后饥饿的 L1 溶液中的数量，确定每个管中存活和被捕 L1s 的近似浓度（L1s/μL），以确保均匀分布。

14. 使用 P20 或 P200 移液器将 M9 中的 10-15 个同步 L1 转移到接种 HT115 的 35 mm NGM 板上，使用步骤B13中每 µL 的 L1 数量来选择合适的体积。为了成像晚期 L4 幼虫，在 20 °C下孵育板40-48 小时。

注意：我们发现在 HT115 而不是 OP50 上电镀可确保在成像时更同步的种群和更一致的有丝分裂 GSC 数量。

C. 凹槽琼脂糖垫的制备

1. 提前准备约 1 mL的 3% 琼脂糖凝胶，将 3 g 琼脂糖粉溶解到 100 mL的 dH ₂O 中，在高处微波直至完全融化，然后分配到 1.5 mL微量离心管中。在室温下储存的琼脂糖等分试样可以使用长达 1 个月。

2. 将加热块预热至 95 °C 。当加热块达到设定温度时，加入一管 3% 琼脂糖。 7-9 分钟后，定期检查琼脂糖（每 ~ 1-2 分钟），看它是否已经融化。

注意：过热琼脂糖，无论是将管暴露在 >95 °C 的温度下，还是将它们在 95 °C 下放置超过 10-15 分钟，都会产生质量差的垫。

3. 根据需要使用水或 70% 乙醇、压缩空气和/或 Kimwipe 清洁载玻片和硅模具，以去除多余的液体和灰尘或碎屑。

4. 将两个盖玻片粘贴到清洁的载玻片上，使它们之间的距离短于硅模具的宽度（图 2B）。

5. 使用干净的塑料移液管，将一滴融化的琼脂糖添加到两个带胶带的盖玻片之间的载玻片上，避免气泡。

6. 快速将硅模具降低到液滴上，使其在两个胶带盖玻片之间保持平衡。轻轻按下硅模具的两个边缘，它们与盖玻片重叠（图 2C）。让琼脂糖凝固约 1 分钟。

注意：快速执行此步骤可确保图案良好的凹槽。不要在没有盖玻片支撑的硅模具上向下推。硅模具与琼脂糖表面接触后的任何横向移动都会导致凹槽破裂、歪斜且通常质量差。

7. 一旦琼脂糖凝固，轻轻地将硅模具从琼脂糖垫上提起，并使用立体显微镜检查凹槽是否笔直且轮廓清晰。

8. 使用剃刀刀片，将模制的琼脂糖切成至少 0.5 x 1 厘米的切片。立即用 dH _{2 O}覆盖以防止干燥（图 2C）。

9. 成型的琼脂糖垫可在 4 °C的 dH ₂O 中储存长达 1 周。

图 2. 所需材料和安装方法概述。

A. 由玻璃巴斯德吸管和铂丝制成的蠕虫镐。 B. 琼脂糖图案化材料： 1. 3% 琼脂糖溶液； 2. 硅模具通过光刻微纹脊； 3. 带切割吸头的塑料移液管； 4. 显微镜载玻片表面贴有两片盖玻片作为垫片； 5.装有dH ₂O的培养皿，用于储存成型的琼脂糖垫。 C. 制备带有凹槽图案的琼脂糖垫的方法。硅模具的图像，在两个盖玻片之间平衡并压在熔融的琼脂糖上，显示在顶部（左）和底部（中）视图中。然后用单刃剃须刀片将带图案的琼脂糖垫切成薄片，然后将切片转移到装满水的培养皿中（右）。 D. 安装蜗杆的材料： 1 。嘴部移液器与微毛细管移液器组装在一起； 2. M9缓冲器； 3. M9中0.04%四咪唑； 4. 75% EtOH（用于清洁吸管上的微毛细管）； 5.吸墨纸和Kimwipes切成~3厘米的条； 6.蠕虫睫毛夹； 7. 装有琼脂糖垫切片的水的培养皿； 8. 1孔玻璃凹陷载玻片； 9. 镊子； 10.显微镜载玻片和方形盖玻片； 11. 瓦拉普； 12.带切割吸头的塑料移液管，并与 200 µL移液器吸头组装在一起； E. 最终制备的顶视图 - 琼脂糖垫位于盖玻片下方的中心，凹槽朝上（即，朝向盖玻片），盖玻片的角由 Valap 稳定，琼脂糖垫周围的区域位于盖玻片下方盖玻片用 M9 中的 0.0 4% Tetramisole 回填。 F. 通过立体显微镜观察三个安装良好的 L4 幼虫的特写。

