材料和试剂

定期˚F低血细胞计数5 -米升试管，聚丙烯或聚苯乙烯（12 × 75 mm）时，或1.4 -米升微管（例如。，，或从深Micronic公司）-孔板（任何供应商）。
雷瑟小号溶液（Beckman Coulter公司，VersaLyse TM ，目录号：IM3648，保存于18-24℃，2 -年的保质期）
固定液（IOTest ® 3 10 × ；Beckman Coulter，目录号：A07800，在 2-8°C 下储存，1 年保质期）
Antibod ÿ鸡尾酒（IOTest髓激活CD169-PE（藻红蛋白）/ HLA-DR-APC（别藻蓝蛋白）/ CD64-PB（太平洋蓝）从Beckman Coulter公司，目录号抗体混合物：C63854，储存在2-8℃， 1 年保质期）
在LYSI易批量制备小号缓冲液（见食谱）
染色的批量制备和LYSI小号n个测试缓冲（见食谱）

设备

移液器（吉尔森，移液器® ，目录号小号：FA10003M [ 2-20微升]和FA10006M [ 100-1000微升] ）
3 激光、10 色细胞计数器（Beckman Coulter ，Navios，目录号：B47904）或 3 激光 13 色细胞计数器（Beckman Coulter ，CytoFLEX，目录号：B53000）。任何ø疗法3-激光流式细胞仪都可以使用（例如。，Becton Dickinson公司的FACSCanto，Cytek极光）

软件

Kaluza 软件 2.1 版（Beckman Coulter，https://www.beckman.fr/flow-cytometry/software/kaluza）
注意：可以使用任何其他流式细胞术软件（例如，Becton Dickinson Flowjo 、Cytek SpectroFlo）。

程序

准备LYSI小号BUF FER（w ^耳普通个人防护装备）。
在化学罩保护下将裂解液中的固定液稀释 1:200 并混合。
执行lys是–染色步骤。
在含有500个微升赖氨酸的管是缓冲液和10微升共轭面板中，添加2-50微升的血液样品（VE理性或毛细管），混合，并孵育对于在黑暗中在15分钟RT （18-25℃）。
获取关于一个3激光cytomete数据R（吨母鸡处置的在专用于生物危害废物容器废物）。

数据分析

A.在流式细胞仪上获取数据
未染色的细胞用于设置流式细胞仪的参数。
打开流式细胞仪。
打开采集软件并创建四个点图：
x 轴上的侧向散射 (SSC) 和 y 轴上的前向散射 (FSC)。
信道专用于PE（FL2上NAVIOS）检测上吨他X轴和SSC在y -轴。
Chanel的专用于APC（FL6上NAVIOS）检测上吨他X轴和SSC在y轴。
Chanel 专用于x 轴上的 PB（Navios 上的 FL9）检测和 y 轴上的 SSC 。
设置了电压/增益的SSC-FSC情节，使得大部分的细胞群是在曲线图（图1a）的中间。应以获取最少碎片的方式设置判别式/阈值。
将所有补偿设置为 0。
设置 FL9、FL2 和 FL6 的电压，使淋巴细胞平均或中值荧光强度约为 0.3 （图 1b）。

图1.流cytomet RY上的（a）SSC-FSC情节和（b）FL2-，FL6-，参数和FL9-SSC图

保存协议。
使用高流速 ( ~ 1 µl/s)获取第一个染色样品，无需任何补偿。确保获得至少 500 个单核细胞以进行可靠的分析（通常为 30 到 90 秒）。
在SSC-FSC情节，画出一个亮氨酸ķ ocyte栅极，避免碎片（图2a）。
在SSC-FL9（CD64-PB）图，画出淋巴细胞，单核细胞，和嗜中性粒细胞闸门（图2b）。
CD169 和 HLA-DR 表达水平应在单核细胞上进行评估。CD64表达水平应该在嗜中性粒细胞进行评估（图2b和2 C）。

图 2. 数据分析程序。（a和b）的淋巴细胞，单核细胞的门控策略，和嗜中性粒细胞。(c) CD169、CD64 和 HLA-DR 表达水平评估策略。

标记水平应该表示为在荧光的平均强度，荧光强度的中位数，或信号-到-噪声。信号-到-噪声被计算如下：在单核细胞CD169表达水平应当由淋巴细胞CD169表达水平被划分; 中性粒细胞上的 CD64 表达水平应除以淋巴细胞上的 CD64 表达水平；单核细胞上的 HLA-DR 表达水平应除以中性粒细胞上的 HLA-DR 表达水平（图 3）。
结果被认为如下：高 mCD169 表达指示病毒刺激，高 nCD64 表达指示细菌刺激，高 mHLA-DR 表达指示感染性刺激，低 mHLA-DR 表达指示免疫衰竭（图 3）.

