材料和试剂

1. 2升带盖锥形烧瓶（康宁，目录号：CLS431255-6EA）
2. 1.7毫升Eppendorf管（VWR，目录号：87003-294）
3. 50毫升falcon管（VWR，目录号：21008-940）
4. 皮氏培养板（VWR，目录号：25384-342）
5. 皮氏培养皿（VWR，目录号：25384-164）
6. 10µl微量移液管头（VWR目录号：37001-162）
7. 200µl微量移液管头（VWR目录号：53503-606）
8. 1毫升微量移液管头（VWR目录号：83007-376）
9. 10毫升血清学移液管（VWR，目录号：89130-910）
10. 胰蛋白胨（BD，目录号：211705）
11. 酵母抽提物（BD，目录号：211929）
12. 甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G6279）
13. 磷酸二氢钾（KH2PO4）（BDH，目录号：BDH0268-2.5KG）
14.磷酸二钾（K2HPO4）（Sigma-Aldrich，目录号：14.磷酸二钾（K2HPO4）（Sigma-Aldrich，目录号：60356)
15. 带GL45瓶盖的圆形介质瓶（肖特杜兰，目录号：218015455）
16. DH5α活性细胞（ThermoFisher，目录号：18265017），储存温度-80℃
17. BL21（DE3）合格电池（Thermofher，目录号：EC0114），储存温度-80°C
18. 卡那霉素（Sigma-Aldrich，目录号：K1377）
19. pET-28a（+）载体（Novagen，目录号：69864-3），储存温度-20°C
注意：本产品已停止使用。请使用棕色粉末代替绿色粉末。
20. 蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏，目录号：11585916001）
21. 链球菌树脂（IBA生命科学，目录号：2-1201-010）
22. Q Sepharose柱（GE Healthcare，目录号：17-1153-01）
23. D-去硫鸟嘌呤（Sigma-Aldrich，目录号：D1411-1G）
24. 烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶（内部酶）
25. 磷酸二钠（Na2HPO4）（Sigma-Aldrich，目录号：S9763）
26. TRIS base（J.T.Baker，目录号：410901）
27. 氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
28. 硫酸镁（MgSO4）（Sigma-Aldrich，目录号：M7506）
29. 氯化钙（CaCl2）（Sigma-Aldrich，目录号：C5670）
30. 氯化铵（NH4Cl）（Sigma-Aldrich，目录号：A9434）
31. 微量金属储备溶液（Sigma-Aldrich，目录号：92949）
32. BME维生素100x溶液（Sigma-Aldrich，目录号：B6891）
33. 1 M异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（Sigma-Aldrich，目录号：11411446001）
34. 铁-57金属同位素（美国元素，目录号：FE-M-01-ISO.57）
35.Luria Bertani肉汤（磅）35.Luria Bertani肉汤（磅）（BD，目录号：292438）
36. 琼脂（BD，目录号：214010）
37. 柠檬酸铁铵（（NH4）[Fe（CH4O）2]）（Sigma-Aldrich，目录号：228966-500G）567
38. 水合L-半胱氨酸盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：C121800-100G）
39. D-葡萄糖（VWR，目录号：0188-1KG）
40. 异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（Sigma-Aldrich，目录号：11411446001）
41. 很棒的肉汤（TB）（参见食谱）
42. LB培养基（见配方）
43. LB琼脂平板（见配方）
44. 1 M储备的异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（见配方）
45. 1米储备的柠檬酸铁铵（（NH4）5[Fe（C6H4O7）2]）（见配方）
46. 1 M L-半胱氨酸盐酸盐水合物（见配方）
47. 20%D-葡萄糖溶液（见配方）
48. 缓冲区A（参见配方）
49. 缓冲区B（参见配方）
50. 缓冲液C（见配方）
51. 缓冲区D（参见配方）
52. 缓冲液E（见配方）
53. 缓冲液F（参见配方）
54. 缓冲液G（见配方）
55. 缓冲液H（见配方）