D. 安装蠕虫进行实时成像

注意：执行以下步骤时，应尽一切努力避免与动物发生身体接触并快速工作，以便在从喂食盘中取出蠕虫后约 5 分钟内开始成像。这些步骤已针对 L4 后期幼虫进行了优化，但也适用于 L3 幼虫和成年动物。

1. 在 M9 中制作 0.04% 四咪唑的新鲜溶液。

注意：虽然这种安装方法可以在没有麻醉剂的情况下固定蠕虫，但我们发现残留的身体运动，如肌肉抽搐和咽部抽吸，会掩盖亚细胞动力学，低剂量的麻醉剂（0.04% tetramisole）会产生更可靠的结果。

2. 通过在本生灯火焰上加热其中间并在玻璃变软后从两端轻轻拉动来制备玻璃微量移液器。以约 6 厘米的长度折断移液器，轻轻加热折断端以使玻璃光滑。理想的移液器应足够窄，以确保精确的音量控制，但又足够宽，可以以最小的接触转移 L4 晚期动物（即，足够宽，让它们自由地“捶打”）（图 2D #1 和 3A）。

3. °C的加热块上熔化一管 Valap（参见食谱）。

4. 将 100 μl 的 M9 中的 0.04% 四咪唑转移到玻璃凹陷载玻片的孔中。

5. 在立体显微镜下并使用嘴吸管，使用约 5 μl M9 将 2-5 晚 L4 幼虫从板表面轻轻漂浮，并通过嘴吸管将它们转移到凹陷幻灯片上的四咪唑中（图 3A）。

6. 使用嘴吸管，在 tetramisole 溶液表面吹气，以产生约 10 秒的“迷你涡流”。蠕虫抖动应显着减少（图 3B）。

7. 使用剃须刀或镊子，将 3% 的琼脂糖垫放在干净的载玻片上，凹槽成型的一面朝上。

注意：快速执行以下步骤，以防止琼脂糖垫和蠕虫变干。

8. 使用 Whatman 纸或 Kimwipe 和吸管从琼脂糖垫中去除多余的水。

9. 使用嘴吸管轻轻地将蠕虫从凹陷滑道转移到琼脂糖垫，尽可能靠近凹槽并使用尽可能少的液体（图 3C）。

10. 用嘴吸管轻轻吹气以移动蠕虫，直到它们落入所需的凹槽中。如果蠕虫保持漂浮而不是落入凹槽中，则存在过多的液体，因此请使用口吸管去除多余的液体并重复（图 3D）。

11. （可选）如果需要精确放置蠕虫（例如，在单个视野内捕获 2-3 只幼虫），请使用蠕虫睫毛镐轻轻地将蠕虫扫入到位。尽量减少蠕虫和睫毛夹之间的物理接触，因为这会刺激触觉感受器并导致蠕虫移动。

12. 使用 Whatman 纸或 Kimwipe 去除任何多余的液体（图 3E）。

13. 小心地将盖玻片降低到琼脂糖垫上（图 3F）。

注意：过快地放下盖玻片可能会损坏蠕虫。

14. 修剪 200 μl 移液器吸头，使用单刃剃须刀片从末端切割约 1 厘米，并将其放在塑料移液管的末端。使用它在盖玻片的每个角落添加一小滴融化的 Valap（图 2E 和 3G）。

