材料和试剂

1.尼龙膜（Invitrogen，目录号：LC2003）
2. DNA酶I （NEB ，目录号：M0303S）
3.无核酸酶W¯¯亚特（赛默飞世科学，目录号：AM9932）
4. Trizol（ThermoFisher Scientific，目录号：10296028）
5.氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：288306 ）
6.异丙醇（Sigma-Aldrich，目录号：563935 ）
7.乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：51976 ）
8. 2-米ercaptoethanol （Gibco公司，目录号：21985023 ）
9.己克lycol（Sigma-Aldrich公司，目录麻木ER：112100）
10. Triton X-100（Fisher Scientific，Acros Organics，目录号：215680010）
11. dNTP （各10 mM）（ThermoFisher Scientific，目录号：R0192 ）
12. NTP （每个 10 mM）（ThermoFisher Scientific，分子生物学级 NTP ，目录号：R0481 ）
13. G lycerol（Sigma-Aldrich，目录号：G5516 ）
14. HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
15.各种盐：氯化钠，氯化钾，氯化镁2 ，和的MnCl 2 （Sigma-Aldrich公司，目录号小号：S9888 ，P9541 ，M8266 ，和M1787分别）
16. Ç reatine磷酸盐（Sigma-Aldrich公司，目录号：10621714001）
17.聚乙烯醇（Sigma-Aldrich，目录号：341584 ）
18. DTT （ThermoFisher Scientific，目录号：R0861 ）
19.胃酶抑素A（Sigma-Aldrich，目录号：P5318 ）
20.苯基甲基磺酰基（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：52332 ）
21.蛋白酶抑制剂（Roche，目录号：11697498001）
22.二乙基p yrocarbonate（DEPC）（Sigma-Aldrich公司，目录号：D5758）
23. [ γ - 32 P]-ATP（3,000 Ci/mmol，10 mCi/ml）（PerkinElmer，目录号：BLU002A）
24. T7 RNA p olymerase （赛默飞，目录号：18033019）
25. T4 p olynucleotide ķ inase （PNK）（NEB，目录号：M0201S）
26.高˚F idelity DNA p olymerase （赛默飞，目录号：F530L）
27. p CR-Blunt （ThermoFisher，目录号：K270020）
一个PCR-钝的地图可以发现在上的网站的制造商：www.thermofisher.com/order/catalog/product/K270020#/K270020。
28. RNA米arker （Abnova公司，目录号：R0002）
29.布拉德福德ř eagent （生物太阳神d，目录号：5000205）
30.凝胶纯化试剂盒
31. PCR 提取试剂盒
32. RNase
33.引物：
U 2.3-RNA-F : atacctttctcggccttttggc
U 2.3-RNA-R : ctgcgtaacatatataaatatctctg
T7-U2.3-F：TAATACGACTCACTATAGGGatacctttctcggc
PolyG-U2.3-R: CCCCCCCCCCCC ctgcgtaacatatataa
34.处理缓冲器（见ř ecipes）
35. M1缓冲器（见ř ecipes）
36. M2缓冲器（见ř ecipes）
37. M3缓冲器（见ř ecipes）
38. 2 ×甲酰胺上样缓冲液（见ř ecipes）
39.含有 6 M 尿素的 6% 变性聚丙烯酰胺凝胶（见配方）

设备

PhosphorImager （GE Health Care，型号：Typhoon FLA 9500）
适合处理32 P 放射性的空间
盖革计数器 (Thermo, 900 mini)
保护用户免受放射性侵害的有机玻璃防护罩
用于32 P 废物的有机玻璃盒
Sephadex G-25 离心柱（默克公司，11273990001）
聚合酶链反应机
荧光屏（分子动力学）
细胞过滤器（Biofil，目录号：CSS013100）
垂直电泳凝胶盒和带有垫片和梳子的玻璃板（Bio- Ra d，型号：Mini-PROTEAN Tetra）
分光光度计（一个NY UV吸收分光光度法包括布拉德福德可用）

