材料和试剂

12 mm 直径盖玻片（Chemglass Life Science，目录号：CLS-1760-012）
24孔培养板（Geiner生物一，细胞星® ，目录号：662-160）
移液器吸头
带灯丝的硼硅酸盐玻璃移液器（Sutter Instrument，目录号：BF150-75-10）
Lipofectamine LTX（Thermo Fisher Scientific，目录号：15338100）
Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）（Life Technologies，Gibco ® ，目录号：11965-092）
青霉素-链霉亲和素（Life Technologies，Gibco ® ，目录号：15140-122）
胎牛血清（GEMINI，目录号：900-108）
OPTI-MEM（Life Technologies，Gibco ® ，目录号：31985-070）
0.25% 胰蛋白酶-EDTA（1×）（Life Technologies，Gibco ® ，目录号：25200-056）
氯化钠（NaCl）（Millipore Sigma，目录号：S9888-1KG）
氯化钾（KCl）（Millipore Sigma，目录号：P9333）
氯化钙（CaCl 2 ）（Millipore Sigma，目录号：C8106）
氯化镁（MgCl 2 ）（Millipore Sigma，目录号：M1028）
HEPES（Millipore Sigma，目录号：H3325-1KG）
甲磺酸钠（NaMES）（Millipore Sigma，目录号：302406-100G）
EGTA（Millipore Sigma，目录号：E3889）
D-甘露醇（Millipore Sigma，目录号：M4125-1KG）
NaOH（Millipore Sigma，目录号：655104-25G）
膜片钳的细胞外溶液（见配方）
膜片钳的细胞内溶液（见配方）

设备

倒置显微镜（卡尔蔡司，型号：Axiovert 200M ）
膜片钳室 (Warner, PI/PH1)
电容反馈探头 CV203BU（Molecular Devices）
微量移液器拉拔器（Sutter Instruments，型号：SU-P1000 ）
微锻（NARISHIGE 日本，型号：MF-830）
63 × 1.2 NA Water Lens ∞ /0.14-0.19 (Carl Zeiss, C-Apochromat)
放大器 Axopatch 200B（Molecular Devices）
Digidata 1550B（分子设备）
机械手（Sutter Instruments，型号：MPC-200）
蒸气压渗透计（Wescor，型号：5520）
盖玻片（Fisher Scientific，目录号：19804）
CO 2培养箱（Heraeus，型号：240）

软件

Origin8 (OriginLab, https://www.originlab.com )
夹具（Molecular Devices，https://www.moleculardevices.com）
Prism 10.0（GraphPad，https ://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ）
Clampex（Molecular Devices，https://www.moleculardevices.com）

程序

睫状膜片钳的移液器制造
运行斜坡测试以确定熔化单批玻璃移液管所需的热量水平。要运行斜坡测试，请在拉拔器屏幕上选择“斜坡测试”选项。当玻璃移液管熔化且拉杆分开时，斜坡测试的结果将自动确定。
定制程序以制造浴电阻为 18-26 MΩ 的移液器。我们设计了程序（表 1）并使用 Sutter 微量移液器拉拔器（假设坡道为 584）拉动移液器。

表 1. 使用BF150-75-10 硼硅玻璃的微量移液器程序。可以根据移液器的斜坡测试重新计算每个设置的数量。

拉动后，使用 microforge 仔细抛光移液器吸头。
抛光移液器后，将移液器放入腔室的浴液中。
确认移液器的浴阻 (18-26 M Ω )。移液器的浴阻会自动显示在 Clampex 程序中（图 1）。

图 1.用于膜片钳记录的 Clampex 软件。红框 1 显示移液器在浴模式下的电阻（浴电阻）。红框 2 表示可以选择进行电生理记录的记录按钮。在该图中，Clampex 软件以演示模式运行。

睫状膜片钳记录
在 24 孔培养板的盖玻片（直径 12 毫米）上接种 IMCD-3 细胞（细胞数：0.05 × 10 6 ）并加入 1 ml DMEM 培养基。
当细胞汇合率为 70-90% 时，使用 Lipofectamine LTX 按照制造商的说明，用编码 ADP-核糖基化因子样蛋白 13B-增强型绿色荧光蛋白（Caspary等人，2007 年）的 ARL 13B 基因作为纤毛标记物进行转染。
在 CO 2培养箱中孵育过夜。
第二天，用OPTI-MEM 替换培养基并孵育1-2 天，直到细胞数达到>0.24 × 10 6以诱导初级纤毛形成。
将盖玻片转移到膜片钳室，并通过在显微镜下检测绿色荧光标记的 ARL-13B 来确认细胞已形成初级纤毛（图 2B）。
使用机械手 (图 2B) 将硼硅酸盐移液器放入腔室, 并小心地将其放置在初级纤毛附近 (图 2B)。

