材料和试剂

1. 组织培养（TC）处理的培养皿 150 mm × 25 mm（Thermo Fisher Scientific，目录号：08-772-24）

2. 聚丙烯 Konical 管，25 × 89 mm（Beckman Coulter，目录号：C14291）

3. 24 孔细胞培养板（Genesee Scientific，目录号：25-107）

4. Steriflip 无菌一次性真空过滤器装置，0.22 µm（Thermo Fisher Scientific，目录号：SCGP00525）

5. Steriflip 无菌一次性真空过滤器装置，0.45 µm（Thermo Fisher Scientific，目录号：SE1M003M00）

6. HEK-293T 细胞（ATCC，目录号：CRL-3216）

7. pFUGW 是 David Baltimore 的礼物（Addgene #14883；Lois等人，2002）（4°C 储存）

8. pCD/NL 是 Jakob Reiser 的礼物（Addgene #17531；Zhang et al ., 2004）（4°C 储存）

9. pLTR-G 是 Jakob Reiser 的礼物（Addgene #17532；Reiser等人，1996）（在 4°C 下储存）

10. pF(UG) hSyn SYT1-A'Q-4xGS-NS34a-FLAG (codopt) (SYT1-SELF: Addgene # 158771; Vevea and Chapman, 2020)（4°C 储存）

11. DMEM，高葡萄糖（Thermo Fisher Scientific，目录号：11-965-118）（4°C 保存）

12. 胎牛血清（Atlanta Biologicals，目录号：S11550H）（储存在-20°C）

13. 青霉素 - 链霉素（Fisher Scientific，目录号：SV30010）（储存在-20°C）

14. NaCl（Thermo Fisher Scientific，目录号：S271-10）（室温储存）

15. KCl（Sigma，目录号：746436-12KG）（室温储存）

16. Na 2 HPO 4 （Sigma，目录号：S3264-500G）（室温储存）

17. D-(+)-葡萄糖（Fisher，目录号：50-712-745）（室温储存）

18. HEPES（7.4）（Fisher Scientific，目录号：H75030-5000.0）（室温储存）

19. 用于调节 pH 值的 37% HCl（Sigma-Aldrich，目录号：320331-500ML）（室温储存）

20. CaCl 2 （Sigma-Aldrich，目录号：223506-500G）（室温储存）

21. 过滤灭菌水、双蒸水和高压灭菌水

22. 蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：84097-1KG）（室温储存）

23. EDTA（Sigma，目录号：E5134-500G）（室温储存）

24. DPBS，无钙，无镁（Thermo Fisher Scientific，目录号：14190136）（储存于4 °C）

25. 聚-D-赖氨酸氢溴酸盐（Millipore Sigma，目录号：P0899-500MG）（在-20°C 下以 0.5 mg/ml 储存，以 0.05 mg/ml 使用）

26. Hibernate A 培养基（BrainBits，目录号：HA）（在 4°C 下储存）

27. 胰蛋白酶 EDTA 1×（Corning，目录号：25-053-Cl）（在 4°C 下储存）

28. Neurobasal-A 培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：10888022）（4°C 保存）

29. GlutaMax Supplement（Fisher Scientific，目录号：35-050-061）（储存在4°C）

30. B27补充剂（50×）（Thermo Fisher Scientific，目录号：17504044）（-20°C储存）

31. 条件神经元介质（见注 2）

32. Paritaprevir（PRV）（MedChemExpress，目录号：HY-12594）（储存在-20°C）

33. Glycaprevir（GCV）（MedChemExpress，目录号：HY-17634）（储存在-20°C）

34. DMEM 培养基 (DMEM+2)（见配方）

35. HBS（见食谱）

36. 蔗糖缓冲液（见配方）

37. 神经元培养基（NBMA+3）（见食谱）

设备

1. 37°C 和 5% CO ₂_的培养箱

2. 离心机（Eppendorf Centrifuge 5430）

3. 超速离心机 (Beckman Coulter Optima L90K 超速离心机) 和转子 (SW28)

