材料和试剂

记者
Ca 2+报告基因构建体：P mec-7 GCaMP5G
PS 记者：P dyn-1 mfg-e8 :: mCherry
注意：报告结构可根据要求提供（Furuta 等人，2021）。

携带两个记者的秀丽隐杆线虫菌株
菌株名称：ZH3052
基因型：enIs92[ P mec-7 GCaMP5G , P dyn-1 mfg-e8 :: mCherry , punc-76(+)]V unc-76(e911)V; mec-4(e1611)X 。
注意：该菌株可应要求提供（Furuta 等，2021）。

耗材和试剂
显微镜载玻片（Premiere，目录号：9101）
盖玻片（22×22 mm）（Fisher Scientific，目录号：12-542B）
DeltaVision 浸油N = 1.516 （Cytiva，目录号：29162940）
手工制作的蠕虫镐，它是安装在巴斯德移液管（Fisher Scientific，目录号：13-678-20B）上的铂丝（Alfa Aesar，目录号：10287）（图2）

图 2. 手工制作的蠕虫镐

高真空润滑脂（Fisher Scientific，目录号：14-635）
琼脂糖（Fisher Scientific，目录号：BP160-500）
KH 2 PO 4 （MilliporeSigma，目录号：PX1565）
Na 2 HPO 4 （MilliporeSigma，目录号：567550）
NaCl（Fisher Scientific，目录号：S671）
NH 4 Cl（Fisher Scientific，目录号：S671-3）
4% 琼脂糖溶液（见配方）
M9 缓冲液（见配方）

设备

立体显微镜（尼康，目录号：SMZ645）或来自其他制造商的用于处理秀丽隐杆线虫的任何立体显微镜。
DeltaVision Elite 反卷积成像系统（GE Healthcare, Inc.），包括配备 20×、63× 和 100× Uplan Apo 物镜、激发/发射滤光片组、荧光光源、DIC 的 AP1 F1-Delta Vision 显微镜（Olympus）显微镜配件、电动载物台（X 、Y和Z轴）和 Coolsnap HQ2 数码相机（光度学）（图 3）。对于荧光成像，使用了两套荧光滤光片 (Chroma Inc.)，包括 GFP 滤光片（激发波长 475/28 nm；发射波长 525/50 nm）和 mCherry 滤光片（激发波长 575/25 nm；发射波长） 632/60 纳米）。DeltaVision 显微镜保存在温度保持在 20°C 的房间内。

图 3. DeltaVision 去卷积显微镜

用于图像处理和分析的计算机

软件

SoftWoRx 5.5 软件（用于图像的解卷积和处理）（GE Healthcare, Inc.）

程序

在琼脂垫上安装动物
在微波炉中融化 4% 琼脂糖溶液。
将 300 µl 琼脂糖溶液分配在显微镜载玻片上，立即将另一个载玻片放在顶部使液滴变平。琼脂糖凝固后，轻轻地将两个载玻片滑到另一个上，将两个载玻片分开。琼脂糖的厚度约为 0.2 毫米（图 4）。

图 4.将压平的琼脂垫修剪成大约 12 × 12 毫米的正方形

将 3 µl M9 缓冲液放在琼脂垫的中心。M9 缓冲液是用于收集/洗涤蠕虫的缓冲液。
在定型显微镜下，将带有蠕虫挑的胚胎从板上转移到 M9 缓冲液滴中。尽量不要移植过多的胚胎（见注 1）。
在琼脂糖垫周围轻轻挤压一条细线高真空润滑脂。轻轻地将盖玻片放在一滴液体上。避免气泡。真空油脂可防止琼脂糖垫干燥。完成的幻灯片如图 5 所示。