软件

数量一（Bio-Rad 实验室）或I mageJ

程序

组装U2.3 之前的模板
将以下内容添加到 PCR 反应中：
36.5 μ升的DDH 2 ö
10 μ l 5 × Phusion HF 缓冲液
1 μ l 10 mM dNTP 混合物
200 ng拟南芥DNA
0.5 μ l U 2.3-RNA-F和U 2.3-RNA-R引物（10 pmol/ μ l）
0.5 μ升高保真DNA聚合酶
执行 PCR 以生成具有以下循环的 pre-U2.3 片段：
98 °C 30 秒使 DNA 变性
95 °C 10 秒
58 °C 30 秒
72 °C 15 秒
重复 PCR 31 个循环
72 °C 10 分钟
4 °C储存
在 1.5% 琼脂糖凝胶中电泳 PCR 产生的 DNA 片段。
按照制造商的说明，使用凝胶纯化试剂盒验证前 U2.3（355 bp）片段并从琼脂糖凝胶中纯化 PCR 产物。
将扩增的 PCR 产物克隆到 pCR-Blunt。
6 μ升纯化预U2.3 PCR产物
1 μ l pCR-Blunt 载体
2 μ l 5 × T4 DNA 连接酶缓冲液
1 μ升T4 DNA连接酶
在室温下孵育连接反应 10 分钟。变换构建成主管ê scherichia大肠杆菌。提取阳性载体并使用歌手测序确认 pre-U2.3 片段。
组装U2.3 之前的模板并与 T7 启动子和 Ploy-G 融合。将以下内容添加到反应中：
74 μ升的DDH 2 ö
20 μ l 5 × Phusion HF 缓冲液
2 μ l 10 mM dNTP 混合物
1 μ l pre-U2.3 pCR-Blunt 载体（50 ng/ μ l）
1 μ l T7-U2.3-F 和PolyG-U2.3-R 引物（10 pmol/ μ l）
1 μ升高保真DNA聚合酶
使用以下循环进行 PCR：
98 °C 30 秒使 DNA 变性
95 °C 10 秒
58 °C 30 秒
72 °C 15 秒
重复 PCR 33 个循环
72 °C 10 分钟
4 °C储存
加载PCR产物（5小等分μ在1.5％升）琼脂糖凝胶用于检查的PCR片段的质量。如果产品包含一个单一条带，其余的的产物（95 μ升），可直接使用纯化的PCR提取试剂盒凝胶未经纯化。
洗脱在最后50中的PCR产物μ升DEPC水，用作体外转录的模板。

合成 pre-U2.3-polyG snRNA 底物
体外RNA 转录。将以下内容添加到反应中：
22 μl DEPC 水
10 μl 5 ×转录缓冲液（Ambion）
2.5 μl NTP（10 mM ATP、CTP、UTP、GTP）
1微升RNA酶抑制剂（Promega公司40个单位/ μ升）
1 微升 1 M DTT
5 μl 转录模板 (200 ng/μl)
1 μl T7 RNA 聚合酶（50 单位/μl）
在 37°C 下孵育 1小时
加入 1 μl DNase I（10 单位/μl）并在 37°C 下孵育 15 分钟。
加入50μl2 ×甲酰胺上样缓冲液到反应溶液中，煮沸5分钟，并加载到预运行5％变性聚丙烯酰胺凝胶含有荷兰国际集团6M尿素。以 20 mA/凝胶分离 RNA，约 1 小时。
电泳后，用溴化乙锭对 PAGE 凝胶进行可视化，并用干净的刀片直接切出 RNA 带。凝胶切片被粉碎成细浆，浸泡在 TE 缓冲液中。然后离心浆液并用移液管回收上清液。携带到上清液中的聚丙烯酰胺片段可以通过 0.2 毫米过滤器过滤去除。
添加 3 M 醋酸钠 (pH 5.2) 至最终浓度为 0.3 M，并使用 3 倍体积的无水乙醇沉淀 RNA。以 12 , 000 × g离心15 分钟，使 RNA 沉淀。
洗小粒料小号用75％乙醇，以除去不需要的盐。
溶解在20所述RNA底μ升DEPC水。
无线电RNA底物的有源标签。将以下内容添加到反应中：
3 微升 DEPC H 2 O
20 μl RNA 底物
3 µl T4 PNK 反应缓冲液 (10 × )
1.5 微升 T4 PNK
1.5 μl RNasin（Promega 40 单位/μl）
1 µl [ γ - 32 P]-ATP
在 37°C 下孵育 30 分钟。添加 30 μl DEPC 水（如果需要更多或更少的 pre-snRNA 探针，可以改变此体积）。
未掺入的核苷酸被使用除去一个葡聚糖G-25离心柱。

