材料和试剂

用于 LHCII 蛋白分离
2 × 250 ml 玻璃烧杯（在冰上冷却）
8 ×厚壁玻璃离心管以保持低温（在冰上冷却）
3 × 150 ml 玻璃烧杯（带磁力搅拌棒）
4 × 50 ml 量筒
2 × 100 ml 量筒
6 × SS34 转子管（在冰上冷却）
6 × SW28 转子管（在冰上冷却）
2 ×纱布（网眼尺寸 20 μm) (10 × 10 cm) 带有用于 250 ml 烧杯的漏斗
软漆刷
2 × 带盖冰桶（保持样品黑暗）
带搅拌棒的磁力搅拌器
标准玻璃试管
20 毫升玻璃移液管
1.5 毫升 Eppendorf ®杯子
80% 丙酮
固体氯化钾盐
原液（见配方）
解决方案 A（见食谱）
解决方案 B（见食谱）
解决方案NET（见食谱）
解决方案 SE（见食谱）
解决方案 S（见食谱）
0.1 M 和 1 M HCl（见配方）
溶液 KCl（见配方）

用于制备蛋白脂质体
溶解在氯仿中的分离的类囊体膜脂。在 -20°C 下储存在带有 Teflon ®密封盖的小玻璃瓶中，以尽量减少蒸发。脂质可以从 Avanti ® Polar Lipids ( Alabaster, Alabama, USA) 购买，也可以从叶子中分离。关于类囊体脂质的分离，参见 Hara 和Radin (1978)，进一步纯化描述于 Kotapati和 Bates ( 2020)。脂质浓度：单半乳糖二酰基甘油 (MGDG)，70 mM；二半乳糖二酰基甘油（DGDG），30 mM；磺基奎诺糖基半乳糖二酰基甘油（SQDG），20 mM；和磷脂酰二酰基甘油 (PG) 20 mM
带盖冰桶
5 ml 带盖玻璃研磨管
200 nm 和 400 nm 13 mm（直径）核孔膜过滤器 (Whatman ® )
PETE 网状垫片 13 mm (Sterlitech ® )
3 毫升玻璃标准光谱仪玻璃比色皿（边长 1 厘米），带磁性微搅拌棒
带微型搅拌棒的磁力搅拌器（用于光谱仪玻璃比色皿）
Sephadex G-25 M PD10 凝胶过滤柱 (GE Healthcare ® ) 带馏分收集器，装有标准玻璃试管
氯仿
带调节器、软管和连接的巴斯德移液管的氮气罐
SM2 BioBeads (Bio-Rad ® )
带液氮的杜瓦瓶
用于液氮测量的玻璃管
过氧化氢酶牛肝（每毫克 10,000-40,000 单位，Sigma-Aldrich）
来自曲霉属的葡萄糖氧化酶（每毫升 550 单位，Sigma-Aldrich）
葡萄糖（200 mM，Sigma-Aldrich）
10 mM HEPES（见配方）
73.6 mM α-DM 溶解（见配方）

设备

LHCII 隔离
1 L Waring 商用搅拌机（Thermo Fisher Scientific）
pH计（梅特勒托利多，SevenEasy）
带搅拌器的梯度混合器（自制）
Eppendorf 台式离心机 5810
Sorvall RC 5CPlus 离心机，配备 SS34 转子（预冷至 4°C）
贝克曼 L8-70M 超速离心机，带摆斗 SW28 转子（预冷至 4°C）

蛋白脂质体
带温度计的 250 毫升玻璃烧杯
高压挤出机（Lipex ®挤出机），需要 N 2气体
带调节器的氮气罐连接到挤出机
紫外可见分光光度计（U-3900 分光光度计（Hitachi ® ））
带有液氮杜瓦瓶组件的荧光光谱仪（Fluromax-4 荧光光谱仪（Horiba ® ））。
转子蒸发器 (Büchli ® Rotavapor R) 带加热水浴，玻璃研磨，连接 5 ml 玻璃管和 N 2气体通风
馏分收集器（Gilson ® FC 205）
烤箱（设置为 60°C）（Fisher Scientific ® ，目录号：3510S）

