设备

为了便于组装，需要一个带有工具的电子工作台，例如焊接装置、低倍显微镜、助手、压接器和柔性光源。基本的手术工具，如剪刀、钝镊子和手术刀（带有平坦的 Teflon ^®表面，用于去除 EMG 线上的绝缘层）也是操作小部件所必需的。万用表和热风枪有助于验证电气接触和短路情况。

A. A 部分：皮层内刺激电极阵列（围手术期焊接到 B 部分）

慢性植入物

1. 80/20 铂铱丝（California Fine Wire Company，目录号：100168），75 µm × 1 或同等规格

2. 101 环氧树脂粘合剂（Omegabond，目录号：OB-101-2）（具有 A 部分和 B 部分可混合组分）

3. “铱”透明聚烯烃热缩管，最小膨胀 ID 0.066”（钴聚合物，目录号：X2-070-CLR）和 0.050”（钴聚合物，目录号：U2-055-CLR）

4. Tyco Electronics 系列 90 Amplimite 连接器引脚（Tyco Electronics，目录号：M39029/58-360）

挂载用

1. Tyco Electronics 系列 90 Amplimite 连接器插座（Tyco Electronics，目录号：M39029/57-354）

2. 21 号不锈钢皮下注射管，0.032 英寸外径（AM Systems，目录号：843600）

B. B 部分：头部连接器和 EMG 电极（大鼠头部的端口和肌肉中的电极）

1. 2 × 7 公连接器（Samtec，目录号：TFM-107-01-LD-WT）×1

2. 不锈钢 7 股。0.001” 裸，0.0055” 涂层，可变长度 × 所需的 EMG 电极数量（数量必须是偶数才能计算差异）和 5 cm 参比电极 × 1（AM Systems，目录号：793200）

3. 通用小规格（32 美国线规）单芯电线，约 2 厘米（最多 4 个，或更少的所需皮质电极）

4. 101 环氧树脂粘合剂（Omegabond，目录号：OB-101-2）（具有 A 部分和 B 部分可混合组分）。

C. 连接器电缆（大鼠到换向器）

1. 2 × 7 母连接器和带固定闩锁的电线组件（Samtec，目录号：SFSD-07-30C-G-12.00-SR）×1

2. Silbione 硅胶医用粘合剂 A-4300

3. 金属弹簧屏蔽（InVivo1，目录号：120 X .156）

4. 带开口端的 12 通道分量电缆（InVivo1，目录号：363/2-000）

5. 用于绝缘焊接连接的合适尺寸的热缩管

6. 101 环氧树脂粘合剂（Omegabond，目录号：OB-101-2）（具有 A 部分和 B 部分可混合组分）

D. 刺激和记录硬件（换向器到计算机）：

1. 安装了 MATLAB 的实验室计算机

2. AM Systems 2,100 刺激器 × 2 或同等产品

3. Brownlee Precision 400 型放大器或同等产品

4. Labchart 硬件系统

5. 数模 (DAC) SCB-68A 转换器数字采集系统

6. Invivo1 SL12C 双刷换向器

7. 相关支撑架和 BNC 连接电缆

软件

1. PAS 分析器代码位于：https : //github.com/ethierlab。下载存储库：PAS_interface_stim、PAS、Plotting 和 Data_processing

2. 适用于 Windows 的 MATLAB，版本 2018 或更高版本

3. LabChart 软件版本 7 或更高版本

4. 用于刺激和记录硬件以及 DAQ 系统的最新驱动程序

程序

A. 制作 A 部分：皮质刺激阵列（括号中的注意事项）

1. 从获取必要的组件开始（请参阅设备清单）。

2. 首先，为阵列制作支架：拿起不锈钢管的刚性直片并切割约 5 厘米长（这部分将用于在植入过程中将阵列安装到立体定向框架上）。

3. 使用镊子取出母插座，并使用压接工具将插座较短的一端压接到电线上，确保两个组件都牢固连接。暂时将安装座放在一边（图 4A）。

4. 拿起公针并观察其结构。一端具有较小的外径 (OD)，可装入相应的母插座中。这边暂时不受影响。我们的注意力将集中在另一端（由图 4B 中的星号标出）。请注意，公针的中心部分有一个元件，其外径相对于针的其余部分略大。

5. 切出第一根 0.050" 热缩管，其长度足以覆盖带星号的末端，但不能超出销的边缘。使用热缩枪将热缩管紧贴在带星号的一端，加热均匀以确保良好贴合（此时，公针的中心部分应相对于热缩管外径略微升高）星号结束）（图 4C）。

6. 切出第二根 0.050 英寸的热缩管，其长度足以覆盖带星号的端边缘和凸针的升高中心部分，但同样不能超出它。使用热风枪均匀安装。

7. 通过解开一些 Pt-Ir 线并切割四个 3 厘米的碎片来创建阵列电极。

8. 从每根阵列导线的一端去除约 2 毫米的绝缘层。

9. 剪下两根长约 2 毫米、直径较大的 0.066 英寸热缩管。

10. 将两个未加热的 0.066 英寸热缩件滑到带星号的一端。这应该留下一个小空间来插入阵列线（图 4D）。使用帮助之手，将每条阵列线放置成方形（从顶部向下看，中间有针脚）（图 4E 和 4F）。插入四根阵列导线，使其超出星号末端的尖端 3 mm 以上。

