材料和试剂

材料
5毫升聚苯乙烯圆底管（Corning，目录号：352052）
TC 涂层 6 孔板（Corning，目录号：353502）
TC 涂层 12 孔板（Corning，目录号：353503）
96 孔 U 型和 V 型底板（Corning，目录号：353077、3894）
1.5 ml 微量离心管（Fisher Scientific，目录号：229442）
15 ml 和 50 ml 锥形管（Corning，目录号：352096、352070）
无菌 1 ml 或 3 ml 注射器（BD，目录号：309628、309657）

媒体和缓冲区
Lymphoprep的TM （干细胞技术，目录号：07801）
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（DPBS；Gibco，目录号：14190），1 ×
X-VIVO 15（Lonza，目录号：BEBP02-054Q）
人血清（Wisent Bio Products，目录号：022210）
青霉素/链霉素（Gibco，目录号：15140-122）
GlutaMAX（Gibco，目录号：35050-061）
丙酮酸钠（Gibco，目录号：11360-070）
胎牛血清（Gibco，目录号：12483020）
乙二胺四乙酸溶液（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：03690）
EasySep 缓冲液（见配方）
树突细胞培养基（见食谱）

试剂
Stericup-GP 无菌真空过滤系统（Millipore，目录号：SCGPU05RE），500 ml
EasySep Human CD14 Positive Selection Kit II（STEMCELL Technologies，目录号：17858）
吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI；Nexcelom，目录号：NEX-CS201065ML）

细胞因子
重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）（STEMCELL Technologies，目录号：78015），20 μ克/毫升
重组人白细胞介素（IL）-4（STEMCELL Technologies，目录号：78045），20 μg/ml
重组人肿瘤坏死因子（TNF）-α（eBioscience，目录号：14-8329-63），20 μg/ml
前列腺素 E2（PGE2）（Tocris，目录号：2296），100 mM
重组人 IL-1β（STEMCELL Technologies，目录号：78041），20 μg/ml
重组人 IL-6（STEMCELL Technologies，目录号：78148），20 μg/ml
重组人干扰素（IFN）-γ（eBioscience，目录号：14-8319-80），20 μg/ml
重组人 IL-2 (Proleukin) (Novartis, DIN# 02130181)

抗体
Fc受体结合抑制剂多克隆抗体（eBioscience，目录号：14-9161-73）
可固定活力染料（FVD）（eBioscience，目录号：65-0865-18）
抗人 CD3（UCHT1 ）APC（BD Biosciences，目录号：564465）
抗人 CD3（UCHT1）BB515（BD Biosciences，目录号：564465）
抗人 CD4（OKT4）APC（eBioscience，目录号：17-0048-42）
抗人 CD4（RPA-T4）BV711 （BioLegend ，目录号：300558）
抗人 CD8a（RPA-T8）BV711（BioLegend ，目录号：301044）
抗人 CD11c（B-ly6 ）PE（BD Biosciences，目录号：555392）
抗人 CD14（M5E2）BV421（BioLegend ，目录号：301830）
抗人 CD14 （M5E2）BV786（BD Biosciences，目录号：563698）
抗人 CD40 （5C3 ）PE-Cy7 （BD Biosciences，目录号：561215）
抗人 CD56 （CMSSB ）PE（eBioscience，目录号：12-0567-42）
抗人 CD69 （FN50）BV785（BioLegend ，目录号：310932）
抗人 CD70 （113-16 ）PerCP-Cy5.5（BioLegend，目录号：355107）
抗人 CD80（L307.4）FITC（BD Biosciences，目录号：557226）
抗人 CD83 （HB15e ）BV421 （BioLegend ，目录号：305324 ）
抗人 CD86 （2331（FUN-1））APC （BD Biosciences，目录号：555660）
抗人 CD86 （HA5.2B7）PerCP-Cy5.5 （Beckman Coulter，目录号：B30647）

设备

II 型生物安全柜（NuAire，型号：LabGard ES NU-540）
离心机、微量离心机（Eppendorf，型号：5810R 和 5452）
STEMCELL EasySep TM磁铁（STEMCELL Technologies，目录号：18000）
细胞计数器（Nexcelom，型号：Cellometer Auto 2000）
37°C 培养箱，含 5% (v/v) CO 2 （三洋，型号：MCO-18AIC）
流式细胞仪（BD LSRFortessa X-20；可以使用替代仪器）