程序

光捕获复合物 II (LHCII) 的分离
注意：如果没有说明，所有步骤都应使用预冷的材料完成，如果可能，请在寒冷的房间和昏暗的光线下进行。
叶绿体分离
从适应黑暗的植物（夜间结束或在黑暗中数小时）收获大约 200 克菠菜（或其他植物物种）的叶子材料，并去除中脉和茎。
这种材料（〜100克）220 ml溶液A（的一半均化配方A2 ）与Waring混合器，通过过滤器20 μ米网眼大小纱布，并收集在250ml烧杯中。
将悬浮液均匀分布在四个预冷（冰上）玻璃离心管上，并用台式离心机以 3,200 × g 的速度旋转 5 分钟。
弃去上清液后，用油漆刷小心地将四个颗粒重新悬浮在每个离心管中的16 ml 溶液 B（配方 A3 ）中，将四个悬浮液混合在一起，并保持在冰上。
使用新鲜的烧杯和离心管，用叶子材料的后半部分 (~100 g) 重复步骤 A1a 到 A1d。汇集两批并均匀分布在四个离心玻璃管上。
使用预冷 (4 °C ) 台式离心机以 3,200 × g旋转 7 分钟。
渗透休克治疗
弃去上清液后，用软漆刷将四个颗粒重新悬浮在每个玻璃管中的30 ml NET（配方 A4）溶液中。
将四个悬浮液汇集在 150 毫升烧杯中，并在 4 °C （冷室）的昏暗光线下缓慢搅拌 45 分钟。
将悬浮液平均分配到四个玻璃管中，并使用台式离心机以 3,200 × g 的速度旋转 7 分钟。
用油漆刷在每玻璃管 30 ml 溶液 NET 中再次将四个颗粒均质化，然后重复步骤 A2b 和 A2c。
类囊体膜的解叠
将每个玻璃管中的颗粒在 30 ml 溶液 SE（配方 A5）中均质化，并在 150 ml 烧杯中汇集。
搅拌悬浮液并将 pH 值调至 6，先用 1 M HCl，然后在室温下用 0.1 M HCl。
在室温下继续搅拌 15 分钟。
将悬浮液平均分配到四个 SS34（或类似）转子离心管中。
使用 Sorvall 离心机以 24,000 × g离心15 分钟。
洗涤剂处理
弃去上清液后，将沉淀重悬在总共 30 ml 的 S 溶液中（配方 A6），然后将 S 溶液的体积调整至 50 ml。
根据 Porra等人的说法，用光谱法测量以毫克为单位的总叶绿素含量。(1989) 通过在 Eppendorf 杯中将 50 μl悬浮液与 2 ml 80% 丙酮（涡旋）混合。
将悬浮液均匀分布在两个新鲜的 SS34 离心管上，并用 Sorvall 离心机以 40,000 × g 的速度旋转 20 分钟。
在室温下，将颗粒重悬在纯 H 2 O 中，其体积由叶绿素含量决定：ml H 2 O = 2 × mg 叶绿素（测量）。最终叶绿素浓度应为 0.5 mg/ml。转移到 150 毫升烧杯中。
缓慢搅拌悬浮液并缓慢加入（逐滴）Triton X-100 至最终浓度为 0.5% (v/v)：ml 添加的 Triton X-100 = ml H 2 O × 0.005。
在黑暗中在室温下缓慢搅拌孵育 30 分钟。
蔗糖梯度超速离心
用 30 ml 蔗糖密度梯度（0.1 到 1 M）取六个准备好的管。
将悬浮液均匀地覆盖在六个管上（每管约 6 毫升）（见注 1）。
准备摆斗 SW28 转子。
以 100,000 × g旋转 16 小时（过夜）。
第二天，用玻璃移液管小心地收获 LHCII 带，即梯度中的中间带（深绿色）。
用 50 ml 量筒确定混合悬浮液的体积。
根据 Porra等人确定叶绿素浓度。(1989)，如上所述。
KCl-处理
将悬浮液转移到 150 毫升烧杯中并缓慢搅拌。
缓慢加入 KCl 晶体，直到达到 300 mM 的最终浓度。
在 4 °C （冷室）搅拌 30 分钟。
将悬浮液平均分配到两个 SS34 离心管中，并以 40,000 × g旋转15 分钟。
在总共 50 ml 溶液 KCl 中重新悬浮颗粒。
将悬浮液再次均匀分配到两个 SS34 离心管中，并以 40,000 × g旋转15 分钟。
重复步骤 A6e 和 A6f。
用几毫升（1-2 毫升）纯水将每个颗粒重新悬浮，然后将它们混合。根据 Porra等人确定总体积和叶绿素浓度。(1989) 通过在 2 ml 80% 丙酮中使用 20 μl悬浮液。
旋转 40,000 × g 15 分钟。
将沉淀重悬在 0.35% Triton X-100 溶液中，使最终叶绿素浓度为 2 mM。
低速离心去除气泡。将分离的 LHCII（每等份50 μl ）分装到 Eppendorf 杯中。在液氮中快速冷冻样品，并将分离的 LHCII 储存在 -80 °C （见注 2）。

