材料和试剂

150 × 20毫米细胞培养皿（美国小号系统求解，目录号：CC7682-3614）
5毫升血清移液管小号（VWR，目录号：89130-896）
30ml塑料注射器小号（NORM-JECT，目录号：4100-X00V0）
15 ml离心管（VWR，目录号：89039-664）
50 ml离心管（VWR，目录号：525-0402）
3.5 ml 离心管（Beckman，目录号：349622）
25 × 89 mm离心管（Beckman，目录号：344058）
0.45 µm 过滤器（PALL，目录号：4652）
StrepTrap HP 柱（Cytiva，目录号：28-9075-46）
细胞刮刀（美国科学，目录号：CC7600-0220）
Dulbecco氏中号odified Eagle氏培养基（DMEM）（VWR，目录号：45000-304）
其特征在于胎BOVIN ë血清，加拿大ö rigin（Cytiva，目录号：SH30396.02）
牛生长血清（美国）（Cytiva，目录号：SH30541.03）
佩尼奇llin- s treptom ycin（Thermo Fisher，目录号：15140122）
HiTrap 肝素 HP（Cytiva，目录号：17-0406-01）
强力霉素（Millipore，目录号：3382281）
d-脱硫生物素（Sigma，目录号：D1411）
二硫苏糖醇（DTT，Millipore，目录号：233156）
PBS（Gibco，目录号：2052719）
SBP-FKBP12.6 构建体（Cabra等人，2016 年）
咪唑（Sigma，目录号：I2399）
蔗糖（Sigma，目录号：S9378）
4-吗啉丙烷磺酸（MOPS，Sigma，目录号：M1254）
氯化钠（NaCl，Fisher，目录号：S671-3）
3-[(3-Cholamidopropyl)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐（CHAPS，Sigma，目录号：220201）
L-α-磷脂酰胆碱（Sigma，目录号：P3644）
10% Tween-20（Millipore，目录号：655206）
抑肽酶（Thermo Fisher Scientific，目录号：78432）
亮肽素（Thermo Fisher Scientific，目录号：78435）
Pefabloc（Thermo Fisher Scientific，目录号：78431）
抗 RyR 抗体（34C，Abcam ab2868）
均质缓冲液（见配方）
增溶缓冲液 I （见配方）
增溶缓冲液 II （见配方）
稀释缓冲液（见配方）
洗涤缓冲液 I （见配方）
洗涤缓冲液 II （见配方）
洗涤缓冲液 III （见配方）
洗脱缓冲液 I （见配方）
洗脱缓冲液 II （参见配方）

设备

Avanti JE 离心机（贝克曼，转子：F10BCI-6 × 500）
Optima MAX-TL u超速离心机（Beckman，转子：TLA 100.3）
Optima LE-80K u超速离心机（贝克曼，转子：SW32 Ti）
桌面Ç entrifuge仪（Eppendorf，米Odel等：5415C）
Sonicator（Qsonica Q125 型，最大功率 125 瓦）
轨道小号haker（Labnet公司倒数30）
pH值米ETER（梅特勒-托利多SevenEasy S20）
蠕动p UMP（的Masterflex C / L，米Odel等：77120-32）
-80℃升aboratory ˚F reezer
杜恩斯ħ omogenizer（10 -毫升特氟隆柱塞玻璃（紧），Cole-Parmer公司）
电磁搅拌机
Pipett ES （吉尔森移液器，型号：P1000，P200，P20，P10）
纳米d ROP 2000小号pectrophotometer（赛默飞世尔科技）
电泳凝胶成像Ë我maging小号ystem（ProteinSimple）
FEI Tecnai F20 透射电子显微镜 (TEM)