软件

FlowJo 软件（BD Biosciences，v10.7）

程序

概述
第 0 天：准备外周血单核细胞 (PBMC)。
第 0 天：通过正选择从 PBMC 中分离 CD14 +单核细胞。
第 0 天：通过在 GM-CSF 和 IL-4 存在下培养，将单核细胞分化为树突细胞。
第 3 天：补充 GM-CSF 和 IL-4。
第 5 天：通过向培养物中添加 TNF-α、PGE2、IL-1β 和 IL-6 使树突状细胞成熟。
第 6 天：通过向培养物中添加 IFN-γ 使树突状细胞成熟。
第 7 天：通过流式细胞术确认 DCs 的成熟并设置抑制检测。
第11天：收集细胞、染色、进行流式细胞术和分析。

详细程序
第 0 天：准备 PBMC
准备 PBMC：从血液中新鲜分离或解冻的 PBMC。根据制造商的方案，可以使用 Lymphoprep TM通过密度梯度离心从人外周血中分离 PBMC 。
注意：使用来自一位捐赠者的批量冷冻 PBMC 来区分 moDC 将减少捐赠者与捐赠者之间的变异性。预计 5-10% 新鲜/冷冻 PBMCs 或 50-100% CD14 +细胞成为 moDCs。有关更多详细信息，请参阅注释。
可选：留出 ~5 × 10 3 -10 × 10 3 PBMCs 用于纯度检查（参见表 1、图 1 和注释以获取更多信息）。

表 1. 第 0 天纯度检查面板。如果需要，并行染色 PBMC。有关代表性数据，请参见图 1 。

图 1. 第 0 天 CD14 +纯度检查。( A ) 大约 5 × 10 3 -10 × 10 3总 PBMC 和 ( B ) 富含 CD14 的细胞通过流式细胞术染色和分析，以评估富含 CD14 的细胞的纯度和 CD3 +细胞污染的程度。如果在检测过程中包含 OKT3（抗 CD3），污染 T 细胞会影响下游结果（见注释）。按照表 1 中所述并根据“免疫学研究中使用流式细胞术和细胞分选指南”（Cossarizza等人，2019 年）对细胞进行染色；它们是用 BD LSRFortessa X-20 采集的，并使用 FlowJo 分析数据。那是CD14总活细胞的比例+ CD3 - （CD14 +细胞的纯度）被示出在左侧。从活的 CD14 ‒细胞中，分析 CD56 表达（中）以识别 NK/NKT 细胞（CD56 med/hi ）和单核细胞亚群（CD56 lo ）。进一步分析了污染的活 CD14 ‒ CD3 + T 细胞的 CD4 和 CD8 表达（右图）。有关更多信息，请参阅注释。

第 0 天：使用 STEMCELL EasySep Human CD14 Positive Selection Kit II分离 CD14 +单核细胞，按照制造商的协议和如下所述，除非另有说明：
在 EasySep 缓冲液 (0.1-2 ml) 中以 100 × 10 6 /ml重悬 PBMC 。PBMC 的总起始数量应介于 10 × 10 6和 200 × 10 6细胞之间。对于 x 个 CD14 +单核细胞，从 10×（新鲜）或 ~20×（冷冻）PBMC 开始。
将 PBMC 转移到 5 ml 聚苯乙烯圆底管中。
每毫升细胞加入 100 μl Selection Cocktail，并在室温 (RT) 下孵育 10 分钟。
涡旋 RapidSpheres 30 秒，每毫升细胞加入 100 μl RapidSpheres，轻轻旋转混合管，并在室温下孵育 3 分钟。
用 EasySep 缓冲液将管加满至 2.5 ml，通过移液混合，置于 EasySep TM磁体中，并在室温下孵育 3 分钟。
在磁铁中轻轻倒入管子以丢弃上清液。圆底管含有 CD14 +细胞（保留）。
通过从磁铁上取下圆底管并用 2.5 ml EasySep 缓冲液加满管来清洗剩余的 RapidSpheres。通过移液将层从管壁上洗掉，将管放回磁铁中，并在 RT 中孵育 3 分钟。倒掉上清液，倒置时从管中吸取最后一滴。
重复步骤 B7，使细胞管在磁铁中共孵育 3 次。
可选地重复步骤 B7 两次（在磁铁上总共五次）以获得更高的富集度。
注意：此步骤不是原始 STEMCELL Technologies 协议的一部分。
通过用 ~ 3 ml DPBS 清洗圆底管壁，将细胞从圆底管转移到 15 ml 锥形管中。以 450 × g离心5 分钟并丢弃上清液。
在树突细胞培养基中重悬富集的 CD14 +细胞（参见食谱）。
计数细胞（有关详细信息，请参阅 Nexcelom Cellometer Auto 2000 的协议；或者，可以使用血细胞计数器和台盼蓝）。
可选：留出 ~5 × 10 3 -10 × 10 3单核细胞进行纯度检查（参见表 1、图 1 和注释以获取更多信息）。