11. 对第三根热缩管稍微加热以减少可用空间，将阵列线重新定位到最终位置，并通过充分均匀加热完成收缩（确保每根阵列线的相对长度相同）。

12. 将环氧树脂粘合剂的 A 部分和 B 部分的一小部分（豌豆大小的部分就足够了）混合在一次性表面上，然后大量涂抹以覆盖热收缩的所有三个部分，并在最终完成时永久固定电极位置 [（注意不要覆盖电极的实际尖端，在那里它们将插入大脑（图 4G）；环氧树脂的另一端不应超出公针中央部分的边缘]。等待24 小时让环氧树脂沉淀，然后对阵列电极进行最终调整，使引线彼此平行。

13. 将阵列电极的星号端切割成所需的最终长度（图 4H）（这取决于大脑和目标结构中电极的预期深度；确保阵列中的所有四个电极都是统一的）。确保在阵列植入大脑后，每个尖端的一点都已去除绝缘层，以促进神经刺激。

14. 用少量焊料涂抹阵列电极的另一端（与进入大脑的一侧相反），以便在手术过程中连接到头部连接器。

15. 将阵列针的公端插入母插座支架，将电极面朝上存放，将支架粘在一小块坚固的泡沫中。操作阵列时要小心，并存放在步行/手交通最少的受保护位置，以防止锋利电极造成意外伤害。完成的阵列如图 4I 所示。

图 4. 皮质刺激阵列组件。

请参阅图形面板注释的协议步骤。

B. 制作 B 部分：头部连接器和 EMG 电极（括号中的注意事项）

1. 首先获取必要的组件（请参阅设备清单）并在必要时清理工作台空间。

2. 选择绝缘不锈钢线的线轴（图 5A），并使用剪刀剪下一根短线（约 5 厘米）作为 EMG 参考电极。

3. 继续切割成对相同长度的线，对应于所需的肌肉 [更多的远端肌肉将需要更长的线以确保舒适并防止植入后的运动紧张，但前肢伸肌的长度通常不超过 10 厘米。还需要考虑老鼠的大小，较大的老鼠需要更长的电线来适应它们更大的框架。如果有疑问，请在此阶段选择比所需更长的一侧 - 稍后可以修剪电线的自由（未焊接）端]。

4. 在 Teflon ^®扁平块上使用手术刀刀片，并在低倍率和充足光照的显微镜下，从每根不锈钢线的每一端轻轻去除约 2 mm 的绝缘层（图 5B 中的虚线箭头），以允许焊接（图 5B)（通过实践，这将可能不会磨损螺纹线）。EMG 参考线应从一端移除约 2 厘米的绝缘层（图 5C）。当插入老鼠的背部时，这将有助于确保计算出更清晰的差异。

5. 使用锯齿剪刀剪下四根短（约 2 厘米）的细规格电线，并使用剥线钳从每根电线的两端去除约 2 毫米的绝缘层。组件现在应该可以组装了（图 5D）。

6. 验证植入物的计划，这将决定焊接每个 EMG 和皮质线的位置。图 2 中提供了一个示例安排，但您可以随意调整该模式以适应您的特定项目。

7. 将 Samtec ^®连接器放在辅助手上，公面朝下（连接器的暴露下腹部朝上），为焊接做准备。使用凹口（图 5D 中的虚线箭头）将自己定位到连接器上的相应引脚。

8. 将每根电线焊接到 Samtec ^®连接器底部的相应引脚上，确保不会出现短路（图 5E、5F）。如有必要，使用万用表测试每个连接和 Samtec ^®引脚。EMG 线对应标有一组、两对或三对沿其长度系在一起的缝合结，每对对应于 Samtec ^®连接器上的两个针脚，以确保在手术过程中可以将它们连接到正确的肌肉。

9. 使用细线或备用缝合线将电线在靠近其底部的地方绑在一起，并在涂抹环氧树脂之前将它们重定向到一个共同的出口方向。电线应沿共同方向弯曲，而不是垂直离开 Samtec ^®连接器，以尽量减少最终植入物的高度（图 5G）。

10. 在称重船或其他一次性表面（每个组件的豌豆大小的一半）中混合等份的环氧树脂前体，并使用小抹刀涂抹在连接器的焊接下侧以永久固定连接（图 5H）[注意：取特别注意不要涂抹太多，以免环氧树脂滴入植入物的另一侧（连接侧）。这将妨碍与电缆中的 Samtec ^®母头连接器的可靠和轻松连接。但是，请确保完全覆盖Samtec ^®连接器焊接侧的裸露引脚]。