程序

囊泡部分的纯化
培养HEK293细胞，表达与诱导型多西环素启动子的RyR的构建体，在150 × 20的Dulbecco mm培养皿（〜30-40板）中号odified的Eagle中号edium补充有胎牛血清（FBS，2％），牛生长血清（ BGS，7%）和青霉素-链霉素。HEK293 细胞的快速和稳健生长需要含有生长激素的FBS ；可以使用更具成本效益的 FBS-BGS 组合。在80-90％confluenc ë ，添加多西环素（2微克/毫升），并温育3天。
收获细胞在PBS（约3毫升/板）用细胞刮刀的辅助下，并创建一个单细胞悬液通过上下吹打与一个5 -毫升血清移液管。根据该产生的体积，收集细胞在一个或两个15 -毫升离心管中。
以573 × g （Beckman Coulter Avanti JE 离心机，转子 F10BCI-6 × 500）离心 10 分钟。
丢弃上清液。重悬在匀浆缓冲液中的颗粒和使用超声波探头（98％均质一个mplitude，在约3个脉冲的20秒一个Qsonica Q125超声波仪）。
以4,400 × g （Beckman Coulter Avanti JE 离心机，转子 F10BCI-6 × 500）离心均质沉淀10 分钟。
转移的上清液至3.5 -毫升离心管中。
以100,000 × g （Beckman Coulter Optima MAX-TL 超速离心机，转子 TLA 100.3）离心 60 分钟。
丢弃的上清。使用 Dounce 匀浆器将所得沉淀物重新悬浮在匀浆缓冲液中。
确定蛋白质的浓度在纯化囊泡（即通过执行，典型地〜40-60毫克/毫升）一个上的两个10 Bradford测定法-微升的部分并计算平均值。
使用液氮冷冻并储存在 -80°C 以备后续蛋白质纯化。

使用蔗糖梯度离心和离子交换色谱法从囊泡中纯化重组 RyR
如果从冷冻纯化囊泡开始（见小号挠度答：P囊泡馏分urification），解冻〜100毫克囊泡在37℃浴中。
可加9溶解缓冲液我不CHAPS到25 -毫升的烧杯中。
将解冻的囊泡加入含有增溶缓冲液I （不含 CHAPS）的烧杯中。
使用磁力搅拌器以 300 rpm 的速度搅拌溶液。
小心地将 5 ml 5% CHAPS 添加到溶解混合物中，同时继续搅拌。
用封口膜盖住烧杯，继续以 300 rpm 的速度搅拌 25 分钟。
离心机的溶解蛋白质在100000 ×克（Beckman Coulter公司的Optima MAX-TL ù ltracentrifuge，转子TLA 100.3）60分钟。
丢弃的沉淀。上清液可用于进一步的 RyR 纯化。
准备以下解决方案：10%、12%、14%、16%、18% 和 20% (w/v) 蔗糖在增溶缓冲液I 中含有 0.5% (w/v) CHAPS-0.125% PC 而不是 5% CHAPS-1.25% PC。
将 5 ml 20% 蔗糖倒入 Ultraclear Beckman 离心管（25 × 89 mm）中。
使用蠕动泵小心添加 6 ml 18%、6 ml 16%、6 ml 14%、6 ml 12% 和 5 ml 10% 蔗糖溶液，确保液体层不混合（图 1）。

图 1.示意图显示了不连续的蔗糖梯度，蔗糖层的浓度逐渐降低。将溶解的 RyR 样品添加到 10% 蔗糖溶液的顶部。超速离心导致基于密度的分离，RyR 在管底部附近沉淀。蔗糖梯度从底部（较密的）蔗糖层开始以 2 - ml 级分的形式卸除。

使用蠕动泵将溶解的 RyR 样品（最多 3.5 毫升）分层在 10% 蔗糖溶液的顶部（图 1）。
慢慢提起管子，然后轻轻地将它们放在摆动桶转子中。离心120000 ×克（Beckman Coulter公司的Optima LE-80K超速离心机，转子SW32 Ti）的下没有BRAK 23小时ING和低加速条件。
使用蠕动泵从底部开始卸载梯度（2.0 - ml 分数）（图 1）。
分析各馏分ø n中的10％SDS-PAGE染色凝胶考马斯乙rilliant乙略或瓦特西部时代b很多婷与一个通用的抗RyR的抗体（34C），以鉴定含有纯RyR的级分（图2）。

