材料和试剂

迷你培养皿，30 mm（Sigma-Aldrich，目录号：SLW1480/12D）
显微外科手术刀（Stab Knife，22.5 度，直；Sharpoint，目录号：72-2201）
玻璃微毛细管（50-μl 校准移液管；Drummond，目录号：2-000-050）
用于校准微毛细管口移液器的吸气管组件（Sigma-Aldrich，目录号：A5177-5EA）
注射器过滤器（0.2 μm；Pall Life Sciences，目录号：PN 4612）
Epredia TM PTFE 诊断载玻片，3 孔（Thermo Fisher Scientific，目录号：10632391）
Epredia TM PTFE 诊断载玻片，8 孔（Thermo Fisher Scientific，目录号：10727951）
动物：C57BL/6J 雌性小鼠（3-5 周龄）
来自怀孕母马血清的促性腺激素；PMSG（Sigma-Aldrich，目录号：G4877）
绒毛膜促性腺激素人; hCG（Sigma-Aldrich，目录号：CG10）
纤连蛋白 [Sigma-Aldrich，目录号：F1141-2MG（溶液；来自牛血浆）或 11051407001（粉末；来自人血浆）]
M2培养基（Sigma-Aldrich，目录号：M7167）
矿物油（Sigma-Aldrich，目录号：M8410）
PBS（Sigma-Aldrich，目录号：P4417）

设备

具有 12 小时光/暗循环、红灯选项和灯光计时器的动物房，允许研究人员改变灯光时间表以更符合正常工作时间
立体显微镜（尼康，型号：SMZ1270）

程序

发情期雌性小鼠的定时交配
对于定时交配，可以使用过度刺激（超排卵）或非刺激雌性小鼠。过度刺激程序增加了成功定时交配的机会。
超刺激：用腹腔 (ip) 5-IU 注射 PMSG超刺激雌性小鼠（最佳 22-24 天，但最多 35 天），然后在 PMSG 后 48 小时通过 5-IU ip 注射 hCG。计算两次注射的时间以在 hCG 注射后 12-14 小时开始定时交配。该协议可以根据动物库存提供者的建议进行修改（例如，杰克逊实验室；https://www.jax.org/）。
或者，发情周期可以通过检查阴道细胞涂片的洗涤液来确定，以提高定时交配的成功率。
Champlin等人详细描述了确定雌性小鼠发情周期的阶段。(1973) 和 Caligioni (2009)。
在 12 小时长黑暗周期（30 分钟至 1 小时）的最后一个黑暗小时，将雄性引入单笼中的雌性小鼠。处理小鼠交配时在红灯下工作，以免破坏光/暗循环。
光周期开始后立即检查阴道塞的存在（这次设置为性交后 1 小时）。可以在所需时间点（即，性交后 3 小时或 7 小时）使用带插头的女性进行实验。保存没有插头的雌性，因为它们可以用于另一次定时交配。
激素注射和交配时间应根据动物房的可用性和灵活的光/暗周期调整和实验者的时间表进行定制。以下示例基于实验者缺乏此类设施和灵活的时间表：在具有 12 小时光/暗循环的设施中，灯在早上 7 点开灯，晚上 7 点关灯，可以在第 1 天注射 PMSG下午 6 点，然后在第 3 天下午 6 点注射 hCG。在第 4 天早上 6 点（hCG 后 12 小时），开始在红灯下定时交配，通过将雄性引入雌性来不破坏光/暗循环。当早上 7 点灯亮时，雌性可以交配 2 小时。在接下来的 30 分钟左右，检查塞子并在上午 9:30-10:30 处牺牲被塞住的雌性，以便在性交后 3-4 小时或下午 4:30-5:30收集体内获能精子在性交后 7-8 小时体内精子获能。