11. 将环氧树脂放置 24 小时，然后在实际手术前至少 24 小时（最好是 48 小时）重新涂抹第二层更慷慨的环氧树脂涂层以完成植入物（图 5I）。

12. 轻轻地将每对 EMG 线扭在一起，以促进植入并降低噪音。

13. 手术当天早上，将植入物放入盛有 70% 乙醇的浅碗中进行消毒，并在植入前去除螺纹。我们建议为每次手术制作两个植入物的新版本。

图 5.头部连接器和 EMG 电极组件。

请参阅图形面板注释的协议步骤。

C. 种植手术（括号内的注意事项）

1. 术前护理与麻醉诱导

a. 给老鼠称重并打开一个新的日志文件或笔记本页面，以记录围手术期的详细信息。

b. 准备手术工作区。我们使用设置为 38 的水床加热器 ℃顶部带有无菌一次性衬垫。我们在同一张桌子上还有一台蔡司显微镜，还有一个用于近距离接触老鼠的立体框架。

c. 用选择的药剂深度麻醉大鼠[手术可以在异氟醚或每公斤体重适当剂量的氯胺酮-甲苯噻嗪（KX）麻醉下完成，但建议吸入异氟醚，因为它提供了更可靠的麻醉和镇痛，并且在手术过程中很容易调节）]。使用爪子捏反射来评估麻醉深度。

d. 镇静后，将大鼠放在腹部，选择用于 EMG 植入的前肢直接面向实验者 [为了说明目的，我们将选择正确的爪子。如果右前肢肌肉是兴奋性测量的目标，则进行开颅手术并将阵列插入左前肢尾部区域 (CFA)；如果左前肢是目标，则扭转侧向性]。

e. 涂抹眼胶以确保润滑，在切口部位注射利多卡因/布比卡因溶液进行局部镇痛，卡洛芬作为全身镇痛剂。围手术期用适量的乳酸林格溶液（约 mmol/L Na – 130、K – 4、Ca – 1.4、Cl – 109、乳酸 – 28、mOsmol/L – 272、pH 6.5）给大鼠水合。

2. EMG 电极的插入

a. 剃掉老鼠的头部和前肢区域。

b. 准备一个无菌区。

c. 使用氯己定消毒前肢区域。

d. 戴上一副无菌手套。

e. 使用新的手术刀刀片在近端前肢背侧表面做一个短 (5 毫米) 切口。

f. 使用钝剪刀在切口部位周围的小半径内破坏皮肤，以暴露桡侧腕伸肌 (ECR) 肌肉。

g. 做第二个切口以进入二头肌 (Bi) 肌肉。

h. 在与目标前肢同侧的肩部，在斜方肌 (陷阱) 肌肉上做第三个 0.5 厘米的切口。在头皮上做最后一个 0.5 厘米的切口，就在耳朵的嘴边。

i. 接下来，使用精细的止血钳在前肢到头皮切口之间雕刻一条皮下隧道；取回并轻轻拉回 EMG 线，从头皮切口到前肢出口部位。将一对 EMG 线留在原位，重复该过程以将剩余的两对拉到各自的目的地。

j. 要将 EMG 线植入目标肌肉中，请使用 6-0 聚丙烯缝合线的尾端在暴露的 EMG 线尖端附近打结（图 6A）。

k. 然后，使用持针器，将缝合针插入目标肌腹深处，然后将其从进入点约 2-3 毫米处拉出肌肉，沿垂直于肌纤维的方向（图 6A，缝合运动）如绿色箭头所示）。轻轻地将缝合线穿入，直到 EMG 电极的尖端刺入肌腹，同时握住缝合线的尾端以防止其进入肌肉。

l. 在确保电极尖端保持埋在肌肉内的同时，将缝合线的尾部与穿过肌肉的主线系在一起（图 6B；绿色箭头表示要绑在一起的两个区域），不要太紧，以免对肌肉造成不必要的压力肌肉和阻碍血液流动。最终结果如图 6C 所示。

m. 对第二个 EMG 线重复步骤 C2j-C2l，第二个 EMG 线距第一条线的近端或远端大约 2mm，以进行差分记录。

n. 两根线都牢固植入后，通过单独的聚丙烯缝合线将这对线固定在距其插入点几毫米的肌肉筋膜上。

o. 最后，用生理盐水冲洗手术区域，并用 5-0 尼龙缝合线缝合伤口。

p. 根据需要对其他目标肌肉重复该过程。请注意，聚丙烯或其他编织、柔性和非吸收性缝合材料最适合在内部固定 EMG 线，尼龙单丝缝合最适合关闭表面的皮肤。

q. 然后, 将老鼠放在立体框架中, 配有气体麻醉面罩和显微操作器, 用于将电极立体定向插入皮层, 一旦暴露。

图 6. EMG 电极的插入和固定。

请参阅图形面板注释的协议步骤。

3. 皮层阵列的插入

a. 此时，异氟醚可以穿过固定在立体定向框架中的面罩（仔细监测是否有任何晶须运动或缩爪反射，并根据需要调整麻醉输送）。

b. 通过延长早先为 EMG 线束入口点制作的头皮切口开始颅骨切除术 [切口应仅足够长以舒适地插入 Barraquer 线窥器（牵开器）并带有轻微的张力]。

c. 通过去除覆盖表面的骨膜清除头骨的表面（也可以使用高压灭菌的棉签干燥）。

d. 一旦颅骨表面足够干净和暴露，标记前囟并划定钻孔区域[这个颅骨切除术只需要足够大（大约 2 × 2 毫米）以舒适地将皮质阵列插入所需的位置（放置后部和内侧电极）前囟前约 0.2 mm 和外侧 3.0 mm 到目标 CFA）] – 见 Ting等人。(2020) 了解更多细节，图 7A 是总结这一点的示意图，以及以下四个步骤。