LHCII-proteoliposomes 的制备
大单层囊泡 (LUV) 的制备
根据制造商手册组装具有 400 nm 过滤器的 Lipex ®挤出机并在烘箱中预热至 60°C。
用热水填充 250 毫升烧杯 ¾。
将旋转蒸发仪的水浴加热至 50°C。
将所需的脂质溶液（溶解在氯仿中）混合在 5 ml 玻璃研磨管中，脂质总量为 2.4 μmol。典型的混合物是 MGDG (25 mol%)、DGDG (48 mol%)、PG (15 mol%) 和 SQDG (12 mol%)。
通过加入冷水并使用温度计将 250 毫升烧杯中的水温调节至 ~40°C。
将装有脂质混合物的玻璃管置于 250 毫升烧杯中。在氮气下小心地蒸发氯仿（不要飞溅），直到它看起来干燥。
将 5 ml 玻璃研磨管与干燥的脂质膜连接起来，旋转蒸发，开始旋转，激活真空，并将管子 ~¼ 放入 50°C 水浴中。用转子蒸发器蒸发剩余的溶剂 15 分钟。关闭蒸发器和转子并通过用 N 2气代替真空来释放真空。从旋转蒸发器中取出 5 毫升玻璃管并盖上盖子。
将 1.2 ml HEPES 缓冲液添加到 1.5 ml Eppendorf 杯中，并用 N 2气体轻轻鼓泡 1 分钟以降低氧气浓度。
将 700 ml 的 10 mM HEPES 缓冲液（之前用 N 2气鼓泡）加入干燥的脂质膜并彻底涡旋直至脂质膜完全溶解。溶液看起来应该是乳白色的。
将预热的 Lipex ®挤出机 (60°C) 连接到氮气罐。填充脂质乳液并等待 30 秒（乳液加热至挤出机温度）。将脂质乳液挤出 10 次。最后挤出后，加入剩余的 300 μl N 2气泡 HEPES 缓冲液，以从挤出机中冲洗出剩余的脂质体。用 200 nm 过滤器替换 400 nm 过滤器。像以前一样再挤出 10 次。在 Eppendorf 杯中收集 LUV，并将 LUV 储存在 4°C。
LUVs 中 LHCII 的重建（LHCII-蛋白脂质体）
将含有 LHCII 蛋白的样品保存在黑暗中（暗盖）。
允许冷冻的 LHCII 等分试样在黑暗中的冰上缓慢解冻（带盖的冰桶）。解冻可能需要 30-60 分钟。
溶解和稀释 LHCII 制剂（按此顺序）：在 Eppendorf 杯中，将 HEPES 缓冲液、500 μM α-DM（原液 73.6 mM）和 LHCII（最终叶绿素浓度 25 μM）混合至总体积为 220 μl。在黑暗中将稀释的 LHCII 保持在冰上，直到在步骤 B2e 中使用。
混合去污剂-脂质体：在带有微型搅拌棒的 3 毫升光谱仪玻璃比色皿中，加入总 LUV 样品并用 HEPES 缓冲液填充至总体积为 1.6 毫升。缓慢搅拌溶液并加入 20 μl 73.6 mM α-DM 至终浓度为 920 μM α-DM （见注 3）。搅拌 5 分钟。
将 200 μl 稀释的 LHCII 溶液缓慢添加到搅拌的洗涤剂-脂质体悬浮液（叶绿素终浓度 2.8 μM）中，并在黑暗中孵育 30 分钟。
添加 25 mg 湿 Biobeads，并在室温下在黑暗中继续搅拌 60 分钟。
再加入 100 毫克湿 Biobeads，并在室温下在黑暗中继续搅拌 25 分钟。
将 BioBead-蛋白脂质体悬浮液转移到新鲜的 Eppendorf 杯中（尽量减少 BioBeads 的转移），并在 4°C 下以 18,000 × g旋转 20 分钟。小心收集上清液并转移到新的 Eppendorf 杯中。
最后，通过凝胶过滤与用 10 mM HEPES 缓冲液平衡的 Sephadex G-25 M PD10 凝胶过滤柱进一步纯化 LHCII-proteoliposomes。每隔 30 秒用装有玻璃试管的馏分收集器收集样品。收集并合并作为最终 LHCII 蛋白脂质体制剂的淡绿色样品，转移到 Eppendorf 杯中，并在黑暗中储存在冰上。
确定脂质和蛋白质含量
脂质含量可以通过脂质提取物的二维薄层色谱法测量，如 Kirchhoff等人所述。(2018)。
根据 Porra等人的说法，蛋白质含量可以从 80% 丙酮提取物的光谱叶绿素定量中确定。(1989)。对于 80% 丙酮提取物，使用 100 μl 样品并用 400 μl 100% 丙酮稀释。根据 Porra等人，计算以 nmol/ml 为单位的总叶绿素浓度。(1989)。使用可以处理 500 μl 样品的合适的光谱仪比色皿。为了从总叶绿素计算 LHCII 三聚体浓度，假设总叶绿素与 LHCII 三聚体的比率为 42:1（Barros 和Kühlbrandt，2009）。
低温 (77 K) 荧光光谱表征（参见 Tietz等人，2020 年）
准备荧光光谱仪在 640 和 800 nm 之间进行发射扫描，激发波长为 475 nm，光学带宽为 4 nm。
小心地用液氮填充杜瓦瓶（戴防护眼镜）。
通过小心移取 346 μl LHCII-蛋白脂质体、2 μl 过氧化氢酶、2 μl 葡萄糖氧化酶和 10 μl 葡萄糖，在 Eppendorf 杯中混合；等待 5 分钟以建立厌氧条件（见注 4）。
将样品转移到 77 K 样品管中，并通过浸入充满液体 N 2 的杜瓦瓶（戴防护眼镜）小心冷冻。将冷冻样品非常缓慢地放入 77 K 杜瓦瓶中的 77 K 样品管中（如果移入太快，样品管会破裂）。如果需要，调整荧光计光束中的试管位置。
记录并平均四次排放扫描。