装备

1.干槽（Eppendorf，型号：Thermomiler R）1.干槽（Eppendorf，型号：Thermomiler R）
2. 摇瓶培养箱（Thermo Scientific，型号：MaxQ6000）
3. 37°C培养箱（基准，MyTempMini）
4. OD600分光光度计（Eppendorf，生物光度计）
5. 超声波仪（振动池，超声波）
6. Sorvall离心机（Thermo Scientific，型号：Sorvall LYNX 6000）
7. 层流罩
8. 微型离心机（Eppendorf、Minispin）
9. 离心机（Eppendorf，型号：5425离心机）
10. pH计（Hannah，Edge pH计）
11. 充满N2/H2（95%/5%）的厌氧室（Coy实验室，乙烯基厌氧室，A型）

程序

以下方法描述了CCIS蛋白质和CCIS螺旋1内铁硫簇的自然成熟，称为“h1”（Jagilinki等人，2020）。这些方法通常可用于任何天然和人工蛋白质，以获得生物组装[4Fe-4S]簇的高产量。

A.CCIS/pET-28a（+）在BL21（DE3）感受态细胞中的转化
注：在无菌条件下执行步骤A1-A8。
1. 将100 ng CCIS/pET-28a（+）DNA质粒添加到清洁的Eppendorf管中的20µl BL21（DE3）活性细胞中，并在冰上培养40分钟。图1A表示CCIS融合蛋白的总体布局，而图1B显示了CCIS/pET-28a（+）构建体的载体图。（pET-28a（+）的网络链接）矢量地图http://wolfson.huji.ac.il/expression/commercial-vectors/pet-28-map.pdf).
2. 在培养期间，将干浴温度设置为42℃。
3. 培养后，将BL21（DE3）活性细胞在42°C的干浴中热休克90 s。
4. 将Ependorf放回冰上5分钟。
5. 向层流罩内含有DH5α活性细胞的Eppendorf中添加800µl LB培养基。
6. 将活性细胞瓶转移到摇瓶培养箱中，并在37°C下以200 rpm的速度培养45分钟。
7. 培养后，将活性细胞转移到层流罩内，并将50µl培养物添加到含有卡那霉素的LB琼脂平板上，并使用无菌撒布器轻轻撒布培养物。
8. 让平板风干，并将LB琼脂平板在37°C下倒置培养16小时。

B.含有CCIS/pET-28a（+）的BL21（DE3）活性细胞的起始培养
注：在无菌条件下执行步骤B1-B3。
1. 将10µl卡那霉素添加到无菌50 ml falcon管中的10 ml LB培养基中。
2. 从转化板上挑选一个分离菌落，接种到10mL含有卡那霉素的LB肉汤培养基中。
3. 在37°C的摇瓶培养箱中培养培养培养物过夜。