软件

1. 用于蛋白质印迹分析的 ImageJ（斐济）

2. 用于蛋白质印迹分析的 Prism 软件 (GraphPad 9.0.0)

程序

仿制品的设计：

给定蛋白质的敲除构建体必须包括 NS3/4A 蛋白酶、一个 10 个氨基酸的底物位点（氨基酸 ADVVCC | QMSY，其中 | 标记切割）和功能性 POI。在此设计过程中，发布的 POI 结构可能有助于决定放置基板位置的位置。最重要的是，POI 必须适合添加蛋白酶标签和插入底物位点。这可以通过分别进行这些修改（蛋白酶标签和底物位点插入）并将修改后的构建体与常规 KO 表型进行比较来检查。

POI 和蛋白酶之间的灵活接头有助于保持 POI 标记后的功能，并允许蛋白酶自由到达底物位点。接头的长度应根据蛋白酶和底物位点之间的距离使用已公开的结构信息进行估算。我们已成功使用由 Gly-Ser-Ser-Ala 重复序列组成的不同长度的灵活接头。我们使用肽键的近似长度来估计接头的长度，该长度为 0.36 nm（Ainavarapu等，2007）。

蛋白酶也应与底物位点位于膜的同一侧以允许进入。关于 10 个残基底物裂解位点的位置，如果该位点位于蛋白质的灵活、可接近的区域中，再次允许蛋白酶和底物位点聚集在一起，则是有帮助的。例如，在突触结合蛋白 1 敲除构建体 (SYT1-SELF) 中，底物位点位于跨膜结构域和 Ca ²⁺结合结构域之间的近膜区域（Vevea 和 Chapman，2020）。如果需要，可以在插入的底物位点的任一侧包含小的柔性接头，以确保蛋白酶可以访问切割位点。

我们发现表达这些构建体的最佳方式是在慢病毒载体中。图 1 显示了一个表达 SYT1-SELF 的慢病毒载体示例。慢病毒可以很容易地“内部”制造，在 -80°C 的冰箱中储存良好，具有高转导率，并允许以最少的时间进行广泛的可滴定蛋白质表达毒性。

图 1. SYT1-SELF 仿制品的设计。

A. 描绘 SYT1-SELF 仿制结构的图表。用 Biorender 制作。B. 用于慢病毒转导 SYT1-SELF 构建体的质粒的载体图谱。这是第三代慢病毒载体 pFUGW，经过修改以使用人类突触蛋白启动子以确保仅在神经元中表达。应调整病毒滴度以匹配内源蛋白水平的表达。

A. 慢病毒生产（改编自 Kutner等人，2009 年）

1. 用 HEK-293T 细胞播种 15 cm 培养皿，并在转染时在 30-40% 汇合处使用。

2. 使用 CaPO ₄转染以 27 µg 基于 pFUGW 的载体、20 µg pCD/NL 和 6 µg pLTR-G 每 15 厘米培养皿转染 HEK-293T 细胞，如前所述（Kutner等人，2009）（ 2× HBS 参见配方 3）。

3. 16 小时后，用 22 ml 新鲜 DMEM+2 替换含 DNA 的培养基（参见配方 1）。

4. 四十八小时后，从组织培养皿中收集上清液。

5. 在室温下以 500 × g离心介质10 分钟。通过 0.45 µm PES（低蛋白结合）瓶顶过滤器过滤该上清液。

6. 将所有含病毒的培养基移至超速离心管中，然后小心地在超速离心管底部加入 4 ml 蔗糖缓冲液（参见配方 2），以便浓稠的蔗糖缓冲液可以将病毒从培养基中滤出。超速离心。