笔记

剩余的悬浮液可以在液氮中冷冻冷冻，并储存在 -80°C 下进行另一次超速离心。
LHCII 是一种非常稳定的蛋白质，可以在 -80°C 下储存数月。解冻的等分试样可以多次快速冷冻。
由于 LHCII 并入 LUV 的一些可变性，可能需要调整洗涤剂浓度。这可以根据低温荧光光谱来判断。如果看到显着的 LHCII 聚集（700 nm 处的肩部），则应增加洗涤剂浓度（例如，增加 10%）。见 Tietz等人。(2020) 了解详情。如果游离 LHCII 可见（发射波长为 650 nm，激发波长为 475 nm），则应降低洗涤剂浓度（例如，降低 10%）。
厌氧条件最大限度地减少了活性氧产生的损害，这会在荧光测定过程中严重导致荧光光谱失真。

食谱

LHCII 分离
原液
1 mM MgCl 2 + 1 mM MnCl 2 + 0.5 mM KH 2 PO 4 + 10 mM KCl + 2 mM EDTA + 330 mM 山梨糖醇，溶于 2 L 超纯水中。
方案一
1 L 储备溶液中的 25 mM MES + 40 mM KCl。将 pH 值调整为 6.1 (KOH)
方案B
25 mM HEPES 在 200 ml 原液中。调节至 pH 6.7 (KOH)
解决方案网
500 ml 超纯水中的 10 mM KCl + 1 mM Tricin + 5 mM EDTA。调节至 pH 7.8 (KOH)
解决方案 SE
250 毫升超纯水中的 100 mM 山梨糖醇 + 5 mM EDTA。调节至 pH 值约 7 (KOH)
解决方案
200 毫升超纯水中的 100 mM 山梨糖醇。无需调节 pH
0.1 M 和 1 M HCl
蔗糖梯度（带梯度混合器）0.1 M 至 1 M 蔗糖；6 管：
100 ml 0.1 M 蔗糖 + 0.05% Triton X-100（新鲜添加）
100 ml 1 M 蔗糖 + 0.05% Triton X-100（新鲜添加）
氯化钾溶液
200 毫升超纯水中的 100 mM KCl。无需调节 pH

LHCII蛋白脂质体制备
20 ml 10 mM HEPES 在超纯水中。调节至 pH 6.7 (KOH)
73.6 mM α-DM 溶解在 HEPES 缓冲液中

