材料和试剂

1. 2 ml 管（Eppendorf，目录号：0030.120.094）

2. 1.5 ml 管（Eppendorf，目录号：0030.120.086）

3. 1,000 μl 吸头（Axygen，目录号：TF-1000-LRS）

4. 200 μl 吸头（Axygen，目录号：TF-200-LRS）

5. 50毫升管（康宁，目录号：430829）

6.注射器过滤器0.22μm（Millipore，目录号：SLGS033SS）

7. 50 ml注射器（Fisher BD，目录号：309653）

8. 培养皿，组织培养处理（Falcon，目录号：353003）

9. 12 孔板，组织培养处理（Falcon，目录号：353043）

10. 60 mm 板，组织培养处理（Falcon，目录号：353002）

11. 盖玻片（Thermo Scientific，Menzel-Glaser 12mm 直径 #1）

12. 载玻片（Thermo Scientific, Menzel-Glaser AA00000102E01FST20）

13. C57BL/10（WT）（JAX，目录号：000665）

14. 冰

15.胶原酶I（Sigma，目录号：C0130）

16.成纤维细胞生长因子（FGF）（Gibco，目录号：PHG0026）

17.鸡胚提取物（CEE）（Life Science Production，目录号：MD-004D-UK）

18.抗Pax7小鼠单克隆抗体（DSHB，目录号：Pax7-s [1:10]）

19.抗Ki67兔多克隆（Abcam，目录号：ab15580 [1:100]）

20. Alexa Fluor 488，兔（Invitrogen，目录号：A21206 [1:250]）

21. Alexa Fluor 594，小鼠（Invitrogen，目录号：A21203 [1:250]）

22. 反义寡核苷酸：LNA GapmeRs：非靶向对照（Qiagen，目录号：300610）或lncRNA 序列特异性定制 GapmeRs

23. Lipofectamine 2000（Invitrogen，目录号：11668019）

24. Optimem（Gibco，目录号：31985047）

25. Click-iT EdU Alexa Fluor 594 HCS 检测（Invitrogen，目录号：C10354）

26.乙醇（Sigma，目录号：32221）

27.磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma，目录号：D8537）

28. Triton-X 100（Sigma，目录号：T8787）

29. 甘油（Applichem，目录号：A2926）

30.多聚甲醛（PFA）（ Sigma，目录号：P6148）

31.青霉素-链霉素（Sigma，目录号：P0781）

32. 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Sigma，目录号：28718-90-3 [1:10,000]）

33. Dulbecco's Modified Eagle培养基（DMEM），高葡萄糖，丙酮酸盐（Gibco，目录号：41966-052)

34.马血清（Gibco，目录号：26050088）

35.胎牛血清（FBS）（康宁，目录号：35-015-CV）

36. 消化液（见食谱）

37. 洗涤液（见配方）

38. 纤维生长培养基（见食谱）

39. IF 解决方案（见食谱）

设备

1. 微量移液器 (P200, P1000)

2.手术剪刀（FST，目录号：14060-10）

3. 珠宝商钳子，Dumont No. 5，L 4 1/4（Sigma，目录号：F6521）

4.显微镜（蔡司，型号：Stemi DV4）

5. Axio Observer 3倒置荧光显微镜（蔡司）

6. Shaker（Labnet，型号：Rocker 25）

7. Vortex（海道夫，型号：Reax 2000）

8. 水浴（Thermo Scientific、精密水浴）

9. CO 2培养箱（Euroclone，型号：S@fegrow 188）

10.冰桶

软件

1.斐济图像处理包（开源软件（OSS）项目， https://imagej.net/Fiji )

