材料和试剂

1.斑马鱼 WIK 品系（内部）
2.斑马鱼饲养系统水（内部）
3. 汉克平衡盐溶液（ThermoFisher Scientific，目录号：14025092）
4. 盐酸多柔比星（Sigma-Aldrich，目录号：D1515）
5. 3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸乙酯，Tricaine（Sigma-Aldrich，目录号：E10521）

设备

游泳隧道（Loligo Systems，型号：10L 120V/60Hz，目录号：SW10110）
水族气泵（API，Rena 气泵，400 型）
金属板 (11.2 × 9.5 厘米；孔径：0.25-0.50厘米；制成的钢; 参见图1A ）
水流量计（Hontzsch，flowtherm NT）
计重秤（托巴尔，目录号：AD520）
计时器（Fisher Scientific，Fisherbrand，目录号：14-649-17）

软件

Excel ( Microsoft Office ) 或 JMP (SAS Institude Inc.)
棱镜（图P广告）

程序

建立成年斑马鱼DIC模型
提高WIK鱼下控制密度（<每升10鱼）和生长个条件小号至> 3个月大。
（Ø ptional）如果学习继承的遗传模型，提高突变体和野生型鱼下相同的密度和增长届条件小号到> 3个月大。基因分型可以在 3 个月时进行。Ë nsure ，一个突变体和野生相等数量-被容纳在自己的坦克类型的鱼。
将成年鱼随机分配到对照组和模型组s 。如果测试任何治疗干预，添加额外的模型组。
多柔比星溶解在粉末去离子水至原料浓度为5mg /米升。
腹腔注射汉克平衡盐溶液 (HBSS) (5 μ l ) 或阿霉素（5 μ l ，20 mg/kg，在 HBSS中制备）分别添加到对照组和模型组的个体鱼中。用于注射的位置可以是间中线的骨盆翅片或所述骨盆鳍上面侧线。d etailed阿霉素注射方法可以在一个单独的协议来发现（马等人，2018）。
维持4周以上的鱼水系统与常规饲养更长，直到时间的进行游泳挑战的考验。随着高的单剂量-剂量阿霉素，鱼发展心肌病样表型后4周-注射。
（Ø心肌病ptional）其他成年斑马鱼模型可以被利用来替代DIC模型。

设置游泳隧道
按照制造商的说明安装的不同部分的游泳隧道。
选择用于斑马鱼适当金属片和装配它在到游泳隧道（图1B ）。其原因为使用金属片与一个小孔径（孔径：0.25-0.5厘米）是为了防止鱼进入游泳隧道的循环水系统，它避免了对鱼的损坏。
用斑马鱼住房系统水 (pH = 7.9) 将游泳隧道填充到最高水平 (图 1C)。安装空气泵向游泳隧道和将喷嘴在隧道（图1D）的角，以提供恒定的氧。
使用流量计测量流速（图 1E）。通过调节电机控制器，从低到高逐步增加泳道中的水流量。在每个水流条件下，记录电机控制器上显示的每分钟转数 (RPM)。
建立流速和RPM之间的线性相关性，并且使用了通用的公式，以允许CONVER的锡永RPM流动速度以供将来使用（图1F ）。

图1的设置的游泳隧道和水流速度。一个。可采用不同的金属片作为下游筛网，防止精疲力竭的鱼进入水循环。两个在底部（称为以作为金属薄板1和金属板2）适于斑马鱼螺柱IES 。孔径的金属板1为0.5cm和的金属板2为0.25cm。B.该assembl ý金属片（由指示的所述的游泳隧道红色箭头）。C.水位（由表示的红色箭头）在游泳隧道所有实验。这也是该隧道的最大容量（约 40 L 水）。D.一种图象显示在哪里放置空气泵喷嘴（通过指示所述在隧道红色箭头）。E.一种图象示出的流量计放置到测量电È水的速度（以表示的红色箭头）。F.水流速度和转速之间的线性相关小号使用当电机的每分钟（RPM）或者所述的金属片小号在（A）中所示。

测量鱼的长度和重量
快速鱼的控制和模型组24 ^ h前游泳激发试验。执行该步骤以不同的鱼的状态同步，以期以REDUC荷兰国际集团与食物消费和ATP产生代谢过程相关的潜在的变化。
在 0.16 毫克/毫升三卡因中麻醉鱼。
测量每个鱼的体长（不包括该尾鳍）用尺子（图2A ）。
将鱼拍干并测量每条鱼的重量。用勺子将鱼移到秤顶部的称重盘中（图 2B ）。