图1.CCIS融合蛋白布局图（A）和CCIS/pET-28a（+）（B）的载体图。感兴趣的基因是在NcoI和XhoI之间克隆的。

C.体内组装CCI高产率的理想生长条件
注意：步骤C1至C3应在层流罩内执行。
1. 向1 L TB培养基中添加4 ml柠檬酸铁铵储备溶液（最终浓度4 mM）和2 ml新制备的水合L-半胱氨酸盐酸盐（最终浓度2 mM）（见注1和注2）。同样，向培养基中添加25 ml D-葡萄糖溶液（最终百分比0.5%）（见注3）。
2. 将1000倍稀释的卡那霉素（50mg/ml水溶液）添加到培养基（1ml/1L TB）中。
3. 在1L TB培养基上接种100-200倍稀释的过夜发酵剂培养物（5-10mL）。
4. 让培养物在37°C的摇瓶培养箱中生长，并以200 rpm的转速搅拌，直到光密度（OD600）达到0.8-2.0，使用OD600分光光度计测定（见注释4）。
5. 达到所需OD后，从培养物上取下瓶盖，将培养瓶连同瓶盖分别转移到厌氧室内，并让培养物在厌氧室内停留至少一小时，使培养物厌氧。
6. 在培养箱内培养一小时后，添加2 ml新制备的L-半胱氨酸盐酸盐水合物（最终浓度2 mM）并向培养物中添加500µL IPTG溶液（0.5 mM）；然后拧紧培养箱内的GL45螺帽（见注释5和6）。
7. 在厌氧条件下，将装有培养物的锥形烧瓶从厌氧培养箱中取出，并在20至24°C和160 rpm的搅拌条件下，在摇瓶培养箱中培养蛋白质过度表达至少16小时（图2A）。
8. 或者，如果在室温（~25°C）下诱导，将锥形烧瓶放在厌氧室内，以160 rpm的速度在磁搅拌器上搅拌16小时，搅拌棒放在培养物内（图2B）。
9. 16小时后，将培养物转移到厌氧室内，将培养物倒入离心瓶中，并拧紧瓶盖（见注7）。
10. 从试验箱中取出瓶子，并在4°C下以3075 g离心15分钟。×
11. 厌氧冷冻培养物或立即在厌氧室内分离蛋白质。

图2.铁硫蛋白的厌氧诱导。A.在轨道振动筛内厌氧诱导铁硫蛋白的首选方法，其中振动筛的温度和转速都可以控制。B.在室温下厌氧诱导铁硫蛋白的替代方法，将锥形烧瓶放在磁性搅拌器上，搅拌器内有搅拌棒。这可以通过厌氧室内或室外的med。

D.生物组装57Fe标记holo-CCI的理想生长条件
注意：步骤D1至D3应在层流罩内执行。
1. 向1 L M9培养基中添加10 mg 57Fe硫酸亚铁。
2. 将1000倍稀释的卡那霉素（50mg/ml水溶液）加入培养基（1ml在1L M9培养基中）。
3. 用100-200倍稀释的过夜发酵剂培养液（5-10 ml）接种1 L M9培养基。
4. 从步骤4到步骤12，参考第C节中提到的步骤。体内组装CCI高产率的理想生长条件”。

E.铁硫蛋白的厌氧分离纯化
1. 将细菌颗粒（新鲜或冷冻）转移到厌氧室内（见注8）。
2. 将1L细菌颗粒以1:1000的比例重新注入另外含有蛋白酶抑制剂混合物的20mL缓冲液中。
3. 在厌氧室内用间歇脉冲对培养物进行至少5次1分钟的超声波处理（见注9）。
4. 将细胞裂解物转移到sorvall试管中，并在4°C下以24000×g离心30分钟。
5. 离心后，将sorvall管转移到厌氧室内，并将干净的上清液倒入干净的50 ml falcon管中。
6. 让上清液流过（重力流）链球菌树脂，用5柱体积的缓冲液A预平衡（见注10）。
7. 粘合后，用10至20柱体积的缓冲液A清洗链球菌树脂。
8.以1:200的比例添加TEV蛋白酶以进行柱上切割。在厌氧室内室温下培养，使切割至少6小时。（生产“内部”烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶的详细方案的网络链接：https://mcl1.ncifcrf.gov/waugh_pubs/64_Waugh.pdf8.以1:200的比例添加TEV蛋白酶以进行柱上切割。在厌氧室内室温下培养，使切割至少6小时。（生产“内部”烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶的详细方案的网络链接：https://mcl1.ncifcrf.gov/waugh_pubs/64_Waugh.pdf).
9. 通过10柱体积的缓冲液B，可从链球菌树脂中剥离结合的标记蛋白。
10. 尽管链球菌亲和色谱法可获得高纯度的目标蛋白，但强烈建议使用离子交换色谱法以获得更高纯度和更高浓度的样品。
11. 对于离子交换色谱法，将蛋白质样品在缓冲液C中稀释四次，使最终NaCl浓度约为50 mM。
12.平衡1mL Q Sepharose柱12.平衡1mL Q Sepharose柱使用厌氧室内的注射器手动注入5 ml缓冲液D。
13. 将稀释后的蛋白质通过Q-Sepharose柱；逐渐，蛋白质开始在柱顶部结合，柱顶部出现一个深棕色环，表明蛋白质完全结合到柱上。
14. 用1毫升缓冲液D清洗色谱柱。
15. 用1毫升缓冲液E清洗色谱柱。
16. 用1毫升缓冲液F清洗色谱柱。
17. 用1毫升缓冲液G从柱上洗脱CCIS蛋白。
18. 为了重新生成柱，用5 ml缓冲液H清洗Q Sepharose柱。
19.浓缩的holo-CCIS蛋白质应转移至图3所示的密闭玻璃瓶中，并在4°C下储存，直至进一步使用。蛋白质样品的强烈红棕色表明存在铁硫簇，并且该蛋白质可用于使用各种生物物理技术的进一步研究ermine样品纯度，参考补充图1（A和B）19.浓缩的holo-CCIS蛋白质应转移至图3所示的密闭玻璃瓶中，并在4°C下储存，直至进一步使用。蛋白质样品的强烈红棕色表明存在铁硫簇，并且该蛋白质可用于使用各种生物物理技术的进一步研究ermine样品纯度，参考补充图1（A和B）Jagilinki等人（2020年）。

