材料和试剂

1. 18 -毫米直径的玻璃盖玻片（Menzel的-格拉泽，VWR，目录号：MENZCB00190RA020）
2. 6-孔板（Corning，费小号系统求解，目录号：07-200-83）
3.移液器吸头
4. 50 -毫升玻璃瓶
5. 1.5 - ml和0.5 -毫升锥形管仪（Eppendorf，目录号小号：00030 120 086; 00030 121 023）
6.铝箔
7. 0.1 M NaOH （Sigma-Aldrich ，目录号：211465，室温储存）
8. （3-氨基丙基）三甲氧基硅烷（3-APTMS）（Sigma ，目录号：281778，在室温下储存在通风橱中）
9.戊二醛（Sigma，目录号：340855 ；在4°C下储存）
10. SurfaSil 硅化液（Thermofisher Scientific，目录号：TS 42800 ；在室温下储存）
11.丙酮（Sigma，目录号：179124 ；在室温下储存）
12.甲醇（Sigma，目录号：322415 ；在室温下储存）
13. 40% 丙烯酰胺溶液（Bio-Rad，目录号：1610141 ；在 4°C 下储存在通风橱中）
14. 2% 双丙烯酰胺溶液（Bio-Rad，目录号：1610142 ；在 4°C 下储存在通风橱中）
15. TEMED（Bio-Rad，目录号：1610801 ；在室温下储存在通风橱中）
16.过硫酸铵（APS）粉末（Bio-Rad，目录号：1610700 ；在室温下干燥储存）
17.丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS-丙烯酸酯）（Sigma，目录号：A8060 ；储存在-20°C）
18. Sulfo-SANPAH（磺基琥珀酰亚胺6-（4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基）己酸酯）（Sigma，目录号：803332-50MG ；储存在-20 °C ）
19.二甲基亚砜（DMSO）（Sigma，目录号：472301 ；在室温下储存）
20. HEPES（50 mM pH 8.2）（Sigma，目录号：83264 ；在室温下储存）
21.磷酸盐-缓冲盐水（PBS）（Sigma，目录号：806552 ；在室温下储存）
22. MiliQ 水
23.蛋白质的兴趣，例如，胶原蛋白I（康宁，目录号：354236）或纤连蛋白（MP Biomedicals公司，目录号：MP215112601）

设备

250 -毫升玻璃烧杯中
微量移液器组（从 P1 到 P1000）
盖玻片迷你架
剪切流变仪（例如，Malvern Instruments、Kinexus 应力控制流变仪）
镊子
化学罩
4℃冰箱
-20 °C冰箱
培养箱设置在 37 °C
320 - 365 nm紫外光源
以 10 , 000 × g离心
干燥器

程序

玻璃盖玻片功能化
胶粘剂盖玻片小号
倾100毫升0.1M NaOH中放入250 -毫升玻璃烧杯中，通过在NaOH中浸渍预清洁每个盖玻片; 让他们到风干。
下的化学通风橱，倒入100mL三APTMS溶液放入250 -毫升玻璃烧杯中，浸入盖玻片3分钟。
用 100 毫升M illiQ 水清洗盖玻片3-5 次，直到在水中观察不到泡沫。
关键步骤：残留的 3-APTMS 将在下一步与戊二醛反应并产生橙色沉淀。如果发生这种情况，请丢弃盖玻片并从步骤 a) 开始。
制得200毫升0.5％的戊二醛在中号illiQ水在250 -毫升玻璃烧杯中。将盖玻片放在迷你架中，并在戊二醛溶液中浸泡 1 小时。
风干的在室温下在真空盖玻片和存储。
非粘合盖玻片小号
下化学通风橱，预PARE 100毫升5％SurfaSil硅化流体在丙酮中。
将盖玻片浸入 SurfaSil 溶液中10 秒并搅拌以确保涂层均匀。
用干净的丙酮冲洗盖玻片。
冲洗的用甲醇盖玻片。
风干盖玻片并在室温下储存。