图 2. SDS-PAGE 和蛋白质印迹显示蔗糖梯度分数和 RyR 的阳性鉴定。一个。用考马斯染色的SDS-PAGE凝胶乙rilliant乙略的蔗糖梯度级分（FRA＃9表示所有剩余的级分的混合物）。合并含有纯 RyR 的部分 1-6。的异常的高分子量碱受体（每单体565 kDa）的放置其频带远高于顶部分子量标记，区别特征在于在大多数情况下足够用于阳性鉴定。乙。使用抗 RyR 抗体 (34C) 对蔗糖密度梯度的部分s #3 和 #4 进行蛋白质印迹，以确认 RyR 的身份。

一旦确定，汇集包含纯 RyR 的分数。
添加DTT在1mM至汇集纯化RyR的样品的终浓度（以补偿DTT衰减）。
用稀释缓冲液将样品稀释 5 倍。
将 1 - ml HiTrap 肝素 HP 柱（Amersham Biosciences）连接到蠕动泵（图 3）。

图3.该图显示了样品的组件，所述蠕动泵中，1 -毫升的HiTrap肝素HP（或1 -毫升StrepTrap）柱，并收集级分的管中。

用 20 ml 去离子水 (Milli-Q) (1 ml/min) 清洗柱子。
用 20 ml 洗涤缓冲液I (1 ml/min)平衡色谱柱。
将 RyR 样品加载到柱上 (0.5 ml/min)。
用 20 ml 洗涤缓冲液 I (1 ml/min) 洗涤柱子。
用 10 ml 洗涤缓冲液II (1 ml/min)洗涤柱子。
用 10 ml Elution Buffer I (0.5 ml/min)洗脱样品。
手动收集在塑料1.5 4滴（约100微升）的等分试样洗脱的级分-毫升离心管（图3）。
确定蛋白质浓度的使用absor在使用NanoDrop 2000分光光度计各馏分bance在280纳米（消光系数2271320中号-1厘米-1为碱受体）。
通过 10% SDS-PAGE （图 4）和负染色 EM （图 5）评估纯化 RyR 的纯度和质量。
在液氮中快速冷冻等分试样并储存在 -80°C 以备后续冷冻电镜网格准备。

图4. SDS-PAGE凝胶用考马斯染色乙rilliant乙略示出从StrepTrap亲和柱（RyR2的WT）以及从肝素-琼脂糖亲和柱（RyR2的R176Q和RYR1 R164C）洗脱RyRs的。

图 5.从 HEK293 细胞中纯化的负染色 RyRs 的显微照片（用绿色包围的代表性 RyRs）。使用已建立的方案进行阴性染色以检查纯化蛋白质的质量（Ohi等人，2004）。涂有薄碳层的铜栅（CF300-Cu 300 目，电子显微镜科学）首先辉光-以 25 mA 放电 20 秒。纯化后的RyRs（3.5 µl）吸附在网格上40 s，去离子水洗涤，0.75%甲酸双氧铀染色；多余的污渍被吸掉。图像收集在ň配备了GATAN超扫描4000个UHS FEI TECNAI F20 TEM（4K × 4k) 放大倍数为 50,000 × 的相机。在与显微照片中突出显示的图像相对应的单个 RyR 的放大图像中，可以看出 RyR 的更精细结构细节。