图3.用于在4°C下储存铁硫蛋白的气密玻璃瓶

笔记

1. 可以使用LB培养基代替TB；但是，使用TB可以实现目标蛋白的最大产量。
2. 应新鲜制备水合L-半胱氨酸盐酸盐。
3. 请勿对D-葡萄糖溶液进行高压灭菌；只能对其进行无菌过滤。
4. 虽然0.8到1.0之间的典型光密度（OD600）值是好的，但如果蛋白质的溶解度更高，细菌培养物可以增加到2.0的光密度，以获得极高的holo蛋白质产量。
5.L-半胱氨酸高度敏感，降解迅速，因此必须再次补充。5.L-半胱氨酸高度敏感，降解迅速，因此必须再次补充。
6. IPTG的量必须根据目标蛋白质的溶解度进行优化。溶解度越高，可添加最多0.5 mM IPTG。如果目标蛋白质在水性缓冲液中的溶解度降低，则添加最多0.1 mM IPTG（即每1 l TB培养基100µl IPTG）。
7. 离心瓶在使用前至少12小时必须转移到厌氧室内。
8. 使用冷冻颗粒时，让细菌颗粒缓慢解冻至少一个小时后再使用。
9. 强烈建议始终在厌氧室内安装一个超声波仪。否则，在使用前至少24小时将超声波仪转移到厌氧室内。
10. 在纯化铁硫蛋白时，强烈推荐使用Strep标签，而不是其他亲和标签。应避免使用涉及镍或钴的固定化金属亲和色谱（IMAC），因为这些金属在纯化过程中可能会干扰铁硫簇。