图 5. 一张完整的幻灯片

秀丽隐杆线虫胚胎中 PLM 接触神经元的延时记录
设置显微镜参数。对于微分干涉对比 (DIC)图像，白光的曝光时间通常为 0.2 秒，使用 10% 中性密度滤光片。中性密度滤光片部分地阻挡了光线，滤光片的百分比表示有多少光线穿过。为了记录 Ca 2+记者 GCaMP5G的信号，GFP 通道的曝光时间为 0.1 s，使用 5% 中性密度过滤器。为了记录 PS 记者 MFG-E8::mCherry 的信号，mCherry 通道的曝光时间也是 0.1 s，使用 5% 中性密度过滤器。
根据制造商的说明仔细对齐 DIC 光路以获得最佳 DIC 效果。
在63×或100×物镜下，通过软件的“点标记”和“位置访问”功能，寻找胚胎并标记位置。建议不要同时标记太多胚胎（见注 2）。仔细选择比 2 倍阶段（第一次胚胎细胞分裂后 460 分钟）年轻的胚胎。
设置串行 z 截面记录的位置。串行 z 截面记录是从腹面和向内进行的。10-15 个 z 截面的设置为 0.5 μm/截面足以覆盖必要的区域。
设置延时记录参数。我们在第一次胚胎细胞分裂后 560 分钟之前没有发现显着的 Ca 2+或 PS 信号。时间推移记录的开始点被设定在560分钟-张贴1日胚胎细胞分裂，这是100分钟胚胎达到2倍阶段之后（图6）。在 ZH3052 菌株中，接触神经元 PLML 和 PLMR 所在的秀丽隐杆线虫尾巴的记录设置为记录的前 2 小时的 2.5 分钟间隔和接下来的 4 小时的 5 分钟间隔。

图 6. 2 倍阶段秀丽隐杆线虫胚胎的DIC 图像。比例尺为 10 µm。

开始记录DIC，GFP，和mCherry的图像一旦胚达到560分钟后1日胚胎细胞分裂，这是100分钟后的2倍的阶段。
在录制过程中继续观察图像。如果焦点位置发生任何变化，请在记录间隔期间调整起始焦平面。如果胚胎因光损伤而减慢运动或停止发育，则中止记录。图 7 显示了坏死 PLML 触摸神经元中细胞质 Ca 2+和细胞表面 PS的延时图像示例。

图 7. mec-4(e1611)突变引起的坏死 PLML 接触神经元中细胞质 Ca 2+和细胞表面 PS的图像示例。顶行显示 DIC 图像，描绘了 PLML 触摸神经元发生坏死的形态变化（用箭头标记）。中间一行显示了 PLML 神经元中的细胞质 Ca 2+信号。底行显示 PLML 神经元中的细胞表面 PS。在胚胎达到 2 倍阶段后 100 分钟开始记录。比例尺为 10 µm。图像改编自古田等人。(2021)。

数据分析

使用 SoftWoRx 软件对图像进行解卷积。对于 Ca 2+信号强度的量化，PLML 和 PLMR 神经元的细胞体由多边形勾勒出来，并获得总信号强度 (Ca x )。相同大小的相邻区域中 Ca 2+的总信号也是通过将相同的多边形移动到尾部的相邻区域（Ca背景）来测量的。相对 Ca 2+强度计算为 Ca R = Ca x /Ca背景。为保持 Ca 2+动力学的量化质量，应避免因快速移动的胚胎而导致图像失焦或模糊的图像（见注 3）。为了测量 Ca 2+动力学，我们排除了具有良好质量图像的少于 10 个时间点的胚胎。为了量化 PS 强度，包含 MFG-E8::mCherry 信号的细胞表面积由两个封闭的多边形勾勒出来。记录总信号强度以及每个多边形的面积大小。两个多边形之间的“甜甜圈形状”区域的单位PS信号强度（UPS）计算如下：UPS =（PS externalpolygon -PS internalpolygon ）/（Area externalpolygon -Area internalpolygon ）。得到附近一个“圆形”区域的背景mCherry信号（PS背景）和区域大小（区域背景），计算单位强度为UPS背景=PS背景/区域背景。相对 PS 信号强度 RPS = UPS/UPS背景。值 1 表示与非特异性背景信号相比没有信号富集。

笔记

对于延时成像，强烈建议在一张幻灯片上放置多达 10 个胚胎，以减少胚胎在记录期间的耗氧量。此外，在接近所选发育阶段的阶段转移胚胎[例如，如果您想从 2 倍阶段开始记录，则转移 1.5 倍阶段的胚胎（图 8）]。

图 8. 1.5 倍阶段秀丽隐杆线虫胚胎的DIC 图像。比例尺为 10 µm。

为了以 2.5 或 5 分钟的间隔捕获图像，并减少荧光灯的损坏，建议在一次实验中记录不超过 6 个胚胎。
胚胎在记录过程中不断在蛋壳内移动，因此 PLM 神经元有时会失焦。此外，由于胚胎的快速移动，一些图像变得模糊。捕获的良好图像的数量在很大程度上取决于胚胎运动。