第 0 天：培养并分化富集的 CD14 +细胞为树突细胞
使用树突细胞培养基将细胞调整为每毫升2 × 10 6 个细胞。
在 6 孔板中每孔加入 2 ml 细胞（每孔 4 × 10 6细胞）。
注意：根据需要接种多个细胞孔。
添加 GM-CSF（最终浓度：50 ng/ml）和 IL-4（最终浓度：100 ng/ml）。
在 37°C (5% v/v CO 2 )下孵育细胞3 天。
注意：细胞因子可以在 4°C 下储存约 1 周。

第 3 天：更换树突状细胞培养基并补充细胞因子
更换树突状细胞培养基：在不干扰孔底细胞的情况下，收集 1.5 ml 培养基到无菌 1.5 ml 微量离心管中，450 × g离心5 min，弃上清，将沉淀的细胞重悬于 1.5 ml 新鲜离心管中树突细胞培养基，并重新接种到原孔中。
通过添加新鲜的 GM-CSF（最终浓度：50 ng/ml）和 IL-4（最终浓度：100 ng/ml）来充分补充细胞因子，假设从第 0 天开始没有细胞因子留在培养物中。
在 37°C (5% v/v CO 2 )下孵育2 天。
注意：细胞因子可以在 4°C 下储存约 1 周。
替代培养基更换方法：45 0 × g离心板5 分钟，轻轻更换 1.5 ml 树突状细胞培养基，并如上文所述充分补充 GM-CSF 和 IL-4。

第 5 天：成熟的树突细胞
收集细胞：上下吸管以分离细胞并收集到 15 ml 或 50 ml 锥形管中。使用 1 ml 或 3 ml 注射器橡胶轻轻单向分离剩余细胞。用 DPBS 冲洗两次以收集尽可能多的细胞。
通过用 DPBS 填充锥形管来洗涤细胞，以 450 x g离心细胞5 分钟，并丢弃上清液。
在新鲜的树突细胞培养基中重悬细胞，计数细胞并调整体积，使细胞在树突细胞培养基中的最终浓度为 1 × 10 6 个细胞/ml。
添加 GM-CSF（最终浓度：50 ng/ml）和 IL-4（最终浓度：100 ng/ml）。
通过在新的 6 孔板中每孔添加 2 ml 细胞（每孔 2 × 10 6 个细胞）或在新的 12 孔板中每孔添加 1 ml 细胞（1 × 10 6 个细胞每口井）。
通过添加 TNF-α（终浓度：50 ng/ml）、PGE2（终浓度：1 μg/ml，~2.837 µM）、IL-1β（终浓度：10 ng/ml）和 IL-6（终浓度：100 ng/ml）。
注意：如果需要不成熟的 moDC，请跳过此步骤。保持至少 1 × 10 6未成熟的 moDC（GM-CSF 和 IL-4，没有额外的细胞因子）对于评估最后的 moDC 成熟（第 7 天，参见程序 G）很有用。
在 37°C (5% v/v CO 2 )下孵育1 天。

第 6 天：继续成熟的树突细胞
添加 IFN-γ（最终浓度：50 ng/ml）。
注意：对于未成熟的 moDC，请跳过此步骤。
在 37°C (5% v/v CO 2 )下孵育1 天。

第 7 天：在设置抑制检测之前确认 DCs 的成熟
通过移液重悬收集细胞并转移到 15 ml 锥形管中。使用 1 ml 或 3 ml 注射器橡胶轻轻单向分离剩余细胞。用 DPBS 洗两次井，并将其添加到锥形管中。将细胞以 450 × g离心5 分钟，重悬在新鲜的树突细胞培养基中，计数细胞，并在树突细胞培养基中调整细胞浓度至 5 × 10 5 个细胞/毫升。
通过收集 ~5 × 10 6 -10 × 10 6成熟的 moDCs 和未成熟的 moDCs 用于流式细胞术染色来确认 moDC 成熟（见表 2，图 2）。