致谢

这项工作得到了美国能源部 (DE-SC0017160)、国家科学基金会 (MCB-1953570) 和 USDA-NIFA (#1005351 和 #0119) 的资助。该协议源自 Tietz等人。（2020 年；doi：10.1074/jbc.RA119.011707）。

利益争夺

通讯作者声明没有竞争利益。

参考

Anishkin, A.、Loukin, SH、Teng, J. 和 Kung, C.（2014 年）。感受脂双层中隐藏的机械力是一种原始的感觉。Proc Natl Acad Sci USA 111：7898-7905。
Barros, T. 和Kühlbrandt, W. (2009)。植物光捕获复合物 II 的结晶、结构和功能。Biochim Biophys Acta 1787：753-772。
Boudiere, L., Michaud, M., Petroutsos, D., Rebeille, F., Falconet, D., Bastien, O., Roy, S., Finazzi, G., Rolland, N., Jouhet, J., Block, MA 和 Marechal, E. (2014)。光合作用中的甘油脂：组成、合成和运输。Biochim Biophys Acta 1837：470-480。
康托尔，RS (1997)。细胞膜中的侧向压力分布：调节蛋白质功能的机制。J Phys Chem B 101：1723-1725。
Crisafi, E. 和 Pandit, A. (2017)。分解控制光合光收集中分子开关的蛋白质和脂质相互作用。Biochm Biophys Acta 1859：40-47。
Hara, A. 和 Radin, NS (1978)。用低毒溶剂提取组织的脂质。分析生物化学90：420-426。
Kirchhoff, H. 和 Yarbrough, R.（2018 年）。评估脂质和膜以研究光合超组织。在：分子生物学方法。Covshoff, S. (Ed.)。1770 年，斯普林格出版社，305-316。
Kotapati, HK 和 Bates, PD (2020)。用于结合分离极性和中性脂质类别并应用于脂质代谢通量的正相 HPLC 方法。J Chromatogr B 分析技术生物医学生命科学1145：122099。
McDonnel, A. 和 Staehelin, LA (1980)。由从叶绿体膜分离的叶绿素 a/b 光捕获复合物介导的脂质体之间的粘附。J Cell Biol 84：40-56。
Mondal, S.、Khelashvili, G. 和 Weinstein, H.（2014 年）。不仅仅是浮油：蛋白质-膜相互作用的能量学如何影响跨膜蛋白质的功能和组织。生物物理学杂志106：2305-2316。
Mourtisen, OG 和 Bloom, M. (1993)。膜中脂质-蛋白质相互作用的模型。Annu Rev Biophys Biomol 结构22：145-171。
Moya, I.、Silvestri, M.、Vallon, O.、Cinque, G. 和 Bassi, R. (2001)。洗涤剂胶束和脂质体中光系统 II 天线蛋白的时间分辨荧光分析。生物化学40：12552-12661。
Natali, A.、Gruber, JM、Dietzel, L.、Stuart, MCA、van Grondelle, R. 和 Croce, R.（2016 年）。光捕获复合物 (LHC) 在膜环境中自发聚集，导致其激发态寿命缩短。J 生物化学291：16730-16739。
波拉，RJ (1989)。测定用四种不同溶剂提取的叶绿素 a 和 b 的准确消光系数和联立方程：通过原子吸收光谱法验证叶绿素标准品的浓度 Biochim。生物物理学报975：384-394
Rigaud, JL 和 Levy, D. (2003)。将膜蛋白重构为脂质体。方法 Enzymol 372：65-86。
Rigaud, JL, Pitard, B., Levy, D. (1995)。将膜蛋白重构为脂质体：在能量转导膜蛋白中的应用。Biochim Biophys Acta 1231：223-246。
Tietz, S., Leuenberger, M., Höhner, R., Olson, AH, Fleming, GR, Kirchhoff, H. (2020)。基于蛋白脂质体的系统揭示了脂质如何控制光合光收集。J Biol Chem 295：1857-1866。
van den Brinck-van der Laan, E., Killian, JA 和 de Kruijff, B. (2004)。非双层脂质通过横向压力分布的变化影响外周和完整的膜蛋白。Biochim Biophys Acta 1666：275-288。
Yang, C.、Boggasch, S.、Haase, W. 和 Paulsen, H.（2006 年）。三聚体捕光叶绿素 a/b (LHCIIb) 在类囊体脂质脂质体中的热稳定性。Biochim Biophys Acta 1757：1642-1648。

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