e. 将三颗自攻颅骨螺钉插入对侧靠近颅骨表面侧脊的计划颅骨切除术，并在同侧插入两颗（将最靠近颅骨切除术的钻孔留空，以允许 Dremel ^®^的机动性），为牙科水泥提供机械锚，以支撑皮质植入物和连接器。颅骨螺钉的尺寸使得它们可以固定在骨头内，并使螺钉的顶部在颅骨表面上方约 1 毫米处，作为丙烯酸的锚固件。但是要小心不要拧得太深。

f. 在开始颅骨切除术之前插入颅骨螺钉, 以防止任何碎片掉到硬脑膜上。在旋转工具 (Dremel ^®)上使用 0.7 mm 毛刺，在 CFA 上进行开颅手术。

g. 去除颅骨瓣后，将皮质阵列连接到支架上（确保电极彼此平行并与支架平行，以确保最大精度）。

h. 将最后一个颅骨螺钉插入最靠近开颅手术部位的钻孔中。

i. 使用立体定向装置，小心地将电极下降到皮层中（确保电极尖端干净利落地插入硬脑膜 - 预计在所有电极通过之前会有一些阻力和凹陷）（参见图 7B 总结此步骤和以下五个）。

j. 一旦所有的电极尖端都刺穿了硬脑膜，等待一两分钟，让皮质表面恢复到原来的位置。轻轻地将电极尖端带到皮层表面下方 1.5 毫米处的最终位置。

k. 混合并使用豌豆大小的快速凝固硅胶阵列 (Kwik-Cast ^®) 覆盖植入物周围的硬脑膜表面，使用迷你刮刀填充开颅手术中的间隙。

l. 五分钟内，硅胶会凝固，覆盖任何暴露的硬脑膜。

m. 为了永久固定皮质阵列，请使用牙科水泥。将混合物搅拌至稍微流动的稠度，并使用抹刀将皮质阵列的环氧树脂体连接到最近的锚定颅骨螺钉（注意牙科水泥滴不要落在周围的表面上，尤其是在老鼠的眼睛上、毛皮等）。

n. 几分钟后，牙科水泥会变硬，可以安全地取出电极架，将皮质阵列留在原位。然而，仍有四根电线向上延伸，很快就会连接起来。

4. 焊接到连接器

a. 接下来，使用立体定位支架固定 Samtec ^®连接器（我们使用安装在显微操作器上的定制夹具）。

b. 将 Samtec ^®连接器放置在头骨表面上方约 1 厘米处，纵向定向为 rostro-caudally。

c. 然后，准备焊接设置。

d. 确保焊接连接与先验指定的引脚排列相匹配，并记录皮质阵列中每个电极相对于引脚排列的位置（例如，Samtec ^®引脚 3 连接到嘴内侧电极等）。

e. 使用精细焊料，将从皮质阵列向上延伸的每根导线焊接到 Samtec ^®连接器上的指定导线上，首先在一根导线上放置一块精细的热缩管，以便在焊接后可以用热风枪迅速对新连接进行绝缘已设置（有关这些连接的说明，请参见图 7C）。使用熨斗的时间过长，注意不要烧坏细线。非常精细的焊剂涂层可以促进这种连接；使用小规格焊锡丝。每个连接只需要一小滴。

f. 使用带有窄气流的热风枪对电气连接进行绝缘。不要将热气流对准动物，特别是靠近它的眼睛、鼻子、嘴巴或胡须。对每根皮质线重复；地线应焊接到后颅骨螺钉上。

g. 完成所有正确的电气连接后，将 Samtec ^®连接器降低到靠近颅骨表面的位置（实际上，它非常适合紧邻从皮质阵列向上延伸的 AM Systems ^®公针；有关相对定位，请参见图 7C连接器和电极）。

h. 然后，使用新鲜的牙科水泥将 Samtec ^®连接器永久固定到颅骨上，使用颅骨螺钉作为锚点，同时嵌入所有电线，以免任何电线暴露在外（特别注意不要将湿的牙科水泥滴入 Samtec ^®连接器中），这可能非常难以移除，并且在手术后几乎不可能实现良好的电气连接。一小块保护胶带在这里很有用）。参见图 7C 中的粉红色区域。

i. 通过小心地将牙科水泥涂抹到周围区域并雕刻水泥表面来闭合开放的伤口，以便没有锋利的边缘。

j. 修剪植入物周边的皮肤以去除多余的部分并帮助恢复。

k. 种植体植入完成！

5. 术后护理

a. 用生理盐水和一些纱布清洁四肢闭合切口表面的残留血液；还要清洁头部植入物的周边，确保没有残留的血液或结痂形成。

b. 修剪老鼠身上的指甲，防止刮伤自伤。把老鼠单独关在一个干净的笼子里。

c. 允许大鼠通过机构动物护理最佳实践恢复（给予乳酸林格氏溶液进行水合作用和阿替美唑以抵消氯胺酮-赛拉嗪的影响并加速恢复）。剩余的皮肤缝合线通常可以在手术后 7 到 10 天拆除。

d. 卡洛芬或其他非甾体抗炎药也应在手术后 48 小时内给药，以缓解疼痛和炎症。

e. 在测试慢性植入物之前，允许至少三天（通常最多一周）不受干扰的恢复。每天监测感染迹象并进行相应治疗。如果感染，请咨询您所在机构的兽医工作人员，他们可以建议并执行适当的治疗计划以恢复健康。在种植体手术过程中高度注意保持无菌条件将最大限度地减少感染的风险和发生。