7. 将培养基和蔗糖缓冲液在 4°C 下以 82,250 × g离心2 小时。

8. 将病毒沉淀重悬在 100 µl 不含 Mg ²⁺/Ca ²⁺的 PBS 中。病毒可以储存在-80°C 直到使用。

B. 神经元培养物的制备

1. 在室温下将聚 D-赖氨酸添加到 12 孔培养皿中 1 小时。用无菌水清洗孔两次。

2. 在妊娠第 18 天用窒息气体 (CO ₂)牺牲一只怀孕的老鼠。

3. 在层流罩中，取出胚胎，并在 Hibernate A 培养基中提取海马。

4. 在胰蛋白酶/EDTA 中将海马体在 37°C 下孵育 30 分钟，每 10 分钟反转一次。

5. 用 1 ml DMEM+2 培养基清洗海马两次，然后研磨细胞不超过十次以分离海马。

6. 在 12 孔板中以每毫升每毫升1.25 × 10 ⁵^个细胞或在 24 孔板中每孔的一半来铺板神经元。

7. 接种后一小时，取出 DMEM+2 培养基，每孔更换 1 ml NBMA+3（参见配方 4）。

8. 第一周后每周两次添加 300 µl 新鲜 NBMA+3（用于 24 孔板）以维持神经元。

C. 转导和抑制剂

1. 当神经元培养物在体外 (DIV) 达到 2-6 天时，向每个孔中加入适量的慢病毒。适当的量将取决于 POI 表达的正常量；注意不要过度表达修饰的蛋白质。

注意：需要为创建的每批病毒调整病毒滴度。滴定至内源性表达水平并注意蛋白质过度表达。

2. 在同一天，将 NS3/4A 蛋白酶抑制剂添加到细胞中，使其最终浓度为 0.5 µM。

3. 添加培养基以维持神经元时，添加含有抑制剂的培养基以保持浓度一致。在培养的两周内，我们没有观察到任何 PRV 损失。

D. 去除抑制剂和评估蛋白质降解

1. 从孔中取出所有培养基，用条件化的 NBMA+3 短暂洗涤两次，然后在 37°C 下洗涤 5-10 分钟。洗涤后孵育也应使用有条件的 NBMA+3 培养基。

注意：条件培养基是用于培养健康皮质神经元的神经元培养基，因此已经含有神经元分泌的生长因子。这种培养基可以从不在同一块板上或在同时生长的其他神经元上使用的孔中生成。要储存条件化神经元培养基，请将其从 14-21 DIV 的细胞中取出，过滤除菌，并储存在 4°C 以备数周内使用或冷冻（从 -20°C 至 -80°C）以备后用。

2. 切割效率可以通过蛋白质印迹评估，如图 2 所示。这应该用于确定切割是否发生在构建体中并确认对抑制剂的敏感性。

图 2. 观察到用 Paritaprevir 或 Glecaprevir 处理的 SYT1-SELF 敲除表达神经元的切割率。

A. 使用抗 FLAG 抗体的代表性免疫印迹显示大鼠皮层神经元中 SYT1-SELF 的裂解。通过三氯乙醇 (TCE) 凝胶染色显示总蛋白。与 PRV 处理的神经元相比，GCV 处理的神经元具有较慢的 SYT1-SELF 分裂速率，这可能是由于 GCV 的解离速率较慢。B. (A) 中印迹的定量，平均值±扫描电镜，N=2。PRV 似乎很快从蛋白酶解离，而 GCV 不会，有效地阻止了数小时的切割。高原_PRV= 0.15；高原_GCV= 0.63。

E. 下游应用

一旦去除抑制剂，神经元（或其他细胞类型）就可以用所需的方法进行询问了。请注意从程序 D 计算的裂解率以指导下游应用。

数据分析

1. 使用 ImageJ 从免疫印迹中量化蛋白质水平。

2. tau 和高原的值是通过 GraphPad Prism 的非线性回归计算的。

笔记

1. 在这里，我们观察到的t明显短于我们之前针对该构造观察到的值（Vevea 和 Chapman，2020 年）。一个可能的原因是这里使用了大鼠皮质野生型神经元，之前使用了小鼠海马 SYT1KO 神经元。

2. 有关完整的免疫印迹程序，请参阅 Vevea 和 Chapman (2020)。许多抗体可用于验证敲除。研究人员的POI特异性抗体是最有用的，但是我们这里使用的抗NS3抗体1B6或抗FLAG也非常有用。