注意：避免添加过多的 Valap，因为这可能会加热盖玻片。添加 Valap 时，避免提起盖玻片。

15. 使用 P200 移液器，在 M9 中用 ~ 100 μl 0.04% 四咪唑慢慢回填盖玻片下的空间（图 3H）。

注意：不要过度填充腔室或填充过快，因为这会导致盖玻片抬起并取代蠕虫。检查立体显微镜下安装的蠕虫，以确保它们在凹槽中并且不会移动（图 2F）。

图 3. 安装过程的示意图。

使用少量 M9 缓冲液和吸管将A. C. elegans蠕虫从喂食板转移到 M9 中填充有 0.04% tetramisole 的凹陷幻灯片。 B. 然后用吸管在液体表面吹气，将液体和蠕虫混合，形成“微型涡流”。 C. 然后将单个蠕虫通过嘴吸管转移到 M9 中的小体积 0.04% 四咪唑中，并将其转移到模制有凹槽的琼脂糖垫上。 D. 将蠕虫移向凹槽，并使用吸管以所需方向将空气吹过液体表面来分散多余的液体。 E. 一旦蠕虫被定位在凹槽中，使用 Whatman 纸或 Kimwipe 去除多余的液体，如果需要，在嘴吸管的帮助下。 F. 然后将盖玻片小心地放在琼脂糖垫的顶部。 G. 通过在每个角落添加一小滴融化的 Valap 将盖玻片固定到位。 H. 然后用M9 中剩余的约 100 μl 的0.04% 四咪唑回填盖玻片下方的区域。

E. 成像

我们实验室用于对 GSC 有丝分裂进行成像的典型成像参数如下：

1. 将安装的 wor ms 放置在倒置旋转圆盘共聚焦显微镜 [Zeiss Cell Observer with Yokogawa CSU-X1，使用高 NA 63 ×油浸物镜（Zeiss 63 × Plan-Apochromat DIC (UV) VIS-IR）]。

2. 将激光强度设置为最大值的 10%（35 mW 488 nm 和 50 mW 561 nm 激光器），并将曝光时间设置为 200 ms。将相机 (Zeiss Axio Cam 506 Mono) 分档设置为 3 × 3，最终像素大小为 0.1802 μm。

3. 将 z堆栈步长设置为 0.5 μm，具有足够的范围以包含远端种系的高度（通常为 20 μm）。

4. 每 30 秒成像一次，最长可达 40 分钟。在饥饿约 40 分钟后，这是我们安装方法不可避免的结果，我们观察到进入有丝分裂的 GSC 数量显着减少，这表明细胞和/或有机体生理学在这一点之后发生了变化（视频 1 和 2 ；Zellag等等，2021）。因此，我们不建议长时间成像。

注意：这些成像参数进行了调整，以尽量减少激光曝光的不利影响，并且特定于我们的显微镜。我们建议用户使用以下标准作为基准优化其成像参数：（1）在 30-40 分钟采集过程中进入有丝分裂的细胞数量相当一致（图 4K）； (2)每个生殖系平均有 13 个有丝分裂条目（图 4I），在 40 分钟内采集； (3) 有丝分裂的平均持续时间（定义见下文）约 5 分钟（图 4J）。

视频 1 。在 90 分钟的图像采集中，L4 晚期幼虫种系中的有丝分裂线虫GSCs 具有中心体和轴标记。

来自晚期 L4 蠕虫的性腺远端（左）的延时电影，在生殖系中表达 mNG::ANI-1（绿色；轴）和 mCH::β-微管蛋白（洋红色；中心体）。每 30 秒采集一次图像，持续 90 分钟，使用 60 倍平面复消色差 DIC (UV) VIS-IR 油浸式安装在倒置 Cell Observer 旋转盘共聚焦显微镜 (Zeiss; Yokogawa) 上的 AxioCam 506 Mono 相机 (Zeiss)物镜 (Zeiss)，由 Zen 软件 (Zeiss) 控制。显示了 38 个 z 截面（0.5 µm 截面）的最大强度投影。使用 Fiji (Schindelin et al ., 2012) 调整图像的亮度和对比度。比例尺 = 10 µm。时间戳以小时：分钟为单位。电影以每秒 10 帧的速度播放。

视频 2。 在 40 分钟的图像采集中，L4 晚期幼虫种系中的有丝分裂线虫GSCs 具有中心体和染色质标记。

来自晚期 L4 蠕虫的性腺远端（左）的延时电影，在生殖系中表达 GFP::β-微管蛋白（绿色；中心体）和 mCH::组蛋白 H2B（洋红色；染色质）。采集设置与视频 1 相同，但采集持续时间为 40 分钟。显示了 38 个 z 截面（0.5 µm 截面）的最大强度投影。使用 Fiji (Schindelin et al ., 2012) 调整图像的亮度和对比度。比例尺 = 10 µm。时间戳以分钟：秒为单位。电影以每秒 10 帧的速度播放。

