材料和试剂

聚苯乙烯飞瓶和塞子（外径：25 毫米，高度：95 毫米。Flystuff，Superbulk ® Pack Vials，目录号：32-113RL）
常规棉球（例如，Amazon.com Inc.、Kendall/Covidien Prepping Cotton Ball、500 Count ID 产品：MD44KDL2600Z.BG 或任何化妆品、香水、药店）或果蝇小瓶塞（BIOLOGICS，目录号：51- 0505)
用于推动苍蝇的画笔（圆形尖头尼龙毛，4 号，任何品牌，例如，Amazon Basics，ID 产品 PBR-01）
纸巾（例如，Amazon.com, Inc.，Scott Essential Multifold Paper Towels ID 产品：01840）
一次性香烟（任何可商购的，例如Philip Morris box 20，ID产品：48）。但是，可以使用可重复使用的电子烟（例如，Epuffer、Snaps rev4 可充电电子烟，产品 ID：299246）。
过滤器（可选，例如，Amazon.com Inc，TarBust 一次性香烟过滤器散装经济包装，每包 300 个，目录号：M1200805）
果蝇Canton S野生型果蝇（布卢明顿果蝇资源中心 #64349）

苍蝇可以保持在室温 (RT)。在我们的标准条件下，股票在 25°C 和 60% 相对湿度的培养箱中保持 12/12 小时的明暗循环。然而，这些孵化条件可以由用户根据他们的实验目的进行修改。

琼脂糖（Sigma，目录号：A9539）
葡萄糖（Sigma，目录号：G8270-1KG）
酵母（Genesee Scientific，目录号：62-108）
Gelidium Agar（Genesee Scientific，目录号：66-105）
玉米面（Genesee Scientific，目录号：62-100）
10% Nipagin（Nipagin-Genesee Scientific，目录号：20-258）
96% 乙醇（Sigma，目录号：793213）
药草大麻（PlantAR Ciencia，注册号：46875）
定制苍蝇食物，易于准备苍蝇库存维护（见食谱）
大麻治疗（见食谱）

设备

果蝇培养箱（Sheldon Manufacturing，Shel Lab，目录号：SRI20PF）
立体显微镜（Carl Zeiss，型号：Stemi 508，或任何标准立体镜）
CO 2飞垫（Genesee Scientific，目录号：59-114）
您所在位置提供CO 2罐和调节器（例如，AIRGAS.INC、工业级二氧化碳、150 号高压铝瓶、CGA-320 ID 产品 CD 35A）
蒸发器（Davinci ® ，型号：Iq2）

任何其他型号或品牌都可能有用。我们使用了可用于大麻的蒸发器。大麻和提取物的替代品可能有助于测试其他物质。蒸发器必须满足的一个重要特征是具有温度调节器。这将允许在预设温度下蒸发特定成分。

多路旋塞阀组

套件包括多个歧管、阀门和配件（例如，PRIMER BIOSCIENCE，Luer 阀门分类套件，目录号：14011）。否则，一个歧管就足够了（例如，Scientific Commodities. Inc，目录号：8596）。该装置应包括至少 4 个端口和两个阀门（见图 1）

用于歧管端口的 Luer 锁（PRIMER BIOSCIENCE，Luer 阀分类套件，目录号：14011；或者它们可以单独购买，例如，COLER PARMER ，Masterflex ® Adapter Fittings Luer to Plug，目录号：EW-30800-30）
半透明硅胶管（Scientific Commodities. Inc，目录号：BB518-250：6.35 mm × 9.53 mm，分别为 ID 和 OD ）
半透明 PVC 管（Scientific Commodities. Inc，目录号：BB31775-V/18：6.40 mm × 9.51 mm，分别为 ID 和 OD ）
注射器（20 ml）（LABBOX LABWARE，目录号：SYRL-020-080，或类似供应商）
吸气器（PRIORI， ID 产品：PP1532）
集装箱箱（任何标准的小纸箱）
100 µl 自动移液器的提示。它们足以确保适当的蒸汽和烟雾通量，避免苍蝇穿过棉球或塞子逃逸（Sigma-Aldrich，Greiner 移液器吸头，目录号：Z617369-15000EA 或其他供应商）。