2. ZEN 3.0（蓝色版，蔡司）

程序

注意：如果计划培养纤维，请保持一切无菌。

A. 准备

1. 用冰块装满冰桶。

2. 准备“消化液”、“洗涤液”和“纤维生长培养基”（见配方）。

3. 将“洗涤液”和“纤维生长培养基”溶液预热至 37°C。

4. 用 FBS 涂覆 2 ml 管（每个样品一管）。向管中加入 1 ml FBS。把它向上移动直到管的两侧完全覆盖，然后丢弃 FBS。

注意：需要对管子进行涂层以保持肌纤维处于悬浮状态；否则，他们会

粘在管壁上。我们使用 FBS 进行涂层，因为这也将在生长培养基中。

5. 将 2 ml 的“消化液”加入每个涂层管中。把它放在冰上。

6. 将水浴预热至 37°C。

B. EDL 隔离

注意：此步骤必须在僵硬之前尽快执行。为此，我们建议一次从一只老鼠身上进行 EDL 隔离。

注意：始终处理从肌腱到肌腱的肌肉，避免接触大部分肌肉以保持肌纤维的完整性。

1. 使用批准用于您的研究的方法处死小鼠，例如 CO 2或宫颈

错位。

2. 用 70% 乙醇润湿小鼠的皮肤和皮毛。

3. 将鼠标放在引擎盖下。拉起并从脚踝处切开皮肤以去除皮肤并暴露胫骨前肌 (TA) 和趾长伸肌 (EDL)（视频 1）。

视频 1. EDL 隔离程序。（这个视频是在生物系制作的和大学 Sapienza 的生物技术，根据批准的指导方针生物和生物技术系动物护理和使用机构委员会意大利大学、意大利卫生部和地方当局表示法律; 协议 N° 7FF2C.4–授权 N° 746/2016-PR。）

4. 小心地从脚踝处剪下 TA 肌肉的肌腱，用手指抓住松散的肌腱镊子，轻轻拉起肌肉。然后切开膝盖下的TA肌肉暴露和对 EDL 肌肉有一个很好的可视化（视频 1）。

5. 在底部切开 EDL 的肌腱，刚好在脚踝上方，轻轻拉动肌肉直到它仅由膝盖上的肌腱附着。通过保持 EDL 远离脚踝肌腱，隔离在膝盖上切割肌腱的肌肉（视频 1）。将肌肉放入涂层内

管中加入“消化液”，然后将管置于冰上。

6. 用另一条腿重复步骤 B4 和 B5。将第二块肌肉添加到涂层管中“消化液”并将其置于冰上。

C. 消化

1. 将试管在 37°C 的预热浴中孵育 45 分钟至 1 小时。每 10 分钟轻轻摇晃一次。

注意：将管子颠倒几次；不要剧烈摇晃，以免破坏肌纤维。

提示：可以看到消化肌肉的状态通过管子对着一个光源。肌肉应该处于松弛状态。

2. 孵育结束时，剧烈摇晃以释放消化后的肌纤维肌肉。

提示：有可能看到释放的肌纤维在光线下通过管子看之前在最后的摇晃之后。

D. 单肌纤维隔离

注意：

1.此步骤需要尽快进行，以避免纤维收缩。当。。。的时候肌纤维在“消化盘”上放置时间过长，它们会开始收缩和收缩，导致肌纤维损伤。

2.为避免收缩，将所有溶液预热至 37°C。肌纤维对温度，并应始终保持在 37°C。

提示：如果可能，一次从一只老鼠身上分离肌纤维。在任何情况下，保留所有培养箱中含有纤维的培养板不使用时。

1. 为每只小鼠准备两个 60 毫米的板，其中包含 4 毫升预热的“洗涤液”用于清洁步。

2. 将含有纤维的消化溶液转移到带有“洗涤解决方案。”

注意：肌纤维应该看起来长、光滑、完整且略透明（图 2，红色箭）。

图 2. 新分离的单个肌纤维（红色箭头）的代表性图像洗盘。黑色箭头表示收集时应避免的碎片单肌纤维。

3. 用“洗涤液”移液一次，将 P200 微量移液器的尖端涂上。在下面解剖显微镜（Zeiss; Stemi DV4），带涂层的尖端，一个接一个肌纤维在纤维的方向以避免损坏，在尖端收集多根纤维，和轻轻地将它们释放到第二块干净的 60 毫米板中，该板含有 4 毫升预热的“洗涤液”溶液”（清洁步骤）。