食谱

1. 很棒的肉汤（TB）
a、对于1 L培养基，将12 g胰蛋白胨、24 g酵母抽提物和4 ml甘油添加到900 ml双蒸馏水中，并使溶质完全溶解。
b、应通过添加2.312 g磷酸二氢钾（0.17 M KH2PO4）和12.528 g磷酸二氢钾（0.72 M K2HPO4）制备100 ml盐溶液。
c、分别在121°c和15 psi条件下，在2 L锥形烧瓶中，用GL45螺帽和500 ml玻璃瓶对介质和盐溶液进行高压灭菌20分钟。
d、高压灭菌后，当介质和盐溶液的温度低于55°C时，在层流罩内的无菌条件下，向装有900 ml介质的2 L锥形烧瓶中添加100 ml盐溶液（见注1）。
磅中
向2L锥形烧瓶和高压釜中的1L水中添加20g LB培养基。
3. LB琼脂平板
a、向500ml锥形烧瓶中的100ml LB培养基中添加1.25g琼脂和高压釜。
b、高压灭菌后，当LB琼脂的温度低于55°C时，在层流罩内无菌添加100µl卡那霉素。
c、小心地将约25 ml熔融LB琼脂倒入干净的皮氏培养皿中，并使其凝固。
1 M储备的异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）
将2.383 g IPTG溶解于10 ml双蒸馏水中。
1米储备的柠檬酸铁铵（（NH4）5[Fe（C6H4O7）2]）
将26.5 g柠檬酸铁铵溶解在100 ml双蒸馏水中。
1 M L-半胱氨酸盐酸盐水合物
将0.31524 g L-半胱氨酸盐酸盐溶解于2 ml双蒸馏水中（见注2）。
20%葡萄糖溶液
将200 g D-葡萄糖溶解在1 L双蒸馏水中，并将溶液无菌过滤到层流罩内的无菌瓶中。不使用时将其冷藏（见注3）。
缓冲区A
50 mM Tris-HCl pH 8.0
200mmNaCl
缓冲区B
50 mM Tris-HCl pH 8.0
200mmNaCl
2.5毫米D-去硫鸟嘌呤
缓冲区C
50 mM Tris-HCl pH 8.0
缓冲区D
50 mM Tris-HCl pH 8.0
50毫米氯化钠
12. 缓冲区E
50 mM Tris-HCl pH 8.0
100毫米氯化钠
13. 缓冲区F
50 mM Tris-HCl pH 8.0
200mmNaCl
14. 缓冲区G
50 mM Tris-HCl pH 8.0
300毫米氯化钠
15. 缓冲区H
50 mM Tris-HCl pH 8.0
500mmNaCl

致谢

D.N.承认来自以色列科学基金会石油替代物的运输支持（GA 2185/17）；D.N和V.N承认欧洲研究理事会（ECC）合并授权（GA615217）D.N.，V.N.和B.P.J.得到了美国宇航局天体生物学研究所赠款80NSSC18M0093的进一步支持。厌氧表达和纯化方案改编自Kuchenreuther等人（2010年）和Birrell等人（2016年）之前描述的方法。

竞争利益

作者声明没有相互竞争的利益。

工具书类
1. Ayala Castro，C.，Saini，A.和Outten，F.W.（2008）。细菌中的铁硫簇组装途径。Microbiol-Mol-Biol版本72（1）：110-125，目录。
2. 贝内特，H.（2000年）。铁硫蛋白：古老的结构，仍然充满惊喜。生物化学杂志5（1）：2-15。
3. 贝内特，H.，霍姆，R.H.和芒克，E.（1997）。铁硫簇：自然界的模块化多用途结构。科学277（5326）：653-659。
4. Birrell，J.A.，Laurich，C.，Reijerse，E.J.，Ogata，H.和Lubitz，W.（2016）。氢键在微调海洋热虫HydC[2Fe-2S]团簇氧化还原电位中的重要性。生物化学55（31）：4344-4355。
5. 克拉克，D.P.（1989年）。大肠杆菌的发酵途径。FEMS微晶体版本5（3）：223-234。
6. 科尔德斯，M.和吉斯，B.（2009年）。肽和蛋白质中的电子转移。化学Soc版本38（4）：892-901。
7. 贾吉林基，B.P.，艾里克，S.，特恩西克，C.，提利什金，A.M.，派克，D.H.，卢比茨，W.，比尔，E.，埃恩斯勒，O.，比雷尔，J.A.，阿卡巴约夫，B.，诺伊，D.和南达，V.（2020年）。从头设计的铁硫蛋白的体内生物发生。ACS合成生物学。
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