体内获能精子的显微切割和分离
在精子留在女性生殖道内足够长的时间以允许体内获能后，通过 CO 2窒息或颈椎脱位，用确认的阴道塞处死雌性小鼠。
在光线充足的体视显微镜下，抓住卵巢周围的脂肪垫并轻轻拉伸，以清楚地识别卵巢和输卵管（第 1 行）以及输卵管和子宫（第 2行）之间的膜边界（图 1 ）。
小心地切开近端输卵管周围的膜，首先将输卵管稍微解开（第 2 行），然后是法氏囊周围的膜和漏斗外（第 1 行），最后切开 UTJ 外的子宫（第 1行） 3 ）（图1 ）。

图 1. 小鼠雌性生殖道解剖方案。从 Nagy (2003) 在操纵小鼠胚胎中稍微修改的绘图。

修剪后的女性生殖道（右）和体内获能精子的数量和分布（左）如图 2A 所示。
（可选）如果使用 Acr-EGFP 或 Su9-DsRed/Acr-EGF 小鼠，则可以在荧光显微镜下验证精子的分布和数量（图 2B ）。

图 2. 精子沿女性生殖道的分布。(AB) 从女性肠道的每个区域回收的精子数量，与描述的解剖女性肠道的实际示例图像对齐。比例尺，50 微米。(C) 用荧光显微镜验证峡部中 Acr-EGF 精子的位置和数量。

将单个修剪过的道放入矿物油下的 0.3 毫升 M2 介质液滴中（图 3A ），并用显微手术刀将它们进一步仔细解剖成壶腹、中峡部（2-3 毫米）和 UTJ 部分（图 3B ）。
立即将每个零件放入一个单独的 100-μl 在矿物油下的迷你培养皿中滴一滴 M2 培养基，轻轻按压以释放精子（图 3B ）。

图 3. 来自女性生殖道不同区域的精子的显微切割和抽吸。(A) 用显微外科手术刀解剖的输卵管放入 0.3 毫升 M2 液滴中。(B) 将单个输卵管部分放入 0.1 毫升 M2 液滴中。(C) 立体显微镜下观察和玻璃微毛细管采精。(D) 带有玻璃毛细管和过滤器的口吸移液器的设置。(E) 在额外转移/洗涤之前和之后，显微镜下液滴可见成分的示意图。

在（立体）显微镜下观察液滴（最好由三个人）（例如，10 分钟），并用连接到中间过滤器的抽吸器和 50 ul 玻璃微毛细管通过口移液挑选单个精子（图 3C 和 3D ）。
根据解剖和处理组织的速度，还会有其他细胞类型，例如排出的上皮细胞和红细胞 (RBC)，以及碎片和精子细胞 (图 3E )。由于精子细胞比这些体细胞小（细小碎片除外），通过避免这些污染物将液体转移到第二个液滴可以帮助获得富含精子细胞的制剂。

玻片准备
用纤连蛋白涂在载玻片的表面。(A) 方法 A 使用来自牛血浆的纤连蛋白溶液：从小瓶中直接取 50-100 µl 并多次点在表面上，制成具有所需大小的圆顶溶液。2-5 分钟后，当圆顶边缘即将干燥时，用水冲洗涂层溶液。载玻片/盖玻片已准备好用于下一步。方法 A 不需要额外的孵育时间。(B) 方法 B 从人血浆中的纤连蛋白粉末中制备新鲜的纤连蛋白溶液。通过在 37°C 下孵育 30 分钟，在无菌水中重新配制，以产生 1 mg/ml 的储备溶液。分装小份并在 -20°C 下冷冻直至使用。从等分试样中制备新鲜的工作溶液（水中 50 µg/ml），每孔加入 50 µl（3 孔载玻片）或每孔 10 µl（8 孔载玻片）。在潮湿的房间中孵育幻灯片/盖玻片约 1 小时。用水冲洗涂层溶液，并在精子沉积之前将载玻片保留在腔室中。涂层和精子沉积之间的时间应尽可能短。理想情况下，由于纤连蛋白的批次间差异，应测试整个过程以优化细胞附着并减少后续免疫荧光显微镜检查的背景。
将拾取的精子放入 10 µl PBS 液滴中，置于纤连蛋白涂层的 8 孔 Teflon 载玻片上（图 4A ：每个样本至少应获得 10 个精子）。如果微量移液器转移了过多的组织材料，则可以添加 PBS 洗涤步骤（图 3E ）。