线性聚丙烯酰胺溶液的制备
制备一个10％（W / V）在APS H的溶液2 ö之前使用。对于长-长期储存，分装所述溶液到500 -微升Eppendorf管中并存储在一个-20℃的冰箱中。一个v Ø ID冻融循环。室温下储存的溶液不稳定。为了达到最有效的聚合，我们建议prepar荷兰国际集团一个新鲜的10％（W / V）的APS溶液立即之前到每个凝胶制剂。
在一个50 -毫升玻璃瓶，混合丙烯酰胺，H 2 O，TEMED ，和10％根据表1的配方的AP。
注意：线性聚丙烯酰胺溶液可以制成惰性或活化的，具有结合粘附蛋白的能力。如果您打算制备活化的线性聚丙烯酰胺，请根据表 1 用 DMSO 中的 1 ml 4% NHS-丙烯酸酯代替 1 ml H 2 O。
关键步骤：使用非常少量的聚合引发剂 (APS) 以确保形成非常长的线性聚丙烯酰胺链，其回转半径远大于聚丙烯酰胺交联网络的网眼尺寸，这一点很重要。这防止了线性链从弥漫性荷兰国际集团的聚丙烯酰胺网络的出期间实验的时间。

表1.组成以ml线性聚丙烯酰胺溶液为一总体积为10毫升

在37 °C 下聚合 1 小时。
用铝箔盖住瓶子以避光。储存在 4 °C 。如果线性聚丙烯酰胺聚合得当，它可以储存数月。
注意: 线性聚丙烯酰胺溶液粘度高; 因此，很难对其进行准确的移液。我们建议切吸量管末端转移之前，和转让环溶液缓慢。

粘弹性聚丙烯酰胺凝胶的制备
在 Eppendorf管中，根据表2 中提供的配方在 DMSO（如果适用）中混合丙烯酰胺、双丙烯酰胺、线性聚丙烯酰胺、H 2 O和4% NHS-丙烯酸酯。
关键的一步：混合解决方案非常轻轻地通过吸管婷它向上和向下。重要的是不要将气泡引入混合物中。如果失败，您可能需要在真空干燥器中对溶液进行脱气。混合物中气泡的存在会破坏聚合并改变所得凝胶的机械性能。
表2组合物中的粘弹性微升聚丙烯酰胺凝胶的用于一个总体积500的微升

根据表 2 添加 TEMED 和 10% APS，轻轻混合并吸取 100 µl凝胶混合物到粘性盖玻片上，并将非粘性盖玻片放在液滴顶部。
15分钟后，添加中号illiQ水凝胶周围，以避免在侧面上干燥。
后的15分钟，从凝胶的顶部除去非粘性盖玻片，放置于6孔板中的凝胶，在水和浸没。
注意：所述的机械性能的凝胶上用于凝胶制剂，精度移液试剂的质量强烈依赖，并将该混合物的混合。大多数凝胶聚合失败来自 APS 和 TEMED 移液和混合中的错误或这些溶液的不当储存。简而言之，TEMED 应保持在黑暗中，而在水中不稳定的 APS 应新鲜制备以进行最有效的聚合。我们强烈建议在每次单独制备后直接使用流变仪测量凝胶的粘弹性。根据我们的经验，混合和移液并不总是相同的，而且 G' 往往会随着试剂变旧而降低，这显然是由于氧化。因此，差异在所测量的G”和G‘’值可以大到50％。