提示：稍微倾斜板（并因此移动介质）以更好地可视化半透明的肌纤维。

注意：

一种。避免破损或收缩的碎片（图 2，黑色箭头），只取完整的单个肌纤维。湾关键一步！尽可能轻柔和快速。引擎盖上的所有清洁程序不应超过 10 分钟。

4. 挑取所有可见的完整肌纤维后，轻轻吸取消化的肌肉以释放肌纤维仍然附着在它上面。在显微镜下，可以看到肌纤维正在释放。

提示：可以使用 P1000 微量移液器的尖端用剪刀或使用先前在颈部折断的无菌玻璃巴斯德吸管。

注意：确保在使用前用介质涂抹尖端。

5. 当更多的肌纤维被释放时，用 P200 的涂层尖端挑出单个肌纤维微量移液器（如步骤 D3 中所做的那样）并将它们放入之前使用的 60 mm 板中清洁步骤。在这种情况下，也要避免破碎的碎片，只取单根肌纤维。

6. 当所有肌纤维都在清洁板中时，沿清洁板的方向挑出单根肌纤维。纤维并将它们铺在最后一道菜中（例如，24 孔板 ~10-15 纤维/孔或 12 孔板 ~20-25 纤维/孔）用于使用预热的“纤维生长培养基”进行培养。将板放回 37°C 的培养箱中。

注意：肌纤维是悬浮培养的，所以体积不能太小。让纤维漂浮在培养基中（例如，在 12 孔板中，它不应少于 1 毫升）。纤维可以立即固定和分析，也可以培养用于卫星细胞扩增。

E. 培养和转染

注意：肌纤维对温度的变化很敏感。

1. 转染前将肌纤维在培养箱中至少放置 4 小时。电镀后的第一个小时至关重要，因此将肌纤维保持在培养箱中以稳定它们。

2. 要进行转染，将 1 μl/ml 的 lipofectamine 与 49 μl Optimem 混合在一个 1.5 ml 中每个样品管。在另一个 1.5 ml 管中，从库存中加入 1 μl/ml 的反义寡核苷酸 (GapmeRs)以每个样品 50 μM 的浓度混合 49 μl Optimem。5分钟后，混合内容物将 lipofectamine 管与 GapmeRs 管的内容物混合并等待 20 分钟。移液器 100将 μl 混合物直接滴加到每个孔中的培养基中。孵育过夜 (13-14H）。

笔记：

一种。最终体积应为每孔 1 ml（对于 12 孔板）。湾我们强烈建议不要进行一次以上的过夜（13-14 小时）转染以避免肌纤维中断。

3. 早上更换介质，注意不要去除纤维。为此，轻轻地通过在一侧倾斜板并吸出培养基来尽可能多地去除培养基从对面。始终在盘子中保留一些培养基并添加新的预热“生长用于纤维的介质”在板的顶部，一滴一滴。让肌纤维下沉 10 分钟（最好是在培养箱中），然后再重复一次或两次该过程。