表 2. 第 7 天 moDC 成熟度检查面板。未成熟的 moDC 必须平行染色。有关代表性数据，请参见图 2。

图 2.未成熟和成熟 moDC 的第 7 天表型。(AC)通过流式细胞术分析未成熟 (黑线) 和成熟 (蓝色) moDCs 的 CD11c、CD14、CD80、CD86、CD40、CD83 和 HLA-DR 的表达。如表 2 所述并根据“免疫学研究中流式细胞术和细胞分选的使用指南”（Cossarizza等人，2019 年）对细胞进行染色；它们是用 BD LSRFortessa X-20 采集的，并使用 FlowJo 分析数据。moDC（作为活的单细胞门控）表达相似水平的谱系标志物 ( A )，但在成熟后上调 CD80、CD86、HLA-DR、CD40 和 CD83 的表达 ( BC )。MFI，几何平均荧光强度。

第 7 天：设置 DC 抑制检测
在 96 孔 U 型底板（每孔 50,000 个细胞）中加入 100 µl moDC。
收集静止的 Tregs，计数细胞，并以每毫升2.5 × 10 6细胞重悬于含有 100 IU/ml IL-2 的树突细胞培养基中。
注意：Treg 应使用用户实验室建立的协议进行扩展和休息。Dawson 等人提供了有关如何扩展和休息此协议的 Treg 的详细信息。(2020)。简而言之，从外周血中分离出 Treg，并在 1000 IU/ml IL-2 存在下用人工 APC 多克隆扩增 7 天。然后通过在含有 100 IU/ml IL-2 的新鲜培养基中培养过夜使 Treg 静置。CAR Tregs 是在刺激后一天通过慢病毒转导多克隆 Tregs 产生的。
以 1 比 5 的比例设置 moDC 和 Treg 共培养（每孔 50,000 DC 至 250,000 Treg）：将 100 μl Treg 细胞悬液添加到含有步骤 H1 中的 moDC 的孔中。
对照孔：单独设置一个 moDC 孔和另一个单独的 Treg 孔作为单独孔中的对照，每孔的最终体积为 200 µl。
将细胞在树突细胞培养基中与 50 IU/ml IL-2 在 37°C (5% v/v CO 2 )中共培养 4 天。

第 11 天：流式细胞术
收集细胞：将细胞培养板以 970 × g离心 3 分钟，从离心机中取出，并通过移液去除一半体积（100 μl）的上清液。将剩余的上清液中的细胞重新悬浮并转移到新的 96 孔 V 型底板中。用 100 μl DPBS 清洗细胞培养板中的孔，并将其添加到 V 型底板的各个孔中。
将板以 970 × g离心3 分钟，弃去上清液，并用 200 µl DPBS 重悬细胞进行洗涤。
将板以 970 × g离心3 分钟并丢弃上清液。
使用表 3 通过流式细胞术对细胞进行染色。示例数据参见图 3。

表 3. 第 11 天的 moDC 抑制分析面板。单独的 moDC 和单独的 Treg 对照必须平行染色。有关代表性数据，请参见图 3。

图 3. 与 Treg 共培养后成熟 moDC 上 CD80 和 CD86 的第 11 天分析。(AB)成熟的 moDCs 和 Tregs 共培养 4 天，然后按照表 3 中所述并根据“免疫学研究中使用流式细胞术和细胞分选指南”（Cossarizza等人， 2019); 它们是用 BD LSRFortessa X-20 采集的，并使用 FlowJo 分析数据。( A ) 识别成熟 moDC 的门控策略。活单线态细胞被门控，moDCs 被鉴定为 CD11c + CD4 -细胞。( B ) 与 Treg 共培养后 CD80（左）和 CD86（右）的表达。该测定使用与多克隆 ΔNGFR 转导的 Treg 或 HLA-A2 特异性 CAR 转导的 Treg 共培养的HLA-A2 + moDC 进行。与单独培养的 moDC（黑线）相比，多克隆 Treg 发挥中等水平的抑制作用（绿色），这由 CD80 和 CD86 表达的降低决定。当使用 A2-CAR Tregs（蓝色）进行共培养时，这种抑制作用更大。见道森等。(2020) 获取更多示例。