食谱

1. DMEM 培养基 (DMEM+2)

440 毫升 DMEM

10 ml (1x) 青霉素链霉素

50 毫升胎牛血清

2. 蔗糖缓冲液

在过滤灭菌、双蒸和高压灭菌的水中。

0.2 克/毫升蔗糖

100 毫米氯化钠

20 mM HEPES

1 mM EDTA

3. 哈佛商学院

在 500 ml过滤器灭菌、双蒸和高压灭菌的水中。

8.0 克氯化钠

0.37 克氯化钾

0095 克 Na ₂HPO ₄

1.35 克葡萄糖

5.0 克 HEPES

加入 HCl 直至 pH 值为 7.0-7.05

4. 神经元培养基 (NBMA+3)

480 毫升 Neurobasal A 培养基

10 ml (1x) 青霉素链霉素

5 毫升 (1×) GlutaMax 补充剂

5 ml (1×) B-27 补充剂

致谢

这项研究得到了 NIH（MH061876 和 NS097362 给 ERC）的资助。JDV 得到了美国国立卫生研究院 F32 NS098604 博士后奖学金和沃伦阿尔珀特杰出学者奖学金的支持。ERC 是霍华德休斯医学研究所的研究员。Biorender 用于构建一些图形。该协议基于描述仿冒品的原始研究论文，并作为对该方法的扩展解释（Vevea 和 Chapman，2020 年；DOI：10.7554/eLife.56469）。

利益争夺

作者声明没有相互竞争的经济利益。

参考

1. Ainavarapu, SR, Brujic, J., Huang, HH, Wiita, AP, Lu, H., Li, L., Walther, KA, Carrion-Vazquez, M., Li, H. 和 Fernandez, JM (2007)。由工程二硫键控制的小蛋白质的轮廓长度和重折叠率。生物物理学杂志92(1): 225-233。

2. Clift, D., McEwan, WA, Labzin, LI, Konieczny, V., Mogessie, B., James, LC 和 Schuh, M. (2017)。一种快速快速降解内源性蛋白质的方法。细胞171(7)：1692-1706 e1618。

3. Dörrbaum, AR, Kochen, L., Langer, JD 和 Schuman, EM (2018)。局部和全局对神经元和神经胶质细胞蛋白质周转的影响。Elife 7：e34202。

4. Kutner, RH、Zhang, XY 和 Reiser, J. (2009)。基于假型 HIV-1 的慢病毒载体的生产、浓缩和滴定。 国家协议4(4)：495-505。

5. Lois, C., Hong, EJ, Pease, S., Brown, EJ 和 Baltimore, D. (2002)。慢病毒载体传递的转基因的种系传递和组织特异性表达。科学295（5556）：868-872。

6. Natsume, T.、Kiyomitsu, T.、Saga, Y. 和 Kanemaki, MT（2016 年）。通过用短同源供体进行生长素诱导的 Degron 标记快速去除人类细胞中的蛋白质。 细胞代表15(1)：210-218。

7. Reiser, J.、Harmison, G.、Kluepfel-Stahl, S.、Brady, RO、Karlsson, S. 和 Schubert, M. (1996)。使用假型缺陷高滴度 HIV 1 型颗粒转导非分裂细胞。Proc Natl Acad Sci USA 93(26): 15266-15271。

8. Sauer, B. (1987)。cre-lox 位点特异性重组系统在酵母酿酒酵母中的功能表达。Mol Cell Biol 7(6)：2087-2096。

9. Toure, M. 和 Crews, CM (2016)。小分子 PROTACS：蛋白质降解的新方法。 Angew Chem Int Ed Engl 55(6)：1966-1973。

10. Vevea, JD 和查普曼, ER (2020)。在小鼠海马神经元中使用敲除对突触囊泡膜蛋白突触结合蛋白 1 的急性破坏。Elife 9：e56469。

11. Zhang, XY, La Russa, VF 和 Reiser, J. (2004)。使用经修饰的 RD114 包膜糖蛋白假型化的慢病毒载体转导骨髓来源的间充质干细胞。J Virol 78(3)：1219-1229。