粘附蛋白的附着
粘弹性聚丙烯酰胺凝胶包括一个在被掺入到所述网络线性聚丙烯酰胺链的存在下聚合丙烯酰胺和双丙烯酰胺的网络，这决定了其粘稠的性质。我们的方法允许的共价蛋白的聚丙烯酰胺网络，线性聚丙烯酰胺的结合，或两者。
粘附蛋白的附着到仅线性聚丙烯酰胺
Ť ø制备能够交联到蛋白质激活线性聚丙烯酰胺兴趣，后续部分“B. 线性聚丙烯酰胺溶液的制备”和表 1 中活性线性聚丙烯酰胺的配方。所得线性聚丙烯酰胺链在与稀释至 0.1 mg/ml 蛋白质的目标蛋白质一起在室温下在 50 mM HEPE S pH 8.2 中孵育2 小时或在 4°C 下过夜后将与蛋白质共价结合（两种孵育均产生均匀涂层） . 对于蛋白质温育，准备至少微升每80 0.1mg / ml的蛋白质溶液的18 -毫米直径的凝胶。该LARG尔胶，就需要越多的蛋白质溶液。
小心：孵化与蛋白质进行以下polymeriz的通货膨胀使用活性线性聚丙烯酰胺凝胶的粘弹性的内它们掺入后立即链丙烯酰胺/双丙烯酰胺网络。粘弹性凝胶的线性聚丙烯酰胺链在交联网络聚合后不能被选择性激活。
与蛋白质孵育后，用 100 µl PBS 冲洗凝胶 3 次，并在 4°C 下储存在 PBS 中直至细胞接种，但不得超过几天。
仅将蛋白质连接到交联的聚丙烯酰胺网络
4% NHS 的 DMSO 方法
在 DMSO 中制备新鲜的 4% NHS 溶液。
根据表 2，每 500 µl 凝胶混合物体积添加 50 µl 4% NHS 的 DMSO。
注意：在聚合前将 DMSO 中的 4% NHS 溶液添加到凝胶混合物中。粘弹性凝胶的交联的聚丙烯酰胺网络不能被选择性地激活后-聚合。
当 APS 和 TEMED 混合时，在粘性和非粘性盖玻片之间浇注凝胶，如前所述（C 部分：粘弹性聚丙烯酰胺凝胶的制备）。
一旦凝胶被冲洗并浸泡在 50 mM HEPES pH 8.2 中，在引擎盖下用紫外线照射15 分钟。从这一步开始，用于细胞接种的凝胶应保持在无菌条件下。
将凝胶浸入在 50 mM HEPES pH 8.2 中稀释至 0.1 mg/ml 蛋白质的目标蛋白质中，并在室温下孵育 2 小时或在 4°C 下孵育过夜（两种孵育均产生均匀涂层）。
用 PBS 冲洗 3 次并在 4°C 下储存直至细胞接种，但不得超过几天。
NHS-丙烯酸酯甲苯法
在化学罩下，准备在甲苯溶液中的 0.5 毫升 2% NHS-丙烯酸酯。
制备无APS和TEMED的凝胶混合物从表2的配方下面，用一个修改中，即，代替50微升4％NHS在DMSO与50μl中号illiQ水。
每 500 µl 凝胶混合物加入 100 µl 2% NHS-丙烯酸酯的甲苯溶液并搅拌直至溶液变得均匀混浊。
勒AVE在室温下5分钟，然后离心以10 ，000 ×g下5分钟，以甲苯从凝胶混合物中分离。
使用200除去甲苯（上部）层-微升移液管和凝胶混合物转移到一个新试管中。
添加 APS 和 TEMED 以启动聚合并在粘性和非粘性盖玻片之间浇注凝胶，如前所述（C 部分：粘弹性聚丙烯酰胺凝胶的制备）。
一旦凝胶漂洗和在50mM HEPES pH 8.2的浸泡，照亮与UV光引擎盖下15分钟。从这一步开始，用于细胞接种的凝胶应保持在无菌条件下。
将凝胶浸入在 50 mM HEPES pH 8.2 中稀释至 0.1 mg/ml 蛋白质的目标蛋白质中，并在室温下孵育2 小时或在 4°C 下孵育过夜（两种孵育均产生均匀涂层）。对于蛋白质温育，准备至少微升每80 0.1mg / ml的蛋白质溶液的18 -毫米直径的凝胶。在LAR GER凝胶，就需要越多的蛋白质溶液。
用 100 µl PBS 冲洗3 次，并在 4 °C 下储存在 PBS 中直至细胞接种，但不超过几天。
蛋白质与线性聚丙烯酰胺和交联聚丙烯酰胺网络的连接
将凝胶浸泡在 50 mM HEPES pH 8.2 中 15 分钟。
制备5mM的磺基SAN PAH在25％DMSO和75％的50mM HEPES pH 8.2的（第一溶解磺基SANPAH在DMSO，然后在添加HEPES中号illiQ水）。每80微升的5mM磺基SANPAH溶液最少18 -毫米直径的需要凝胶。
注意：我们强烈建议每个凝胶制备之前准备新鲜磺SANPAH的解决方案，而不是STOR荷兰国际集团就超过1天。
覆盖80μl的磺基- SANPAH溶液（对于18各自凝胶的表面-毫米直径凝胶），并用UV光照射（320 - 365纳米）10 -引擎盖下15分钟。从这一步开始，用于细胞接种的凝胶应保持在无菌条件下。正确激活磺SANPAH应该从明亮的橙色改变颜色，以一个较深的桔红色或棕色。
注意：不要将凝胶过度暴露在紫外线下，也不要让凝胶在照射过程中变干。
用 100 µl 50 mM HEPES pH 8.2冲洗凝胶3-5 次，直到去除所有的 sulfo-SANPAH 。
将凝胶浸入在 50 mM HEPES pH 8.2 中稀释至 0.1 mg/ml 蛋白质的目标蛋白质中，并在室温下孵育 2 小时或在 4°C 下孵育过夜（两种孵育均产生均匀涂层）。对于蛋白质温育，准备至少微升每80 0.1mg / ml的溶液18 -毫米直径的凝胶。在LAR GER凝胶，就需要越多的蛋白质溶液。
用 100 µl PBS 冲洗 3 次，并在 4°C 下储存在 PBS 中直至细胞接种。
注意：我们建议在制备后的几天内使用凝胶，而不是将它们长期存放。在很长一段时间内（几天到几周），线性聚丙烯酰胺链可以从凝胶表面扩散出来并改变它们的机械性能。