第 6 至 13 项如图 1 所示。

图 1. 组装协议中使用的设备所需的组件。

程序

输送汽化物质

装置的组装和设置（图 2）

通过将蒸发器的接口连接到歧管 (图 2-II) 的末端, 将蒸发器 (图 2-I) 连接到设备上。可使用一根短硅胶管（图 2-III）将咬嘴适配到歧管的一端。
将注射器（图 2-IV）连接到相邻的旋塞阀。
将 PVC 管（图 2-V）的一端连接到第三个旋塞阀。另一端必须保持空闲。
将 100 µl 吸头（图 2-VI）连接到 PVC 管的自由端。
如果歧管包含额外的阀门（即三通或四通旋塞歧管），它们必须用合适的 Luer 锁保持关闭（图 2-VII）。

图 2. 汽化器适配装置的组装方案。

大麻汽化程序（图 3 和视频 1）

将食物瓶中的苍蝇转移到空瓶中（图 3-VIII），并用塞子盖住（在所有实验中使用相同的空瓶或另一个类似大小的瓶）。
研磨植物标本并将其转移到蒸发室中。
将汽化器的咬嘴 (图 3-I) 连接到歧管 (图 3-II)。
将连接到设备的管子的自由端插入装有苍蝇的小瓶的塞子中，苍蝇将暴露在蒸气中（图 3-VIII）。
加热蒸发器。干大麻蒸发器需要一点时间加热才能开始使用。这可能需要 10-15 秒到一分钟以上，具体取决于设备的大小和功能。
确保注射器的柱塞（图 3- IX）被压到针筒底部。
旋转连接汽化器和注射器的旋塞阀（图 3-X），让蒸汽从汽化器流入注射器。
将柱塞拉回至所需标记（即所需空气量）。蒸汽将流入注射器，直到所需的标记充满蒸汽（图 3-步骤 1）。
将连接汽化器和注射器的旋塞旋转到关闭位置，以防止更多的蒸汽转移到歧管中。
打开将歧管连接到装有苍蝇的小瓶的阀门（图 3- XI）。
推动注射器的柱塞。
一旦蒸汽到达装有苍蝇的小瓶，关闭将歧管连接到苍蝇小瓶的阀门（图 3-步骤 2）。
等待预定的时间，以确保汽化物质穿过角质层和苍蝇的气管系统进行气体交换。
根据协议根据需要重复多次。

图 3. 使用适用于蒸发器的设备管理蒸汽的步骤。

视频 1. 向黑腹果蝇输送大麻和香烟烟雾。

香烟烟雾的管理

装置的组装和设置（图 4）

通过将一根香烟（图 4-XII）或过滤器（图 4-XIII）（如果有必要）连接到位于歧管一端的旋塞，将其连接到设备上（图 4-II）。可使用短硅胶管（图 4-III）将香烟或过滤器正确连接到歧管末端。
将包含在盒子（图 4-XV）中的吸气器（图 4-XIV）连接到相邻的旋塞。这是保持香烟燃烧所必需的。
将注射器（图 4-IV）连接到下一个旋塞阀。
将 PVC 管（图 4-V）的一端连接到最后一个旋塞，让另一端自由。
将 100 µl 吸头（图 4-VI）连接到 PVC 管的自由端。
如果歧管包含额外的阀门（即，三通或四通旋塞阀歧管），它们必须用合适的鲁尔锁保持关闭。