图 7.插入皮质阵列。

请参阅图形面板注释的协议步骤。

D. 制作大鼠和换向器之间的连接器电缆（括号中的注意事项）

1. 首先获取必要的组件（请参阅设备列表），并在必要时清理工作台空间（图 8A）。

2. 将 Invivo1 ^®弹簧护罩切割成所需的长度，我们发现大约 40 厘米效果很好。

3. 剪下适当长度的 Samtec ^®母连接器电线和 InVivo1 裸露电线，使其焊接在一起，它们的总长度略长于 InVivo1 ^®弹簧屏蔽的长度。

4. 创建或重新访问 Samtec ^®公针脚和 InVivo1 ^®针脚之间的所需映射（请参阅它们各自的数据表）。图 2 中提供了示例地图。

5. 小心地将 Samtec ^®母连接器的所有电线送入金属弹簧屏蔽（图 8B）（注意不要在弹簧结构中丢失任何电线）。

6. 从每个电线尖端露出大约 3 毫米以促进焊接。

7. 对于每根电线，在焊接前将足够大的热缩管滑下电线。

8. 使用一个帮手，焊料每根导线到匹配一个计划中的正确的（因为有在的Samtec 14个销^®连接器和在Invivo1 12个销^®，两个销将被留在的Samtec未焊接^®连接器）（图8C ）。

9. 将热缩套滑到新的电气连接上并使用热风枪固定。

10. 对每条可用电线重复步骤 D6 到 D9。

11. 使用电压表验证电缆两个连接端之间的每个电气连接。

12. 混合一些环氧树脂部件 A 和 B，并在 InVivo1 ^®连接器（图 8D）（这有助于电线管理）的最后一厘米处大量涂抹在松散的电线组件上。等待 24 小时让环氧树脂凝固。

13. 宽松应用一些有机硅粘合剂移到该环氧树脂和以及松散导线组件通入的Samtec ^®电缆（图8E）的端部（一般指南是适用，直至线屏蔽的边缘）。等待 24 小时让这种粘合剂凝固 - 一旦发生这种情况，表面不应发粘。

14. 制作重复的第二条电缆；除了老鼠本身的植入物外，这是系统中最容易出现故障的元素，因此谨慎地进行备份以确保科学进步不会受到过度阻碍。成品电缆如图 8F 所示。

图 8. SAMTEC 到 InVivo1 连接器电缆组件。

请参阅图形面板注释的协议步骤。

数据分析

A. 用于 CSE 闭环评估的硬件和软件接口

软件是为皮质运动兴奋性和神经刺激的闭环评估而编写的 ( https://github.com/ethierlab/PAS_interface_stim )。该界面捕获目标肌肉中的 EMG 活动，提取信号的包络，对 EMG 活动的幅度是否在预定窗口内进行分类，如果是，则是从较低的（增加的 EMG）进入该窗口还是更高（降低）的活动水平。这有助于决定仅当 EMG 水平在所需范围内并具有特定活动模式时动态触发皮层刺激，这两者都可以由用户定义（附录中的图 S1 ）。在我们的设置中，使用 Brownlee Precision 400 型差分放大器（增益为 100，使用 60 Hz 陷波滤波器在 10 Hz 和 1.5 kHz 之间进行带通滤波）放大和过滤 EMG 信号。来自目标肌肉的处理过的 EMG 信号被路由到 NI-USB 6212 数字采集 (DAQ) 卡的模拟端口，连接到工作站计算机。MATLAB 界面可在我们的 GitHub 存储库中找到，它以伪实时方式绘制和更新 EMG 信号。该界面允许用户指定应触发刺激的基于 EMG 的标准。EMG 信号的上包络是使用 MATLAB包络()函数计算的。当包络相对于定义的噪声基线在用户指定的范围内上升时调用皮质刺激，并在指定的持续时间内保持在该范围内。当满足指定条件时，DAQ 系统的输出端口会发送晶体管-晶体管逻辑 (TTL) 信号，以激活连接到皮层电极的 AM Systems ^®2100 刺激器。因此，刺激器根据用户定义的 EMG 参数生成序列或单个电流脉冲。

B. 用户界面和代码库

图形用户界面是多功能的，有助于轻松定制刺激协议和参数。附录中提供了实验界面的参考指南。独特的电和光刺激协议可以直接编程到该系统中，并且可以根据 EMG 活动（即EMG 控制的闭环神经刺激）调节刺激。关于为什么这是可取的更多科学细节在配套论文中。

C. 数据分析工作流程

我们还开发了一个独立程序，用于在 CSE 评估期间分析和可视化诱发电位（https://github.com/ethierlab、PAS、Plotting和 Data_Processing Repositories）。实验的数据分析可能遵循定型工作流程，如下所示，但高度模块化，如果需要，分析程序的元素可以独立使用。开发一个对您有效的文件夹结构，以保持一切井井有条。以下说明在撰写时是最新的，但该软件正在不断改进和开发，因此如果有下面未描述的其他功能或有任何错误，请与我们联系，我们将很乐意为您提供帮助。