合成放射性 RNA 标记
取15 μ升商业RNA标记插入的Sephadex G-25柱，以除去盐和染料。
当r的RNA标记的adioactive标记，一个DD以下反应：
10 μ升筛选RNA标记
6 μ升DEPC水
2 µl T4 PNK 反应缓冲液 (10 × )
1 微升 T4 PNK
1 µl [ γ - 32 P]- ATP
在 37 °C 下孵育30 分钟
拔下U nincorporated使用核苷酸一葡聚糖G-25离心柱。
制备系列稀释的该标记的RNA标记（1：5，1:15，1:50，和1：150）。将 2 µl系列稀释标记物和 pre-U2.3-polyG RNA 底物滴到尼龙膜上。使用通过交联固定的RNA点到膜的UV交联剂与一个120设置，000 μJ厘米- 2 。
放置在塑料包装的尼龙膜的存储荧光体摄像画面和暴露8小时。然后用 PhosphorImager 扫描荧光屏。
使用RNA加样缓冲液以相同的辐射电平与预U2.3-多聚G RNA底物稀RNA标记根据对所述的放射性信号系列稀释斑点。

pre-U2.3-polyG snRNA 的体外加工测定
小心地将 2 g 花序在液氮2 中研磨成细粉，然后将粉末倒入 15 ml 管中。
将试管置于冰上，加入 8 ml M1 缓冲液，并颠倒数次。
通过细胞过滤器 (100 µ M )将溶液过滤到 50 ml 管中。
在 4°C 下以 12 , 000 × g离心10 分钟。
弃去上清液，加入 4 ml M2 缓冲液，移液混合。将溶液转移到 5 ml 管中。用 3 ml M2 缓冲液和 3 ml M3 缓冲液连续洗涤，每次以 13 度、200 × g旋转 1 分钟洗涤。用小吸头移液器除去所有溶液。
添加 200 μl 处理缓冲液（不含磷酸肌酸）以悬浮沉淀。
采取10微升的核蛋白入190微升Bradford试剂，静置为5分钟，并且在595nm处测量蛋白浓度。
使用处理缓冲液（不含磷酸肌酸）将每个样品的核蛋白稀释至 50 ng/μl。
对于总的50微升反应体积为每个重复，孵化40微升的核内蛋白，5微升的标记的DNA，和5μl的在30℃的200mM磷酸肌酸股票溶液（20mM终浓度）。（该号码的重复可以改变的。我们做了四个重复这里）。
通过在不同时间点加入450μl的TRIzol试剂停止反应小号（瓦特Ë停止在10，30，60，和90个分钟反应时间点）。按照制造商的说明提取 RNA 。
溶解于10 RNA沉淀μ升DEPC水。添加10 μ升甲酰胺上样缓冲液的溶液并煮沸5分钟。
负荷一半的RNA提取的，以及0.5 μ升预U2.3底物（用作输入）和5 μ升RNA标记物，在6％变性聚丙烯酰胺凝胶含有6M尿素的预运行。
在 1 × TBE 中以 120 V 运行，直到加载染料达到凝胶长度的2/3 。
电泳后从电泳仪中取出凝胶。小心地将凝胶转移到塑料包装上。用滤纸吸收溶液。用保鲜膜小心地包裹凝胶。
放置在塑料包装的凝胶的存储荧光体摄像画面和暴露6 - 10小时。荧光屏然后用扫描的磷光。
导出的图像的ř adioactive信号在“TIFF”格式（图1）。