图 2. 睫状膜片钳设置示意图。A. 睫状膜单通道膜片钳记录示意图。B. 膜片钳设置的完整视图。

将移液器置于纤毛尖端，并通过抽吸连接到电极的管子施加负压，以形成应在 8.0-32.0 千兆欧姆 (GΩ) 之间的 gigaseal。Giga-seal 的值会自动记录在 Clampex 软件中。
通过选择 Clampex 中的记录选项记录电流并丢弃在小于 8.0 千兆欧姆 (GΩ) 密封处获得的数据（图 1）。

数据分析

单通道分析（pClamp 10.2 和 Clampfit 10.0）
电导：选择从每个电压电位获得的记录，并使用传统的直方图绘制数据。常规直方图数据与下面的高斯函数拟合，用于单通道电导分析。

其中n是分量，A是幅度，μ是高斯均值，σ是高斯标准偏差。拟合高斯拟合后，从 μ2 中减去 μ1 并绘制每个电压电位的值。
单通道活动的开路概率：选择记录部分并使用以下等式计算开路概率：

其中To是通道呈现打开状态的总时间，T是总观察时间。如果补丁包含多个相同类型的通道，则P open计算公式为：

其中N表示补丁中的通道数。以下等式用于填充数据。

其中L表示通道开放的水平。通道开放的水平可以设置为单一幅度。在图 3C 中，顶部的红色虚线表示通道开口的水平。通道打开NPo的绝对概率由下式计算：

其中Tc表示总收盘价。

图 3. IMCD-3 细胞中的睫状膜片钳记录。A. 电极内 PC-1/2 单通道的图示。B. IMCD-3 细胞中睫状膜片钳记录的图像。C. 从 IMCD-3 细胞的初级纤毛获得的代表性单通道录音。红色虚线表示纤毛离子通道的打开 (O) 和关闭 (C) 状态。

食谱

膜片钳细胞外液
145 mM 氯化钠 (NaCl)
5 mM 氯化钾 (KCl)
2 mM 氯化钙 (CaCl 2 )
1 mM 氯化镁 (MgCl 2 )
10 毫米 HEPES
膜片钳细胞内溶液
90 mM 甲磺酸钠 (NaMES)
10 mM 氯化钠 (NaCl)
10 毫米 HEPES
5毫米EGTA
2 mM 氯化镁 (MgCl 2 )
100 nM 游离钙
使用 D-甘露醇将渗透压调节至 290 mOsm/Kg
使用 NaOH 将 pH 值调节至 7.4

致谢

这项工作得到了由韩国政府 (MSIT) (No.2019R1A6A3A03033302) (KH) 资助的国立卫生研究院 R01GM130908 (MD) 和韩国国家研究基金会 (NTF) 赠款的支持。该协议在 Ha等人的出版物中使用。（2020 年；DOI：10.7554/eLife.60684）。

利益争夺

作者声明不存在竞争利益。

参考

Caspary, T.、Larkins, CE 和 Anderson, KV (2007)。对 Sonic Hedgehog 的分级反应取决于纤毛结构。开发单元12(5)：767-778。
DeCaen, PG, Delling, M., Vien, TN 和 Clapham, DE (2013)。初级纤毛钙通道的直接记录和分子鉴定。自然504(7479)：315-318。
Delling, M., DeCaen, PG, Doerner, JF, Febvay, S. 和 Clapham, DE (2013)。初级纤毛是专门的钙信号细胞器。自然504(7479)：311-314。
Ha,K.、Nobuhara, M.、Wang, Q.、Walker, RV、Qian, F.、Schartner, C.、Cao, E. 和 Delling, M.（2020 年）。异聚 PC-1/PC-2 多囊蛋白复合物由 PC-1 N 端激活。Elife 9：e60684。
哈里斯，PC 和托雷斯，VE（2009 年）。多囊肾。Annu Rev Med 60：321-337。
Kleene, SJ 和 Kleene, NK (2017)。鼠肾初级纤毛的天然 TRPP2 依赖性通道。Am J Physiol 肾生理学312(1)：F96-f108。
Liu, X.、Vien, T.、Duan, J.、Sheu, SH、DeCaen, PG 和 Clapham, DE（2018 年）。Polycystin-2 是肾集合管上皮初级纤毛中必不可少的离子通道亚基。Elife 7：e33183。
Su, Q., Hu, F., Ge, X., Lei, J., Yu, S., Wang, T., Zhou, Q., Mei, C. 和 Shi, Y. (2018)。人 PKD1-PKD2 复合物的结构。科学361(6406)。
Torres, VE、Harris, PC 和 Pirson, Y. (2007)。常染色体显性多囊肾病。柳叶刀369(9569)：1287-1301。
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