F. 图像处理

以下步骤在我们的 GitHub 存储库的自述文件中进一步详细说明，如果分组在同一个文件夹中，则可以以批处理模式应用于单个电影或多个电影。

G. 登记

1. 使用 ImageJ 宏自动注册工具在电影期间手动跟踪一个或一系列有丝分裂细胞的主轴中点（图 4A）。

注意：如果跟随全局样本移动的其他标记结构可见，则用户可以跟踪主轴中点以外的对象。

2. 使用 Jupyter notebook批处理模式电影注册模块生成 xy 平移矩阵并相应地校正电影（图 4B）。

图 4B 中的 Kymographs 显示了 xy 配准后样本运动的校正。

H. 中心体追踪

使用 ImageJ 宏自动修复超堆栈来恢复注册电影中的像素缩放和帧速率，裁剪注册生成的边界，并使用 TrackMate （Tinevez等人，2017）执行点检测和轨道创建（图 4C）。作为参考，我们的 TrackMate 参数如下：blob 直径 = 2.5 μm ；链接最大距离 = 2.7 μm；最大帧间隙 = 2。

注意：TrackMate 可以识别和跟踪由除β-微管蛋白之外的荧光蛋白、除 GSC 之外的细胞类型以及除秀丽隐杆线虫之外的生物体中标记的中心体。 TrackMate 参数应由用户根据其样本和成像参数进行优化，以检测尽可能多的真实中心体轨迹。虚假轨道通常在下一步中被移除。

I. 中心体轨道配对

使用 Jupyter 笔记本批处理模式 轨道对分类模块将点轨道配对成可能的中心体轨道对（即，同一细胞内的中心体）（图 4D）。

注意：我们的轨道对分类器是在一个大型数据集上训练的 野生型 C. elegans GSC。希望将中心体与其他细胞类型和/或其他生物体配对的用户可能需要训练自己的模型。可以在我们的 GitHub 存储库中找到有关如何执行此操作的说明。

J. 有丝分裂评分

1. 使用 Matlab 脚本Step1_import_textfile_and_align_cent_tracks导入 xyzt 坐标 f或配对轨道，并生成包含每对对应中点坐标的文件（图 4E）。

2. 使用 ImageJ 宏Step2_CropCells生成以Step1中计算的中点坐标为中心的裁剪最大强度投影（图 4F）。

3. 使用 Matlab 脚本Step3_score_mitosis绘制每个预测的中心体对的点到点距离（以下简称“主轴长度”）。此步骤允许用户排除假阳性对并对有丝分裂事件进行评分[例如，核包膜破裂 (NEBD)，伴随着纺锤体长度的快速减少和后期开始 (AO)，当纺锤体长度开始迅速增加时]，通过单击图。如果图表不清楚，用户可以使用一个选项查看相应的裁剪 tif（图 4G）。

4. 使用 Matlab 脚本Step4_calc_fits 计算有丝分裂的持续时间并提取各种有丝分裂特征，包括纺锤体长度和后期伸长率。其他特征，如主轴角位移或长度波动，可以很容易地从结果数据中计算出来。我们将“有丝分裂”定义为 NEBD 后的一段时间，一旦纺锤体长度达到恒定最小值，直到 AO（图 4G）；这将包括大部分前中期和所有中期。