注意：非常轻轻地从表面吸入介质，以避免丢失悬浮的肌纤维。

4. 留在培养物中直到所需的时间点。将它们培养至少 96 小时是安全的电镀后（图 3）。

注意：如果仅在培养中保留 96 小时，则无需更换培养基以防止纤维损失。为了培养时间较长，我们建议每 2-3 天更换一次培养基。

图 3. 用于培养和转染单个肌纤维的实验时间线和 EdU 合并脉冲。

F. 教育合并

1. 按照制造商的说明，将 1 μl/ml 的 EdU 直接添加到培养基中。

2. 推荐脉冲为 24 小时（图 3）。

注意：脉冲应在所选时间点前 24 小时开始。

G. 肌纤维固定

注意：肌纤维处于悬浮状态，因此，在每一步之后，让纤维沉降到底部10 分钟，然后轻轻去除靠近表面的上清液。

注意：肌纤维固定是在井中进行的。

1. 从每个孔中轻轻取出 500 μl 培养基，注意不要去除纤维。注意：纤维应保留在 ~500 μl 中。

2. 直接在培养基中加入 1 ml 4% PFA，以获得 3% PFA 的终浓度。为离开室温下 30 分钟。

3. 尽可能多地去除 PFA，加入 1 ml PBS 洗涤肌纤维 10 分钟。重复此洗涤步骤 3 次。然后将肌纤维留在至少 1 ml PBS 中。

注意：可以将它们在 4°C 下保存数周。为避免 PBS 蒸发，请小心用封口膜关闭板的盖子，如果进行了 EdU 合并，请保留板在黑暗中。

H. Edu 检测和免疫荧光

注意：对于免疫荧光分析，每 2 ml 试管中转移大约 50 根肌纤维健康）状况。

1. 用 FBS 涂覆 2 ml 试管/每个样品（如步骤 A3 中所述）。

2. 在显微镜下，尽可能多地去除上清液，然后挑出单个肌纤维（在肌纤维的方向）带有涂层的 P200 微量移液器尖端并转移它们到 2 ml 涂层管的底部。

注意：移取肌纤维时，请务必在微量移液器尖端涂上 FBS 以防止肌纤维丢失或中断（它们往往附着在无涂层管或尖端的侧面）。

3. 让纤维沉淀到管底 10 分钟，然后去除上清液。将肌纤维留在不少于 150 μl 的 PBS 中。

提示：将体积与另一个装有 150 μl 水的 2 ml 试管进行比较是一个很好的技巧。

4. 每管加入 500 μl Triton 0.5%，室温孵育 10 分钟。

5. 去除上清液，用 1 ml PBS 洗涤 10 分钟。

6.对于 EdU 检测，使用 Click-iT EdU Alexa Fluor 594 HCS 检测对肌纤维进行染色

(Invitrogen):

一种。稀释 10× 溶液（Click-iT EdU 缓冲添加剂组分 E 10× 和 Click-iT 反应试剂盒中提供的缓冲液组分 C 10×) 10 倍至 1×，加入适当体积的水（例如，50 μl E 10x + 450 μl 水）。

湾然后准备 Click-iT 反应混合物，混合 425 μl 组分 C 溶液 1×，20 μl CuSO₄、1.25 μl Alexa Fluor azide 和 50 μl 组分 E 溶液 1× 以获得~500 μl 的混合物。

注意：试剂应按此指定顺序添加到混合物中。

C。然后为每个待染色的纤维样品加入 200 μl 鸡尾酒混合物。孵育 30 分钟在室温下变暗，然后用 200 μl 反应漂洗缓冲液洗涤成套工具。

笔记：

I．在标准免疫荧光之前执行 EdU 检测分析。

ii. 如果您进行EdU检测，免疫荧光的所有步骤都应该是

在黑暗中进行。

7. 去除上清液，用 1 ml PBS 洗涤 10 分钟。

8. 去除上清液并加入 1 ml 封闭液（PBS 中的 10% FBS）。离开 1 小时室温，最好在摇床上缓慢搅拌。

9. 让试管在垂直位置静置 10 分钟，然后去除上清液，留下约 150 μl 中的肌纤维。添加在 PBS 中的 10% FBS 中稀释的一抗（Ki67 在 1:100 和Pax7 在 1:10）。最终体积不应小于 300 μl。将试管孵育过夜 (13-14 小时）在 4°C。

提示：在准备与抗体的混合物时，我们建议计算所需的最终体积的抗体浓度，但在混合物中加入 150 μl 少 10% 的 FBS（这个体积已经存在于带有肌纤维的管中）。

10. 去除上清液，用 1 ml 0.1% FBS 的 PBS 溶液洗涤两次，每次 10 分钟。

11. 去除上清液，留下约 150 μl 的肌纤维。添加稀释的二抗PBS 中 10% FBS（Alexa Fluor 488 和 594，均为 1:250）。最终体积不应小于 300 μl。在室温下避光孵育 1 小时。