图 1. pre-U2.3-polyG 的体外加工。体外转录的预U2.3-多聚G的RNA在核蛋白质提取物处理来自拟南芥的各种时间点小号，所指示的在顶部的图中。萃取后，将RNA上解决一PAGE凝胶，并用检测到的一个磷光。预U2.3-多聚G RNA的位置由表示的灰色箭头，而加工的成熟snRNA的小号是指示由所述黑色箭头。

数据分析

乙和强度分别为q uantifi版用ImageJ的或量的一种软件后续荷兰国际集团这些步骤（我们使用量的一种）：
使用数量一打开凝胶图像。
打开“音量工具”并选择“音量矩形工具” 。从图像中选择目标带的最小区域，包括处理后的成熟 snRNA 和输入（图 2）。

图2.该目标频带的数量在One软件选择的帧。依次选择的各种反应的权利处理snRNA的频带小号（帧1 - 4），根据对RNA标记物的相关位置和预U2.3-多聚G输入（框5），使用“音量矩形工具”。

Ç舔“量分析报告” ，并选择报告选项，包括区域名称，浓度，均值，和密度（表1）。

表1.我相关频段的ntensity

ü自身的值密度到孔定量˚F y中的相对处理效率。所述intensit IES的所述放射性信号š的各种成熟U2.3被归一化到的输入。

食谱

处理缓冲区
10 mM HEPES ，pH 7.9
50 毫米氯化钾
10% 甘油
20 mM 磷酸肌酸
3 毫米氯化锰2
2.5% 聚乙烯醇
1 毫米 DTT
加入PMSF，胃蛋白酶抑制剂A ，而只是摆在我们面前的蛋白酶抑制剂ê 。
注意：请务必在使用当天制作溶液。
M1缓冲器
10 mM磷酸盐缓冲液，pH 7. 8
0.1中号的Na氯
10 mM 2-巯基乙醇
1 M己二醇
加入PMSF，胃蛋白酶抑制剂A ，而只是摆在我们面前的蛋白酶抑制剂ê 。
M2缓冲器
10 mM磷酸盐缓冲液，pH 7. 8
0.1中号的Na氯
10毫2-米ercaptoethanol
1 M己二醇
10 毫米氯化镁2
加入PMSF，胃蛋白酶抑制剂A ，而只是摆在我们面前的蛋白酶抑制剂Ë
M3缓冲器
10 mM磷酸盐缓冲液，pH 7. 8
0.1中号的Na氯
10 mM 2-巯基乙醇
加入PMSF，胃蛋白酶抑制剂A ，而只是摆在我们面前的蛋白酶抑制剂Ë
2 ×甲酰胺上样缓冲液
95% 去离子甲酰胺
0.025% (w/v) 溴酚蓝
0.025% (w/v) 二甲苯氰 FF
5 mM EDTA，pH 8.0
含有 6 M 尿素的 6% 变性聚丙烯酰胺凝胶（10 毫升）
2 毫升30% 聚丙烯酰胺溶液 (29:1)
尿素 3.6 克
1ml 5 × TBE
9.9 毫升水
80 微升 10% APS
10 微升 TEMED
在制备凝胶之前，用 70% 乙醇和 RNase 清洁所有组件。

致谢

这项工作是支持摹从国家重点实验室保护的咆哮和亚热带农业生物资源（SKLCUSA-a202008）的利用。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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