1. 下载最新的 PAS 分析器代码。

2. 每次探针后，将原始数据保存在单独的 LabChart 文件（.adicht、ADInstruments, Inc.）中。为了有效地隔离与刺激相关的 EMG 信号片段，PAS 分析器需要至少有一个数据通道（通常带有 EMG），并且至少有一个刺激通道指示何时传递电流或光。这可以通过将 BNC 电缆从刺激器连接到 LabChart 硬件单元并选择高采样频率（10 kHz 适用于亚毫秒单电脉冲）来轻松完成。在 LabChart 中进行实验设置期间，请记住以清晰简洁的方式标记通道，以便在分析过程中轻松识别相应的数据。

3. 使用所需的通道和数据设置将这些 LabChart (LC) 文件导出为 MATLAB 格式。保存在不同的文件夹中进行分析。

4. 在 MATLAB 中打开并运行 PAS Analyzer.m 文件。这将打开一个图形用户界面 (GUI)，无需使用命令行或编码即可在其中处理数据。

5. PAS Analyzer 将每个数据集重新组织为人类可读的简化格式（Ethier Lab Format，ELF），并将它们导入 GUI 进行处理。通过单击“导入 LC”并选择从步骤 3 中导出的 MATLAB 文件的文件夹开始此过程。

6. 将弹出另一个窗口。创建并选择一个新文件夹以存储 ELF 格式的转换后的 MAT 文件。

7. 在命令行中查看。对于导出的每个探针文件，该文件中的所有通道都将被列出并编号。以矢量格式输入要分析的所需通道作为因变量，然后输入相应的刺激通道以提取 EMG 片段（在当前的软件迭代中，一次只能选择一个刺激通道，但该过程可以如果需要，可对多个通道重复）。

8. 完成此过程后，每个探针文件将在左侧表格中列为一行。GUI 中的大多数其他按钮将使用选定的数据集或需要选择一系列数据集（例如，用于绘制跨探针的条形图）。

9. 使用右侧的文本框指定对所选探针中的数据进行逐次刺激分析的初始参数。可用选项包括选择一个或多个数据通道、刺激前的时间、刺激后的时间以及应用于放大器的硬件增益设置，然后将相关数据校准到正确的微伏单位。

10. 通用处理管道首先涉及单独绘制每个 MEP 并手动验证响应的质量。被刺激或其他工件污染的 MEP 可以标记为这样（工件按钮），并且可以从进一步分析中排除。标记的 MEP 保存在数据文件中，可以恢复以供将来审计或重新分析之用。对于需要排除非 MEP 数据段的分析，还可以使用选项 (MEP -)。

11. 一旦筛选了特定探针文件中的所有刺激，弹出窗口将询问用户是否希望使用筛选结果更新数据结构。如果用户选择“更新”，则排除的 MEP 将从进一步计算中删除。如果用户选择“取消”，则不会应用对数据结构的任何更改。在 MEP 验证期间过早选择“关闭”将显示相同的对话框，为用户提供退出子程序而不保存任何更改的机会。

12. 验证每个探头后，可以通过选择“绘图轨迹”为每个探头块绘制平均 EMG 轨迹。这绘制了验证后探针块中所有 MEP 的平均响应以及与平均值 ±1 标准偏差 (SD) 中的阴影。这将使用户了解评估过程中的平均兴奋性，并有助于确定包含平均 MEP 响应的相关时间范围，接下来需要将其作为量化整个实验的 MEP 响应的参数。

13. 如果需要，通过选择适当的数据块并重复该过程，对实验中的所有探针进行验证。从软件的角度来看，验证不是对数据进行进一步计算的先决条件，并且在某些情况下（当信噪比很高时，例如在麻醉下进行的实验）不需要验证。然而，在清醒实验中，当刺激可能与来自自由行为的持续肌肉活动同时发生时，可能需要根据科学问题进行更仔细的筛选，以增强研究结论的强度。

14. 通过在“测量时间窗口”下以矢量格式输入对应于毫秒上限和下限的两个正数来指定特定的分析时间范围。指定非零下限很有帮助，例如，当存在明显的刺激伪影时，可以从响应大小分析中排除该部分波形。

15. 现在可以通过选择表中的所有行并单击“测量”来计算每个数据块的平均 MEP 响应。计算出的值将填充每个数据块名称右侧的表列。

16. 使用预定的分析时间窗口对实验的每个块的 MEP 进行了三个计算：1) 平均峰峰值 MEP 幅度，2) 单个 MEP 的平均积分，以及 3) 平均 MEP 的积分波形。定性地说，这三种方法通常提供相对相似的信息，但每种方法都有其局限性。我们发现，当 MEP 是多模态时，峰峰值可以提供较少的代表性度量，呈现多个正峰和负峰。当 MEP 的延迟往往不同时，平均 MEP 的积分是次优的。如果 EMG 信号的平均值由于任何原因（EMG 信号中的 DC 偏移）偏离零，后者和 MEP 积分的平均值都可能提供错误的值。然而，应该从平均峰峰值开始，因为这一度量易于解释，通常代表 MEP 大小，并且是文献标准。