笔记

PBMC：新鲜和冷冻的 PBMC 相似，适用于 moDC 分化。冷冻 PBMC 产生的 CD14 +单核细胞比新鲜 PBMC略少。使用来自单个供体的冷冻 PBMC可以减少供体之间的 moDC 变异性。新鲜的 PBMC 可以在实验当天（立即进行 CD14 +分离）或实验前一天制备[在 4°C 下在 25 ml 10% (v) 胎牛血清补充培养基中储存过夜（例如， RPMI 1640) 与 25 ml DPBS 在水平放置在冰箱中的 50 ml 管中混合]。
CD14 +选择性能：选择后（3x 磁体隔离，根据制造商的协议），90-95% 为 CD14 +细胞，0.5-5% 为 CD3 + T 细胞（见图 1）。如果 FSC/SSC 电压和阈值设置得太低，则可能会掩盖污染 T 细胞的检测。T 细胞污染持续到第 7 天，并可能影响 moDC-T 细胞共培养的结果（例如，如果添加了 OKT3）。因此，可以将抗 CD3 抗体添加到第 7 天的 moDC 成熟面板中以评估纯度，因为细胞已经扩增（而不是第 0 天）。
moDC 谱系标记：moDC 应该是 CD11c +和 CD14 – 。moDC 成熟标志物：成熟的 moDCs 应该是 CD80 hi 、CD86 hi 、HLA-DR hi （Ag 呈递和 T 细胞共刺激）、CD40 + （促进 CD40L + T 细胞成熟和细胞因子分泌）和 CD83 + （功能不太清楚））。
共培养：在建立抑制共培养之前，确认 moDC 成熟很重要。

食谱

EasySep 缓冲液
DPBS 补充了 2% (v/v) 胎牛血清、1 mM EDTA。内容物用 Stericup-GP 真空过滤瓶进行无菌过滤。
树突细胞培养基
X-VIVO 15 补充有 5% (v/v) 人血清、1% (v/v) 青霉素-链霉素、1% (v/v) GlutaMAX、1% (v/v) 丙酮酸钠。内容物用 Stericup-GP 真空过滤瓶进行无菌过滤。

致谢

这项工作得到了加拿大卫生研究院 (CIHR) FDN-154304 和 TxCell 的资助。AJL 和 NAJD 获得了 CIHR 博士奖的支持，MKL 获得了不列颠哥伦比亚省儿童医院研究所的工资奖。该方法源自 Dawson等人的原始出版物。（2020 年）（DOI：10.1126/scitranslmed.aaz3866）。

利益争夺

本手稿的作者已从 Sangamo Therapeutics（前身为 TxCell SA）获得研究资金，以部分支持这项工作。MKL 还获得了武田、百时美施贵宝、辉瑞和 CRISPR Therapeutics 的研究资助，用于与本研究无关的工作。

伦理

对于所有研究，健康志愿者根据不列颠哥伦比亚大学临床研究伦理委员会和加拿大血液服务机构批准的协议签署了书面知情同意书。

参考
Cossarizza A、Chang HD、Radbruch A、Acs A、Adam D、Adam-Klages S、Agace WW、Aghaeepour N、Akdis M、Allez M.等。(2019)。免疫学研究中流式细胞术和细胞分选的使用指南（第二版）。Eur J Immunol 49(10):1457-1973。
Dawson, NAJ, Rosado-Sanchez, I., Novakovsky, GE, Fung, VCW, Huang, Q., McIver, E., Sun, G., Gillies, J., Speck, M.等。(2020)。嵌合抗原受体共受体信号域在人类调节性 T 细胞中的功能作用。Sci Transl Med 12(557): eaaz3866。
Fung, VCW, Rosado-Sanchez, I. 和 Levings, MK (2021)。用慢病毒转导人 T 细胞亚群。方法 Mol Biol 2285：227-254。
Onishi, Y.、Fehervari, Z.、Yamaguchi, T. 和 Sakaguchi, S. (2008)。Foxp3 +天然调节性 T 细胞优先在体外在树突细胞上形成聚集体并积极抑制它们的成熟。Proc Natl Acad Sci USA 105(29): 10113-10118。
Walker, LS 和 Sansom, DM (2011)。CTLA4 作为 T 细胞反应的细胞外源调节剂的新兴作用。Nat Rev Immunol 11(12): 852-863。
Wang, AY, Crome, SQ, Jenkins, KM, Medin, JA, Bramson, JL 和 Levings, MK (2011)。腺病毒转导的树突细胞容易受到 T 调节细胞的抑制并促进白细胞介素 17 的产生。癌症免疫学免疫学60(3): 381-388。

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