食谱

4% 琼脂糖溶液
将 2.0 g 琼脂糖放入 50 ml 去离子水中，并用微波炉加热直至琼脂糖完全融化。使用后，固化后的溶液可在室温下保存并再次在微波炉中熔化。
M9 缓冲液（1 升）
在去离子水中溶解 3.0 g KH 2 PO 4 (22.0 mM)、5.8 g Na 2 HPO 4 (40.9 mM)、0.5 g NaCl (8.6 mM) 和 1.0 g NH 4 Cl (18.7mM)。用去离子水将体积调节至 1 L。高压釜。

致谢

这项工作得到 NIH R01GM104279 的支持。该协议改编自古田等人。(2021)。

利益争夺

作者声明不存在竞争利益。

参考

Akerboom, J., Chen, TW, Wardill, TJ, Tian, L., Marvin, JS, Mutlu, S., Calderon, NC, Esposti, F., Borghuis, BG, Sun, XR, et al 。(2012)。用于神经活动成像的 GCaMP 钙指示剂的优化。J Neurosci 32(40): 13819-13840。
Chalfie, M. 和 Sulston, J. (1981)。秀丽隐杆线虫机械感觉神经元的发育遗传学。开发生物学82(2): 358-70。
克拉珀姆，DE（2007 年）。钙信号。单元格131(6)：1047-1058。
Danese, A., Patergnani, S., Bonora, M., Wieckowski, MR, Previati, M., Giorgi, C. 和 Pinton, P. (2017)。钙调节癌症中的细胞死亡：线粒体和线粒体相关膜 (MAM) 的作用。Biochim Biophys Acta Bioenerg 1858(8): 615-627。
Driscoll, M. 和 Chalfie, M. (1991)。mec-4 基因是秀丽隐杆线虫基因家族的成员，该基因可以突变以诱导神经元变性。自然349(6310)：588-93。
Furuta, Y.、Pena-Ramos, O.、Li, Z.、Chiao, L. 和 Zhou, Z. (2021)。钙离子触发磷脂酰丝氨酸在坏死细胞表面的暴露。PLoS 基因。17（2）：e1009066。
Ghosh-Roy, A.、Wu, Z.、Goncharov, A.、Jin, Y. 和 Chisholm, AD (2010)。钙和环 AMP 促进秀丽隐杆线虫的轴突再生并需要 DLK-1 激酶。J Neurosci 30（9）：3175-83。
Li, Z., Venegas, V., Nagaoka, Y., Morino, E., Raghavan, P. Audhya, A.、Nakanishi, Y. 和 Zhou, Z.（2015 年）。坏死细胞通过两种不同的 PS 暴露机制的协同作用积极吸引吞噬细胞。PLoS 基因11(6)：e1005285。
Nakayama, H., Chen, X., Baines, CP, Klevitsky, R., Zhang, X., Zhang, H., Jaleel, N., Chua, BH, Hewett, TE, Robbins, J.,等。(2007)。Ca 2+ - 和线粒体依赖性心肌细胞坏死作为心力衰竭的主要介质。J Clin Invest 117：2431-2444。
Suzuki, H., Kerr, R., Bianchi, L., Frøkjaer-Jensen, C., Slone, D., Xue, J., Gerstbrein, B., Driscoll, M. 和 Schafer, WR (2003)。秀丽隐杆线虫机械感觉神经元的体内成像表明 MEC-4 通道在轻柔触觉过程中的特定作用。神经元39（6）：1005-17。
Tian, L., Hires, SA, Mao, T., Huber, D., Chiappe, ME, Chalasani, SH, Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, SA, Schreiter, ER, et al 。(2009)。使用改进的 GCaMP 钙指标对蠕虫、果蝇和小鼠的神经活动进行成像。Nat 方法6(12): 875-881。
Wojda, U.、Salinska, E. 和 Kuznicki, J.（2008 年）。神经元变性中的钙离子。IUBMB 生命60（9）：575-590。
Yamashima, T. (2004)。缺血性神经元死亡中的Ca 2+依赖性蛋白酶：从线虫到灵长类动物的保守“钙蛋白酶-组织蛋白酶级联反应”。细胞钙36(3-4)：285-293。
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