17. 量化 MEP 后，单击“条形图”按钮，使用代表上述三种计算方法中任何一种的条形图总结结果（参见 Ting等人，2020，图 3）。条形标签可以直接在 GUI 表中编辑，并且可以使用后续对话框指定图中条形的顺序。也可以绘制平均值 (SEM) 的标准误差。可以使用内置的 MATLAB 函数进一步处理、优化和保存这些图。

18. 输入有关实验的基本元数据，包括“大鼠名称”、“（实验的）日期”和“实验（实验）条件”。此信息将与其他数据一起保存。

19. 然后可以使用“另存为”按钮以 MATLAB 格式保存经过验证和处理的数据，如果实验者希望重新加载数据以重新生成一个或多个图，则可以通过“加载垫”按钮轻松检索。PAS 分析仪内的所有数据都可以随时使用表格下方的“清除”按钮清除。

20. 从那里，数据可以很容易地导出到统计分析和可视化工具，如 R、SPSS 或 Minitab 以进行发布。

D. 结论

我们在这里展示了一种使用电刺激对清醒大鼠的运动皮层进行测定皮质脊髓兴奋性的方法。在记录这一发展过程中，我们希望发布一个可以改进的平台。这项技术的未来迭代可能会采用光遗传学技术来专门刺激皮质脊髓束神经元，并增加干预和结果的特异性。

笔记

A. 解决常见问题

1. 肌电图数据记录质量差

通过这种设置，最有可能的情况是由于机械应力导致的网络共享电缆出现故障。仔细检查电缆中的每个单独引脚是否在连接在鼠头上的 Samtec ^®连接器和直接连接到换向器的 InVivo1 ^®连接器之间保持足够的电接触。使用结构良好的电缆，这不太可能是一个反复出现的问题。

2. 连接的老鼠从笼子里逃出来

在笼式过滤器盖上钻一个约 1 cm ²的孔，并将连接器电缆穿过孔。

3. 种植体劣化

最初，我们观察到植入失败的两个主要原因包括 EMG 植入部位的水肿和感染以及 EMG 信号的丢失，以及在低刺激强度下激活肌肉的能力。肌电图线和连接器用70%酒精仔细消毒，结合彻底的无菌手术方法，细致的伤口闭合，大大减少了感染的发生。尽量减少对皮肤的破坏以避免产生积液也可能有助于减轻水肿和感染。在肌电图线插入点附近增加了锚固缝合线，以帮助防止线从肌肉中拉出，提高了肌肉记录和刺激的稳定性。尽管预计偶尔会出现电极故障或信号恶化，但遵循这些程序使我们能够在大鼠中制造稳定的植入物，可以持续数月。

B. 下一步

CSE 评估系统的未来迭代应侧重于刺激的特异性和增加刺激条件的约束，同时在不需要刺激时保持高度的物理自由。与正常肌肉激活相比，电刺激以与正常肌肉激活相反的顺序募集肌肉纤维，正如 Hennemann 大小原理（Dehail等人，2008 年）所预测的那样，并且大脑中的电刺激对皮质脊髓神经元是非特异性的，并且会激活所有电流传播触及给定半径内的可兴奋细胞。第一个改进可以使用光遗传学来解决，以针对皮质脊髓系统中的特定神经元群。我们已经成功地将该系统应用于皮质脊髓兴奋性的闭环光遗传学评估。第二个问题可以通过对定型任务的行为训练来解决。我们已经初步成功地在 Mototrak 装置（Hays等人，2013 年）上训练大鼠进行等距拉动任务，尽管时间密集（大约一个月，每天两次，每次30 分钟的训练课程以获得基线性能），但很容易被与我们的平台合并，以便在特定的皮质运动状态下进行 CSE 评估。在操作上，人们可以设想一个多因素系统，其中只有当 EMG 在某个范围内时才提供探针刺激，正如已经实现的那样，但额外的要求是力分布也在预定范围内，对应于特定阶段拉动。我们的平台很容易扩展到新的刺激范式，或大脑多个区域的条件刺激。

致谢

我们感谢 Sergiu Ftomov 在设计皮质阵列和我们实验的阵列制造方面的合作。我们感谢 Martin Deschênes 和 Maxime Demers 与我们分享实验室空间和设备。我们感谢 Floriane Bretheau 和 Janaki Raghavan 对手稿的评论。最后，我们还要感谢 Center de Recherche CERVO 动物设施的团队在相应研究期间对实验中使用的动物的持续护理 ( https://doi.org/10.1523/ENEURO.0396-19.2020）。

资金：WT 得到了魁北克桑特研究基金会 (FRQS) 博士培训奖学金、研究中心神经科学卓越奖和 2019 年神经科学学会实习生专业发展奖的支持。MH-L。获得加拿大研究生奖学金-硕士项目和 FRQS 硕士奖学金项目以及拉瓦尔大学医学院的 Fonds Wilbrod-Bhérer 的支持。CE 得到 FRQS 35012 Junior 1 Salary Grant、加拿大自然科学和工程研究委员会 RGPIN-2017-06120 和 Fonds de recherche du Québec–Nature et technology 2018-PR-207644 运营补助金的支持。

作者贡献：WT 和 CE 设计的研究；DB、WT 和 CE 开发了代码库；WT、MHL 和 CE 进行了研究；WT、DB、MHL 和 CE 撰写了论文；WT 编写了初稿。所有作者均符合 ICMJE 指南。