图 2. 显示成年斑马鱼体长 (A) 和体重 (B) 测量的代表性图像。的长度的尾部测量当不包括翅片的主体长度。

P花边鱼背在坦克与系统水进行恢复。通常，鱼不应离开水超过 5分钟，以避免潜在的伤害或死亡。

游泳挑战测试
在填充有水的系统，负载5-10鱼在游泳隧道一个时间到隧道内的游泳室。小号EAL与帽和螺钉腔室中。
打开游泳隧道和气泵。电机的转速设定为200 RPM（大约8-9厘米/秒在我们的例子）在一反时针方向。使用计时器记录从这一步开始的时间。允许鱼到驯化至20的水流的这低速分钟（图3A ）。
增加马达的中的步骤的RPM 100（即，300 RPM，400 RPM，500 RPM，等这种增加小号水流8.66厘米/在我们的情况下，每个时间s）。在每个速度，允许鱼到游泳150秒（图小号3B和3C ）。
密切监视鱼并记录每个筋疲力尽的鱼失败小号从下游金属片（恢复游泳图3D;视频1 ）。对于每条鱼，记录在150 - s周期s (Uii)内完成的最高水速和最后 150 - s周期 (Ti)的游泳持续时间。
当所有的鱼都吃完后，关闭隧道。
允许鱼到恢复FOR〜5分钟，然后将它们传送回至所述壳体系统。
重复小号TEP小号d 1 d 6，完成游泳挑战测试在每条鱼的控制和模型组。
完成后，关闭气泵，将隧道内的水排出，用毛巾擦净，并盖好隧道进行维护。

图3的过程中游泳挑战。以 200 RPM (A)、500 RPM (B)和800 RPM (C)的电机速度显示游泳通道中成年斑马鱼的代表性图像。D. 以1,200 RPM的电机速度将精疲力竭的鱼附着在金属板上。本实验使用金属板2。

视频 1. 代表视频展示了鱼在游泳挑战过程中被耗尽的过程

数据分析

比较对照组和模型组之间的鱼长
计算每组体长的均值和标准差。使用一吨-test（或当非参数检验指示）持续2 -基团的比较（图4A）和使用单向ANOVA接着是三个和更多组之间的多重比较的方法进行比较（或者在适当的时候非参数检验） .
计算单个鱼的临界游泳速度
临界游泳速度计算使用以下公式：Ucrit = UI + UII × （钛/ TII），其中Ucrit代表临界游泳速度; UI是最高的水的速度是鱼达到在所有150 -小号期秒; UII是水的速度在其鱼BEC一个我累死; Ti为持续时间即鱼的sw一个在UII的速度m ; 和TII是在每个水的速度（150秒在我们的情况下）的时间。
比较不同组的临界游泳速度
ř收集具有代表性的数据使用的鱼模型DIC和其控制都在给出图4中，报告了游泳持续时间，绝对关键的游泳速度，和临界游泳速度归一化到体长我Ñ Ñ = 15 DIC成鱼和控制小号。典型地，该值对于每个组中的临界游泳速度遵循一个左偏态分布（图小号4C和4D）。比较可以进行使用曼-惠特尼为两组检验（非参数）和在Kruskal-Wallis检验（非参数），随后多重比较方法对于三个或更多个基团。我们使用 Prism 软件进行数据可视化。

图4. ř具有代表性的数据进行比较阿霉素诱导的心肌病（DIC）模型和控制成年斑马鱼之间的游泳指数。A. 体长比较。B. 隧道内总游泳时间的比较。这还不包括在20 -分钟在200 RPM驯化时间。C. 绝对临界游泳速度的比较。D. 将临界游泳速度归一化为体长的比较。BL/s 表示每秒体长的倍数。在 C 和 D 中，小提琴显示了每组 15 条鱼的临界游泳速度分布。破折号编线表示的中位数（较厚）和25个和75个四分位数。

笔记

在此描述的协议，控制和DIC组我们编不同斑马鱼群组; 因此，减少不同鱼群之间的差异是必要的。虽然车身长度和游泳速度需求之间的相关性š成立，我们建议正火临界游泳速度，体长解释。尽管如此，为了比较它们的游泳能力，不同组的鱼应尽可能保持相似的长度s和重量s 。丢弃体重过高或过低的异常鱼。
可替代地，研究用的DIC模型可以进行我n中的相同鱼队列中，并且可以在处理之前和之后确定游泳容量与多柔比星。通过这种方式，在多柔比星应力对游泳的影响可以不考虑潜在混杂因素的评估。
随着时间的推移，鱼可能会学会在游泳隧道中表现得更好。例如，在鱼经过数天或数周的训练后，临界游泳速度已被证明会增加（Ding等，2019）。因此，减少群体间的差异，建议测量游泳能力的鱼，有一个用游泳隧道类似的经历。
在我们的协议中，我们总是在游泳隧道中使用相同数量的水，将其填充到最大容量（约 40升），以减少潜在的变化。实验温度始终设置为 20 ° Ç ，且pH的水被设定在7.9 （莱韦克塔等人，2016）。另外，氧水平可能影响游泳能力斑马鱼，这是不孔定量TAT ED在此协议。

致谢

作者承认美国 NIH R01 赠款（HL81753、HL107304、HL111437和GM63904）和梅奥基金会对 XX 的支持。该协议根据 Ma等人发表的先前研究进行了微小修改。(2018)。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

所有协议均由梅奥诊所医学院动物护理和使用委员会批准。

参考

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