图 4. 图像处理概述 分析晚期 L4 幼虫的 3D 有丝分裂纺锤体动力学。

A.为了校正 xy 中的样本移动，使用 ImageJ 宏自动化测试工具在原始/原始电影的最大强度投影的持续时间内手动跟踪一个或多个细胞的纺锤体中点。比例尺 = 10 µm。 B. 在Jupyter notebook 批处理模式中运行电影注册模块，从跟踪的主轴中点的坐标创建一个 xy 平移矩阵，并相应地注册原始/原始电影。使用 ImageJ (Mary et al ., 2016)中的 KymographBuilder 插件生成的 kymograph ADDIN EN.CITE Hadrien2016122(Hadrien et al., 2016)12212217Hadrien, MaryRueden, CurtisFerreire, TiagoKymographBuilber: Release 1.2.4NZenodoNZenodo201610.5281/zenodo.56702在 30 分钟内通过单个 GSC 的主轴中点沿约 8 µm 宽的线扫描显示，以说明此校正的有效性，之前 (左）和后（右）xy 注册。比例尺 = 5 µm。 C. ImageJ 宏自动修复超堆栈恢复像素缩放和帧速率，裁剪配准生成的边界，并允许用户使用 TrackMate 对配准图像执行点检测和跟踪创建（Tinevez等人，2017）。轨迹显示为彩色线，包括真正的中心体轨迹和虚假轨迹。 D. TrackMate 轨道然后通过在 Jupyter 笔记本批处理模式中运行轨道对分类器模块进行配对。左侧显示了最佳结果，其中来自两个相邻细胞的四个中心体轨迹在两个分裂过程中已正确配对（绿色和洋红色轨迹）。 E. 成对点的 xyzt 坐标被导入 Matlab 并使用脚本Step1_import_textfile_and_align_cent_tracks计算所有对的中点。 F. 然后 ImageJ 宏Step2_CropCells使用中点坐标为每对生成裁剪的最大强度投影，帧号显示在右上角 G. 然后用户可以排除假阳性对并对有丝分裂事件进行评分，通过单击显示的点到点距离（即主轴长度）随时间变化的图（左），或者在使用 Matlab 脚本Step3_score_mitosis查看 F（右）中生成的裁剪图像后手动输入时间点。 NEBD = 核包膜破裂。 AO =后期开始。 H. Matlab 脚本Step4_calc_fits计算“有丝分裂”的持续时间（我们定义为 G 中的阴影框所示）并提取不同的有丝分裂特征。 I.在从 61 只动物获取图像的前 40 分钟内，每个性腺进入有丝分裂（进行 NEBD）的 GSC 数量 [平均值 ±标准差 (SD) = 13.5082 ± 6.2786 有丝分裂条目]。 J. 来自 74 只动物的 649 个细胞的有丝分裂持续时间（平均值± SD = 5.2512 ± 2.0175 分钟）。 K. 有丝分裂条目占 40 分钟图像采集期间有丝分裂总数的百分比，相对于采集开始（n = 61 和 875 有丝分裂条目）按 5 分钟间隔进行分类。 L. 来自 74 只动物的 649 个细胞在有丝分裂期间的平均纺锤体长度（平均值± SD = 3.0246 ± 0.3678 µm）。 M. 74 只动物的 819 个细胞在后期早期（后期开始后的前 2 分钟）的纺锤体伸长率（平均值± SD = 0.0245 ± 0.0059 µm/秒）。在 IM 中，黑条显示平均值，误差条代表 SD。合并了来自三个菌株（UM679、JDU19 和 ARG16，见表 1）的数据。

数据分析

CentTracker 图像配准模块校正 xy 样本移动。然而，z 中大而突然的样本移动可能导致无法跟踪的帧和点重复，这可能会显着影响自动配对模块。因此，我们排除了表现出严重 z 运动的电影。这不包括正常的 z 漂移，它是渐进的，对点检测和轨迹创建的影响最小。通常，当动物不能很好地位于它们的凹槽中时会发生严重的 z 运动，并且可以通过良好的安装几乎完全避免。

细胞评分步骤 (J) 使用CentTracker时，对于检测假阳性中心体对至关重要。真阳性中心体对的点到点距离图具有一致的模式（图 4G），因此假阳性图应该很容易识别。但是，我们建议查看任何异常图的相应裁剪 tif，尤其是在分析的 GSC 不是野生型和/或预计有纺锤体缺陷的情况下。

图 4 中显示的有丝分裂参数适用于来自晚期 L4 幼虫的 GSC，并按照Zellag等人的描述进行计算。 (2021) ，其中还可以找到提取其他有丝分裂特征的详细信息。每个性腺的有丝分裂总数是使用手动轨迹配对确定的，而不是 CentTracker 中的轨迹配对分类器，后者在野生型动物中的发现率约为 80% （Zellag等人，2021）。