利益争夺

不存在利益冲突或竞争利益。

伦理

所有动物程序均按照拉瓦尔大学动物护理委员会的规定进行（CPAUL# 2015-131 和 2019-007，有效期为 12/2015 至 01-2022）。

参考

1. Alstermark, B.、Ogawa, J. 和 Isa, T. (2004)。大鼠缺乏单突触皮质运动神经元 EPSP：通过网状脊髓神经元介导的非突触 EPSP 和通过节段中间神经元介导的多突触 EPSP。J Neurophysiol 91(4): 1832-1839。

2. Brown, AR 和 Martinez, M.（2019 年）。从皮质到脊髓：脊髓损伤后的运动回路可塑性。神经再生研究14(12)：2054-2062。

3. Christiansen, L. 和 Perez, MA (2018)。人脊髓损伤后皮质脊髓束的靶向可塑性。神经治疗学15(3): 618-627。

4. Dan, Y. 和 Poo, MM (2004)。神经回路的脉冲时间依赖性可塑性。神经元44(1)：23-30。

5. Dancause, N. 和 Nudo, RJ (2011)。塑造可塑性以增强受伤后的恢复。Prog Brain Res 192：273-295。

6. Dehail, P.、Duclos, C. 和 Barat, M. (2008)。电刺激和肌肉强化。Ann Readapt Med Phys 51(6): 441-451。

7. 德国费尔德曼 (2012)。可塑性的尖峰时间依赖性。神经元75（4）：556-571。

8. Hays, SA, Khodaparast, N., Sloan, AM, Hulsey, DR, Pantoja, M., Ruiz, AD, Kilgard, MP 和 Rennaker, RL, 2nd (2013)。等距拉动任务：一种用于量化大鼠前肢力生成的新型自动化方法。J Neurosci 方法212（2）：329-337。

9. Kleim, JA、Boychuk, JA 和 Adkins, DL (2007)。中风中上肢损伤的大鼠模型。ILAR J 48(4): 374-384 。

10. 柠檬，注册护士（2008 年）。运动控制中的下行通路。Annu Rev Neurosci 31：195-218。

11. McGie, SC、Masani, K. 和 Popovic, MR (2014)。脊髓配对联合刺激未能在人类皮质脊髓束中诱导神经可塑性。J 脊髓医学37（5）：565-574。

12. Mishra, AM、Pal, A.、Gupta, D. 和 Carmel, JB（2017 年）。成对的运动皮层和颈椎硬膜外电刺激定时收敛于脊髓促进运动反应的持久增加。生理学杂志595(22)：6953-6968。

13. 罗斯威尔，JC（2016 年）。无创脑刺激可以改善中风的运动恢复吗？Adv Exp Med Biol 957：313-323。

14. Sale, MV, Ridding, MC 和 Nordstrom, MA (2007)。影响配对联想刺激引起的皮质运动兴奋性变化的幅度和再现性的因素。Exp Brain Res 181(4): 615-626。

15. Serraadj, N., Agger, SF 和 Hollis, ER, 2nd (2017)。脊髓损伤运动康复中的皮质脊髓回路可塑性。Neurosci Lett 652：94-104。

16. Stefan, K.、Kunesch, E.、Cohen, LG、Benecke, R. 和 Classen, J. (2000)。通过配对联想刺激诱导人类运动皮层的可塑性。大脑123 Pt 3：572-584。

17. Suppa, A.、Quartarone, A.、Siebner, H.、Chen, R.、Di Lazzaro, V.、Del Giudice, P.、Paulus, W.、Rothwell, JC、Ziemann, U. 和 Classen, J. (2017)。工作中的联想大脑：来自人类配对联想刺激研究的证据。临床神经生理学128（11）：2140-2164。

18. Tarri, M., Brihmat, N., Gasq, D., Lepage, B., Loubinoux, I., De Boissezon, X., Marque, P. 和 Castel-Lacanal, E. (2018)。配对联想刺激的五天疗程未能改善中风患者的运动功能。Ann Phys Rehabil Med 61(2): 78-84。

19. Taylor, JL 和 Martin, PG (2009)。人类皮质脊髓通路中的峰值时间依赖性变化会改变自愿运动输出。J Neurosci 29（37）：11708-11716。

20. Ting, WK、Huot-Lavoie, M. 和 Ethier, C.（2020 年）。成对联想刺激无法在行为自由的完整大鼠中诱导可塑性。eNeuro 7(2)：ENEURO.0396-19.2020。

21. Urbin, MA, Ozdemir, RA, Tazoe, T. 和 Perez, MA (2017)。人类脊髓损伤后下肢运动神经元的脉冲时间依赖性可塑性。J Neurophysiol 118(4): 2171-2180。

22. Zanos, P. 和 Gould, TD (2018)。氯胺酮作为抗抑郁药的作用机制。摩尔精神病学23（4）：801-811。

23. Zeiler, SR 和 Krakauer, JW (2013)。中风后大脑训练与可塑性之间的相互作用。Curr Opin Neurol 26(6): 609-616。

24. Zhang, XY, Sui, YF, Guo, TC, Wang, SH, Hu, Y. 和 Lu, YS (2018)。配对联想刺激对大鼠运动皮层兴奋性的影响。Curr Med Sci 38（5）：903-909。