细胞接种
在接种细胞前 30 分钟，将凝胶浸泡在培养基中并保持在37°C。
胰蛋白酶化的细胞，并准备一个在所关注的浓度的细胞悬浮液（至研究细胞-底物相互作用，被单个细胞通常需要）。
去除用于浸泡凝胶的介质并替换为细胞悬液。将凝胶保存在 37°C 的培养箱中。细胞在与凝胶表面接触后开始扩散。

数据分析

主数据即characteriz Ë凝胶是其剪切储能或损耗模量作为时间和剪切应变的功能，如在引入Charrier等。( 2018) 。粘性耗散的大小将高度依赖于时间，并且还取决于线性聚丙烯酰胺链的长度s 。钍ë聚合物长度是高度依赖于APS的量和活性引发剂和是即时通讯可以精确地控制。d从非常稀溶液的动态光散射的流体动力学半径的etermination将提供这一长度的量度，如在Charrier等人。( 2018) 。
对于在粘弹性基质上培养的细胞，最常测量的量是细胞面积、形状、粘着斑的大小、运动性、牵引力和增殖。这些参考文献中提供了这些特征如何随基质变化以及如何在不同细胞类型之间变化的示例（Gong等人，2018 年；Charrier等人，2020 年和2021 年；Mandal等人，2020 年）。此外，我Ñ图URE 2 ，我们表明生长24胶质瘤细胞系LBC3的形态和铺展面积1千帕和5千个帕的弹性和粘弹性基材小时。可以看出，胶质瘤细胞以依赖弹性模量的方式对底物粘度敏感，例如。，在G” = 1千帕纯弹性凝胶，神经胶质瘤细胞是小于那些在1千个帕的粘弹性凝胶; 而在较高的刚度（G” = 5千帕），引入粘度到衬底没有引起细胞铺展面积统计学显著增加。

图URE 2 。底物粘度对细胞形态和铺展面积的影响。LB C3神经胶质瘤细胞生长24 H于1千帕的弹性（A），粘弹性（B），5千帕的弹性（d），和粘弹性（E）的水凝胶，用0.1mg / ml的纤连蛋白仅聚丙烯酰胺的交联网络上呈现。图C和F显示孔定量吨为1千帕和5千个帕的弹性和粘弹性凝胶的LBC3细胞扩散区域的通货膨胀。

致谢

这项工作由美国国立卫生研究院 (R01EB017753) 和 NSF 工程机械生物学中心 (CMMI-154857) 资助。KP 得到了波兰国家科学中心的支持，资助号为 UMO-2017/26/D/ST4/00997。该协议是从Charrier等人那里采用的。（2020 年）。

利益争夺

没有一个作者有任何竞争利益要声明。

伦理

本研究中未使用人类或动物受试者。

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