12. 去除上清液，用 1 ml 0.1% FBS 的 PBS 溶液洗涤 10 分钟。

13. 去除上清液，用 1 ml PBS 洗涤 10 分钟。

14. 加入 500-800 μl DAPI（1:10,000 在 PBS 中）并在室温下孵育 10 分钟。

15. 去除上清液，用 1 ml 0.1% FBS 的 PBS 洗涤两次。

16. 通过去除所有上清液并留下肌纤维，将纤维安装在盖玻片上体积尽可能小。

17. 加入 5-10 μl 甘油：PBS。用剪刀剪下一小块 P200 微量移液器的尖端并涂上 FBS。用它轻轻地从 2 ml 试管底部取出肌纤维，然后将它们放在玻璃盖上，一滴一滴，横跨载玻片的中心。

注意：这是一个关键步骤，所以小心不要丢弃可能仍然附着在小费。在丢弃之前检查吸头内含物，对照吸头的来源查看吸头内部光。如有必要，移取更多甘油：PBS。

提示：

一种。在这个阶段可以看到载玻片上的肌纤维。湾检查 2 毫升试管的底部，在光源下通过它查看以确保没有剩下的肌纤维了。

18. 用矩形盖玻片小心地关闭盖玻片。

19. 让安装好的光纤在黑暗中干燥，然后用指甲油密封玻璃盖板的两侧。

20. 荧光显微镜图像（图 4）。

注：建议使用 40× 或 63× 物镜来可视化卫星细胞簇和 10×或整个肌纤维的 20 倍物镜。

图 4. 使用我们的协议获得的免疫荧光图像示例。

一种。在培养中保存的单个肌纤维上进行的免疫荧光的代表性图像96 小时。Ki67，增殖标记（绿色）和 Pax7，卫星细胞特异性标记（红色）。B.在培养 96 小时和24 小时教育脉冲。DAPI（蓝色）用于可视化细胞核。

数据分析

单肌纤维免疫荧光和 EdU 检测获得的数据可用于执行不同的分析，这取决于正在解决的生物学问题。例如，我们想了解 LncRewind 在激活和卫星细胞的增殖（Cipriano等人，2021 年），因此我们与 Pax7 进行了共染色，单个肌纤维上的卫星细胞特异性标记物和增殖标记物 Ki67从五只小鼠中分离出来。为了获得统计上显着的结果，我们建议量化至少 50每个条件下的纤维，从至少三只小鼠中分离。排除短的和断裂的肌纤维从分析。对于统计分析，应用非配对牛逼比较两个条件时-tests和当比较两个以上的条件时，单向方差分析与 Tukey 的多重比较测试。我们使用这些数据来执行不同的分析：

1. 我们在显微镜下对 Pax7 +细胞的数量进行了人工计数和Pax7 + Ki67 +每簇双阳性细胞，比较不同组间的结果条件（对照与 KD）。对于统计分析，我们比较了每个条件 40 个集群。

2.我们还计算了簇的平均数[由许多原子核(n)> 2组成]，成对(n = 2) 或单个 Pax7 + (n = 1) 细胞/纤维。为了进行统计分析，我们比较了 80 种纤维每个条件。

3. 我们还比较了对照和 KD 之间每根纤维的 Pax7 +细胞总数。在这在这种情况下，我们使用每个条件 50 根纤维的数据进行统计分析。

笔记

1、即使是同性别同龄小鼠，不同小鼠之间也存在很大的变异性。

2. 我们每次实验收集的肌纤维平均数量约为每只小鼠 100 个，来自两个 EDL 肌肉，但大约 20% 在培养过程中无法存活。

3. 我们还注意到一次用三只以上的老鼠执行这个程序可以有害，因为分离后的清洁步骤应迅速进行以避免纤维收缩。

4. 我们还对腓肠肌进行了肌纤维分离，将其分为四部分纵向件。然而，在我们手中，结果更干净，肌纤维更干净只用 EDL 肌肉就更强壮了。我们发现 EDL 肌肉非常适合用于此