图 4. 香烟适应装置的组装方案。

烟雾管理程序（图 5 和视频 1）

将食物瓶中的苍蝇转移到空瓶中（图 5-VIII），并用塞子盖住（在所有实验中使用相同的空瓶或另一个类似大小的瓶）。
将连接到设备的管子的自由端插入装有将暴露在烟雾中的苍蝇的小瓶 (图 5-VIII) 的塞子中。
点燃香烟（图 5- XII）并按下吸气器（图 5- XIV）以保持香烟燃烧（图 5-步骤 1）。
确保注射器的柱塞（图 5- IX）被压到针筒底部。
旋转将香烟连接到注射器的旋塞阀（图 5-X），让烟雾从香烟流入注射器。
将柱塞拉回至所需标记（即所需空气量）。烟雾将流入注射器，直到所需的标记充满烟雾（图 5-步骤 2）。
将连接香烟和注射器的旋塞旋转到关闭位置，以防止更多的烟雾转移到歧管中。
打开将歧管连接到装有苍蝇的小瓶的阀门（图 5- XI）。
推动注射器的柱塞（图 5-步骤 3）。
一旦烟雾到达装有苍蝇的小瓶，关闭将歧管连接到苍蝇小瓶的阀门。
等待预定的时间，以确保所管理的烟雾在苍蝇的角质层和气管系统中进行气体交换。
根据协议根据需要重复多次。

图 5. 使用适合卷烟的设备管理烟雾的步骤。

数据分析

此处描述的协议可用于各种分析，以测试通过吸入途径给药的物质的影响。在我们之前发表的文章中，我们的研究重点是野生型果蝇成年个体的心脏表现，以及包含特定基因突变的菌株（Gómez等人，2019 年；Santalla等人，2021 年）。

向成年苍蝇提供汽化大麻提取物并没有改变心率等参数（Gómez等人，2019 年），而接触商业香烟（菲利普莫里斯）会增加心率（Santalla等人，2021 年）。

这表明，可以根据各自的实验程序分析通过相同设备管理的不同物质，适当地适应相应的物质来源（干大麻或商业香烟）。

虽然我们的蒸发器仅适用于大麻，但定制设备可用于提取物，例如尼古丁提取物/果汁等。用户应为特定提取物选择合适的蒸发器，如设备部分所述。

独立于研究的重点，该技术可能允许测试苍蝇行为的不同方面，即睡眠、交配、喂养和生存，以及野生型和/或突变株的生理参数、生化和分子机制。设置的简单性可能允许其以较低的成本用于研究和/或教育目的。

笔记

电子烟

如果用户使用电子烟代替一次性香烟，则应根据感兴趣物质的溶解度制备提取物。

不同物质的组合

根据测试物质和每种化合物的汽化温度，苍蝇可以通过调节汽化器的温度在同一实验中接触不同的物质。例如，当使用Cannabis sp. 时，一部分萜烯和大麻素会一起蒸发。纯药物的组合也是可能的。

最终考虑：设备维护和估计组装成本

歧管应根据使用频率定期清洁。我们建议在 10 次分析后使用细瓶刷用水和商业非离子清洁剂清洗，然后用超纯水冲洗。当用户在重复使用后观察到壁的不透明度增加时，应更换硅胶和 PVC 管。果蝇小瓶应定期更换。蒸发器或电子烟应按照制造商的说明进行清洁。一次性香烟应根据使用频率购买。

整个设备的估计成本约为200美元。蒸发器是最昂贵的部件，其次是电子烟。管材通常以 15 米卷的形式出售，但也可以购买更短的长度。

食谱

用于股票的飞行食品（1.5 升）

107.25 克葡萄糖

21.45 克酵母

12.9 克琼脂

121.5 克黄色玉米面

1462.5毫升自来水

37.5 ml 10% w/v Nipagin 乙醇溶液

注意：搅拌并加热除尼帕金以外的所有成分，直到混合物达到 100°C。从热源中取出并加热 20 分钟。加入 10% w/v Nipagin 的乙醇溶液（3.75 g Nipagin 溶于 37.5 ml 乙醇），搅拌并再次加热。倒入飞瓶中，盖上棉花，晾干。将装有食物的小瓶储存在 17°C 的果蝇培养箱中。

大麻治疗

干大麻花序必须用剪刀切成非常小的碎片。研磨机也可用于此过程。必须将所需量的碎大麻（例如0.03 克）放入汽化器内，汽化器的温度设置为 180°C 以允许大麻化合物汽化。

致谢

这项工作得到了 ANPCyT PICT 2014-2549 和 SIB 2019-0606 UNNOBA to PF 的支持。

以前的作品：Gómez等。, 2019; 桑塔拉等人。, 2021.

利益争夺

作者声明没有相互竞争的财务和非财务利益。

参考

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