图 4. 下游实验和示例图像的幻灯片准备。(A) 通过玻璃微移液器将精子转移到 8 孔 Teflon 微滴载玻片中。(B) 设置 3 孔 Teflon 涂抹幻灯片的示例。

将其余材料进行更精细的解剖，手动去除宏观碎片，将其余材料与 PBS（材料/PBS 1:10）混合，并将其涂抹在纤连蛋白涂层的 3 孔特氟龙幻灯片上（图 4B ：~每孔 30-50 µl）。

数据分析

获得的显微载玻片可以进行免疫荧光染色的经典程序，然后进行共聚焦或超分辨率成像。此处显示的是 Ded等人显示的用于 P-Tyr 量化的原始数据示例（图 4C ）。(2020) 来说明下游实验结果。

笔记

小鼠过度刺激和阴道涂片分析程序是复杂的通用协议，它们的详细描述可以在提供的参考资料/链接中找到。

致谢

该协议详细介绍了在 eLife 上发表的原始研究论文中报告的一种实验方法（Ded等人，2020 年；DOI：10.7554/eLife.62043）。这项工作得到了耶鲁大学医学院的启动资金、耶鲁古德曼-吉尔曼学者奖-2015 和 NIH (R01HD096745) 到 J-JC 的支持；由捷克科学基金会 (GACR No. GJ20-17403Y) 交给 LD；以及来自 ERDF 和生物技术研究所的 BIOCEV 项目 (CZ.1.05/1.1.00/02/0109)：86652036。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

本研究严格按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南中的建议进行。所有小鼠均按照耶鲁大学（协议编号：20079，2015 年至今）动物护理和使用委员会（IACUC）批准的指南进行治疗。

参考

奥斯汀，CR (1951)。对精子在哺乳动物卵子中的渗透的观察。 Aust J Sci Res B 4(4): 581-596。
Caligioni, CS (2009)。评估小鼠的生殖状态/阶段。Curr Protoc Neurosci 48：A.4I.1-A.4I.8。
Chang, MC (1951)。沉积在输卵管中的精子的受精能力。自然168（4277）：697-698。
Chung, JJ, Miki, K., Kim, D., Shim, SH, Shi, HF, Hwang, JY, Cai, X., Iseri, Y., Zhuang, X. 和 Clapham, DE (2017)。CatSperzeta 调节精子 Ca(2+) 信号域的结构连续性，是正常生育所必需的。 Elife 6：e23082。
Champlin, AK, Dorr, DL 和 Gates, AH (1973)。通过阴道的外观确定小鼠发情周期的阶段。Biol Reprod 8(4): 491-494。
Ded, L., Hwang, JY, Miki, K., Shi, HF 和 Chung, JJ (2020)。雌性生殖道的3D原位成像揭示了小鼠精子受精的分子特征。 Elife 9：e62043。
Li, H.、Hung, PH 和 Suarez, SS (2015)。射出的小鼠精子在体外比附睾精子更有效地进入卵丘-卵母细胞复合体。PLoS 一10(5): e0127753。
Nagy, A.、Gertsenstein, M.、Vintersten, K. 和 Behringer, R. (2003)。操纵小鼠胚胎：实验室手册。（第三版）。冷泉港实验室出版社（2003 年再版；1986 年编着）764 页。
Steptoe, PC 和 Edwards, RG (1976)。再植入人类胚胎并随后进行输卵管妊娠。柳叶刀1（7965）：880-882。

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