程序，因为它的小尺寸允许整个肌肉的消化，而无需可能导致肌纤维损伤的手动研磨。

食谱

1. 消化液（每只小鼠 2 ml）胶原酶 I 10 毫克

DMEM 高葡萄糖 + 丙酮酸盐 (Gibco) 2 毫升

笔/链球菌 100×20 μl

注意力：

i.胶原酶 I 的数量和状态对于此过程的成功至关重要

ii. 始终将胶原酶 I 和溶液放在冰上。当使用带有荧光的小鼠时

报告基因，我们建议将此解决方案保持在黑暗中。

一种。非常仔细地测量胶原酶 I 的量。

湾将其放入 50 毫升管中。在无菌环境中，加入培养基和抗生素并涡旋

小心直到胶原酶 I 完全溶解。

C。将溶液通过 0.22 μm 过滤器和 50 ml 注射器过滤到新的 50 ml 管中。

提示：在过滤步骤中可能会损失一些体积，因此最好从更大的体积。

2. 洗涤液（50 毫升）

DMEM 高葡萄糖 + 丙酮酸盐 (Gibco) 45 毫升

马血清 10% 5 毫升

混合配料

使用前，将溶液预热至 37°C

注意：确保溶液是无菌的。

提示：如果要转染纤维，我们建议不要在此溶液中添加任何抗生素，因为它们会干扰转染效率。

3. 纤维生长培养基

DMEM 高葡萄糖 + 丙酮酸盐 (Gibco)，39.5 毫升

胎牛血清 20%，10 毫升

FGF 2.5 纳克/毫升

鸡胚提取物 (CEE) 1%，500 μl

混合成分并通过 0.22 μm 过滤器和 50 ml 注射器将它们过滤到新的 50毫升管。

使用前，将溶液预热至 37°C。

注意：确保溶液是无菌的。

提示：如果要转染纤维，我们建议不要在此溶液中添加任何抗生素，因为它们会干扰转染效率。

4.中频解决方案

PFA 4% PBS

一种。将 4 g 多聚甲醛粉末溶解在 100 ml PBS 中。湾将溶液加热至 65°C，直至多聚甲醛完全溶解。

C.在 -20°C 下储存 10 ml 等分试样。

Triton 100×0.5% PBS

将 50 μl Triton 与 9.95 ml PBS 混合

FBS 10% PBS

将 5 ml FBS 与 45 ml PBS 混合

FBS 0.1% 毫升 PBS

将 50 μl FBS 与 50 ml PBS 混合

甘油：PBS 3:1

将 3 ml 甘油与 1 ml PBS 混合

致谢

这项工作得到了意大利大学和研究部（SIR，Scientific青年研究员的独立性 n。RBSI14QMG0)，意大利癌症研究协会（AIRC；MyFIRST grant n.18993）、AFM-Telethon 和 CNCCS（国家化学品收集化合物和筛选中心）。Sapienza University (prot. RM120172B7D32C04 和RM11916B7A39DCE5) 和 POR FESR Lazio 2020-T0002E0001 到 MB。插图已经在付费订阅下创建 biorender.com.该协议改编自 Cipriano等人。（2021 年；DOI：10.7554/eLife.54782）。

利益争夺

作者声明不存在竞争利益。

伦理

动物实验：对于本研究中描述的实验，C57BL/10 野生型小鼠是使用，并将在雄性和雌性小鼠中观察到的差异包括在实验。在住房、营养和护理方面，动物按照良好实验室规范 (GLP) 指南。所有实验方案均获得批准并符合监管标准（Protocol N° 7FF2C.4–Authorization N° 746/2016-PR，Cipriano等人。电子生活 2021；10：e54782。DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.54782 20 of 25 Research文章细胞生物学）。所有动物都饲养在至少有五只动物的动物笼子里，每温度为 22°C ± 3°C，湿度在 50% 至 60% 之间。