图3.米CD169，nCD64 ，在全血中使用一步法和mHLA-DR表达的评估。例如一个用于一个健康志愿者，一个VIR再给予我们-感染的病人，一个细菌-感染的病人，1例败血症。

需要更多的研究来精确设置每个实验室环境中的阈值，但作为一个指标，之前的评估表明，CD169 和 CD64 指数es 的阈值应该接近 3 。
可以使用 Kaluza 等软件进行进一步分析（重新分析、其他门控和自动门控、其他直方图或点图、着色、补偿调整、精炼百分比和荧光值、叠加和合并数据集、批量分析以提高吞吐量，等。）。

笔记

根据目标标记、应用和所需的稳定性，该方法应适用于每个实验室设置。例如，仅用于指示而不是作为既定性能，在某些应用中观察到：
血液试料c的是静脉或毛细血管。
血液Ç一个用EDTA或肝素抗凝来。
多亏了温和裂解试剂和固定液加入，血液Ç一个采样后进行处理达3-4天，当储存在室温或2-8℃。此外，样品C的被分析上的流式细胞仪的处理后3天，当储存在2-8℃。
裂解液可以包括 0.05% 的固定液。
裂解缓冲液（LYS是溶液含固定溶液）C的在RT贮存长达一个月。
靶向标记可以是任何膜标记。
抗体Ç一个是液体或取决于产品可用性干燥。
警告：
如果使用液体混合物，超过100 µl 的抗体可能会影响裂解效率。
如果使用的是商业DURAClone格式，所述裂解体积应当增加至1ml（为2-50微升血液）或2毫升（50-100微升血液按照IFU）。
抗体Ç一个与裂解预混缓冲高达几天之前。

食谱

注意：根据每个应用进行调整；表演不成立。
LYSI易一批准备小号缓冲
一瓶 Versalyse 溶液（100 毫升）
500 μ升固定溶液（10 × ）
混合并储存在室温下
染色的批量制备和LYSI小号n个测试缓冲
移液管 (n+1) × 500 µl 裂解缓冲液
添加 (n+1) × 10 µl 髓样激活混合物（或任何其他面板的最佳剂量）
混匀，每管分装 510 µl，避光保存
试管现在准备好接收血样

致谢

IAB是在收件人一CIFRE博士 ANRT（国家研究与技术局）的资助（N°2018/1212）。这项工作得到了贝克曼库尔特 (Beckman Coulter) 的支持，捐赠了流式细胞术实验中使用的研究试剂，以及四位员工的参与：IAB、PB、JMB 和 FM。所描述的方法是从“VersaLyse 和氯化铵裂解机制” （van Agthoven，2007 年）修改而来的，并产生了最近的出版物（Bourgoin等人，2019a、2019b、2020a、2020b、2020c 和 2021；Bedin等人。 2020；米歇尔等人，2020) 。

利益争夺

有没有利益或竞争利益冲突小号。

伦理

所有入选患者签署知情同意书，并在随后的程序均符合赫尔辛基宣言。受试者的日常护理没有改变；分析在匿名留下执行-过血，并在研究中收集的所有数据都是常规的临床实践的一部分，从主题的记录取得。次的结果是研究对受管理没有影响。

参考

Bedin, A. S., Makinson, A., Picot, MC, Mennechet, F., Malergue, F., Pisoni, A., Nyiramigisha, E., Montagnier, L., Bollore, K. 和 Debiesse, SJ ( 2020）。单核细胞 CD169 表达作为 COVID-19 早期诊断的生物标志物。J Infect Dis 223(4): 562-567。
Bourgoin, P.、Biechele, G.、Ait Belkacem, I.、Morange, PE 和 Malergue, F. (2020a)。干扰素在全血 CD64 和 CD169 表达中的作用：病毒或细菌免疫反应之间平衡的相关性。免疫炎症 8(1): 106-123。
Bourgoin, P.、Hayman, J.、Rimmele, T.、Venet, F.、Malergue, F. 和 Monneret, G. (2019a)。一种用于流式细胞术的新型一步细胞外染色：脓毒症相关生物标志物的概念验证。J 免疫学方法470：59-63。
Bourgoin, P.、Lediagon, G.、Arnoux, I.、Bernot, D.、Morange, PE、Michelet, P.、Malergue, F. 和 Markarian, T. (2020b)。急诊科发热患者感染相关生物标志物的流式细胞术评估。未来微生物15：189-201。
Bourgoin, P., Soliveres, T., Ahriz, D., Arnoux, I., Meisel, C., Unterwalder, N., Morange, PE, Michelet, P., Malergue, F. 和 Markarian, T. (2019b ）。通过流式细胞术对急诊科感染分层生物标志物的临床研究评估。Biomark Med 13(16): 1373-1386。
Bourgoin, P., Soliveres, T., Barbaresi, A., Loundou, A., Belkacem, IA, Arnoux, I., Bernot, D., Loosveld, M., Morange, PE, Michelet, P., Malergue, F. 和 Markarian, T. (2021)。CD169 和 CD64 可以帮助在急诊科区分细菌与 CoVID-19 或其他病毒感染。细胞计数法 A 99(5)：435-445 。
Bourgoin, P., Taspinar, R., Gossez, M., Venet, F., Delwarde, B., Rimmele, T., Morange, PE, Malergue, F. 和 Monneret, G. (2020c)。走向单核细胞 HLA-DR 床边监测：概念研究的证明。休克55（6）：782-789。
Brown, M. 和 Wittwer, C. (2000)。流式细胞术：血液学的原理和临床应用。临床化学46（8 Pt 2）：1221-1229。
Michel, M., Malergue, F., Belkacem, IA, Bourgoin, P., Morange, P.-E., Arnoux, I., Miloud, T., Million, M., Tissot-Dupont, H., Mege , J.-L., Busnel, J.-M. 和 Vitte, J. (2020)。用于 COVID-19 筛查的超灵敏、超快速全血单核细胞 CD169 检测。医学Rxiv 。
van Agthoven, A. (2007)。VersaLyse和氯化铵裂解的机制。诠释J实验室血液学29：65 - 66。

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