笔记

1. 该协议中使用的硅模具被蚀刻以形成 26 μm高和 50 μm宽的正带，并生成具有相同比例的 V 形凹槽，具有倾斜的壁（图 1B）。可以使用计算机辅助设计 (CAD) 软件创建简单的光掩模设计，并且可以在大多数微细加工设施中实现光掩模生产和光刻。我们随后发现，方形凹槽（图 1B）产生相似甚至可能更好的结果，并且对于光刻步骤来说可能更具挑战性/成本更高。我们已经测试了以下设计，它们都足以安装：

a. μm 深和20 μm 宽的方形凹槽。

b. 对于晚期 L4 蠕虫：方形凹槽，深35 μm ，宽38-43 μm 。

c. 对于 1 天大的成虫：方形凹槽 55 μm深和 60-65 μm宽。

如果没有微细加工设备，使用乙烯基 Long Play (LP) 唱片作为模具（Zhang等人，2008 年；Rivera Gomez 和 Schvarzstein，2018 年）可以产生相当好的结果（Zellag等人，2021 年）。

2. 用人的睫毛或猫的胡须制作蠕虫睫毛。用一对细尖镊子夹住睫毛/晶须，将根端插入 200 μl移液器尖端的末端，该尖端充满熔融的 Valap。一旦 Valap 凝固，睫毛/晶须应该留在原位。或者，可以熔化约 1,000 μl移液器尖端的末端，并在塑料仍具有延展性时插入睫毛/晶须（图 2D）。

食谱

1. M9 缓冲液（1,000 毫升）

3克KH ₂PO ₄

6 克 Na ₂HPO ₄

5克氯化钠

1 mL 1 M MgSO ₄

dH ₂O 使最终体积达到 1,000 mL

混合所有成分直至溶解，并使用 0.2 μm 孔径过滤灭菌。

2. 瓦拉普

凡士林、羊毛脂和石蜡重量比为 1:1:1

将玻璃烧杯中的所有成分混合在设置为低温的热板上。偶尔搅拌直到融化和均匀。在室温下储存为 ±1 mL 等分试样。

3. 漂白溶液 (5 毫升)

1 mL 商业漂白剂（约 10% 有效氯）

250 μL 10M NaOH

3.75毫升dH ₂O

mL锥形管中将漂白剂和 NaOH 添加到水中。足以漂白5 个60 毫米的妊娠成人平板。每次新鲜，最好在使用后 1 小时内。不要储存。

注意：由于漂白剂会随着时间的推移而降解，我们建议使用已知且相当近期（1 年内）购买日期的商用漂白剂瓶。

4. 2% w/v 四咪唑溶液

在 dH ₂O 中制备 2% w/v 溶液，在 4°C 下储存，使用前在 M9 缓冲液中稀释至 0.04%。

5. 3% w/v 体积琼脂糖粉末溶液

₂O中制作 3% w/v 体积溶液。

致谢

我们感谢 IRIC 的 Jean-Claude Labbé (JCL) 博士对这份手稿的建议和批判性阅读。我们也感谢 Drs。 Amy Maddox (UNC Chapel Hill)、Arshad Desai (UC, San Diego)、Benjamin Lacroix (Institut Jacques Monod) 用于共享菌株、IRIC 的生物成像设施和 McGill 的高级生物成像设施 (ABIF) 用于技术援助，以及 Labbé 的成员和 Gerhold 实验室寻求帮助和建议。 RMZ 获得了加拿大自然科学与工程研究委员会 (NSERC) 的 Alexander Graham Bell 加拿大研究生奖学金和 IRIC 博士奖学金。 YZ 得到了 Sheila Ann MacInnis Grant 科学本科生研究奖 (SURA) 的部分支持。这项工作由加拿大卫生研究院 (PJT-153283 至 JCL 和 ARG 以及 PJT-159523 至 ARG) 资助。

该协议是 Zellag 等人的一部分并衍生自Zellag等人。（2021 年）。

利益争夺

不存在利益冲突或竞争利益。

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