参考

1. Ballarino, M., Cazzella, V., D'Andrea, D., Grassi, L., Bisceglie, L., Cipriano, A., Santini, T.,

Pinnaro, C.、Morlando, M.、Tramontano, A.等。(2015)。新型长链非编码 RNA (lncRNA)

在肌生成中：一个 miR-31 重叠的 lncRNA 转录本控制着成肌细胞的分化。摩尔

细胞生物学35(4)：728-736。

2. Ballarino, M., Cipriano, A., Tita, R., Santini, T., Desideri, F., Morlando, M., Colantoni, A., Carrieri,C.、Nicoletti, C.、Musaro, A.等。(2018)。核长链非编码 RNA Charme 的缺陷

导致小鼠的肌源性缺陷和心脏重塑。EMBO J 37(18): e99697。

3. Biferali, B. 和 Mozzetta, C. (2019)。骨骼肌干细胞的表观遗传调控肌肉再生和疾病。（第 13 章）在：表观遗传学和再生。爱思唯尔：309-332。

4. Cai, L., Chang, H., Fang, Y. 和 Li, G. (2016)。功能的全面表征 LincRNAs 通过长程染色质相互作用进行转录调控。 科学代表6：36572。

5. Cipriano, A., Macino, M., Buonaiuto, G., Santini, T., Biferali, B., Peruzzi, G., Colantoni, A.,

Mozzetta, C. 和 Ballarino, M. (2021)。 Wnt7b 表达的表观遗传调控在肌肉干细胞中作用长链非编码 RNA Lnc-Rewind。Elife 10：e54782。

6. Desideri, F., Cipriano, A., Petrezselyova, S., Buonaiuto, G., Santini, T., Kasparek, P., Prochazka,

J.、Janson, G.、Paiardini, A.、Calicchio, A.等。(2020)。内含子行列式坐标通过与 MATR3 和 PTBP1 的相互作用迷人的 lncRNA 核活性。细胞代表33（12）：108548。

7. Fatica, A. 和 Bozzoni, I. (2014)。长链非编码 RNA：细胞分化的新参与者发展。N at Rev Genet 15(1): 7-21。

8. Lu, L., Sun, K., Chen, X., Zhao, Y., Wang, L., Zhou, L., Sun, H. 和 Wang, H. (2013)。基因组-ChIP-seq 的广泛调查揭示了 lincRNAs 在骨骼肌生成中的 YY1 调节。恩博J32（19）：2575-2588。

9. Mauro, A. (1961)。骨骼肌纤维的卫星细胞。 J Biophys Biochem Cytol 9：493-495。

10. 莫泽塔，C.（2016 年）。肌肉干细胞的分离和培养。 方法 Mol Biol 1480: 311-

322.

11. Pasut, A.、Jones, AE 和 Rudnicki, MA (2013)。单个肌纤维的分离和培养

以及它们来自成人骨骼肌的卫星细胞。J Vis Exp (73)：e50074。

12. Pegoli, G.、Lucini, F.、Mozzetta, C. 和 Lanzuolo, C. (2020)。单肌纤维隔离和

产后早期 Emery-Dreifuss 肌营养不良症小鼠模型的培养发展。J Vis Exp (161)。doi：10.3791/61516。

13. Quan, M., Chen, J. 和 Zhang, D. (2015)。探索长非编码 RNA 的秘密。 国际J分子科学16(3)：5467-5496。

14. Rinn, JL 和 Chang, HY (2012)。长非编码 RNA 的基因组调控。年会生物化学81：145-166.

15. Zhu, M., Liu, J., Xiao, J., Yang, L., Cai, M., Shen, H., Chen, X., Ma, Y., Hu, S., Wang, Z 。，等人。(2017)。Lnc-mg 是一种长链非编码 RNA，可促进肌生成。国家通讯社 8：14718。