通过一步亲和层析从囊泡中纯化重组 RyR
如果从冷冻纯化的小泡开始（见小号挠度答：P囊泡馏分urification），解冻〜20-30毫克囊泡使用37℃浴中。
加入1 ml增溶缓冲液II而不CHAPS的10 -毫升烧杯中。
将解冻的囊泡加入含有增溶缓冲液 II（不含 CHAPS）的烧杯中。
使用磁力搅拌器以 300 rpm 的速度搅拌溶液。
小心地将 0.5 ml 2% CHAPS 添加到溶解混合物中，同时继续搅拌。
用封口膜盖住烧杯并在 300 rpm 下搅拌 20 分钟。
离心机的溶解蛋白质在100000 ×克（Beckman Coulter公司的Optima MAX-TL ù ltracentrifuge，转子TLA 100.3）60分钟。
丢弃的沉淀。用稀释缓冲液将上清液稀释 5 倍。
离心该溶液16000 ×克（Eppendorf离心机，型号5415 C）10分钟，并弃去该沉淀。
使用0.45微米的滤器将上清液-连接到注射器微米的过滤器。
将1 - ml StrepTrap 柱(Cytiva) 连接到蠕动泵（图 3）。
用 20 ml 去离子水 (Milli-Q) (1 ml/min) 清洗柱子。
用 20 ml 洗涤缓冲液 I (1 ml/min) 平衡色谱柱。
将重组 SBP-FKBP12.6（1:10 RyR: FKBP12.6 摩尔比）加载到柱子上（0.5 ml/min）。
用 20 ml 洗涤缓冲液I (1 ml/min)洗涤柱子。
将过滤后的溶解 RyR 样品加载到柱子上（0.5 毫升/分钟）。
用 20 ml 洗涤缓冲液I (1 ml/min)洗涤柱子。
用 2 ml 洗涤缓冲液III (1 ml/min)洗涤柱子。
用含有 5 mM 脱硫生物素 (0.5 ml/min) 的 5 ml Elution Buffer II 洗脱样品。
手动的在塑料1.5 4滴（约100微升）的等分试样收集洗脱的级分-毫升离心管（图3）。
确定蛋白质浓度的使用absor在使用NanoDrop 2000分光光度计各馏分bance在280纳米（消光系数2271320中号-1厘米-1为碱受体）。
通过 10% SDS-PAGE （图 4）和负染色 EM （图 5）评估纯化 RyR 的纯度和质量。
在液氮中快速冷冻等分试样并储存在 -80°C 以备后续冷冻电镜网格准备。

笔记

除了所有的程序步骤小号A1，A2，A9，A10，B1，B27-29，C1，和C21- Ç 23在4℃下进行。

食谱

200× 蛋白酶抑制剂 (PI) 鸡尾酒
1 毫克/毫升抑肽酶
1毫克/毫升亮肽素
0.5 毫克/毫升 pefaloc
均质缓冲液
5 mM 咪唑 pH 7.4
10% (w/v) 蔗糖
PI
增溶缓冲液 I
20 mM Na MOPS (pH 7.4)
5% (w/v) CHAPS
1.25% (w/v) PC
1 M 氯化钠
2 毫米 DTT
PI
增溶缓冲液 II
20 mM Na MOPS (pH 7.4)
2% (w/v) CHAPS
0.5% (w/v) PC
1 M 氯化钠
2 毫米 DTT
PI
稀释缓冲液
20 mM Na MOPS (pH 7.4)
0.5% (w/v) CHAPS
0.125% (w/v) PC
2毫米 DTT
PI
洗涤缓冲液I
20 mM Na MOPS (pH 7.4)
0.2 M 氯化钠
0.5% (w/v) CHAPS
0.125% (w/v) PC
2 毫米 DTT
PI
洗涤缓冲液 II
20 mM Na MOPS (pH 7.4)
0.2 M 氯化钠
0.015% (w/v) Tween-20
2毫米 DTT
PI
洗涤缓冲液 III
20 mM Na MOPS (pH 7.4)
0.4 M 氯化钠
0.015% (w/v) Tween-20
2 毫米 DTT
PI
洗脱缓冲液 I
20 mM Na MOPS (pH 7.4)
0.9 M 氯化钠
0.015% (w/v) Tween-20
2 毫米 DTT
洗脱缓冲液 II
20 mM Na MOPS (pH 7.4)
0.4 M 氯化钠
0.015% (w/v) Tween-20
2毫米 DTT
5 mM 脱硫生物素

致谢

这项工作得到了 NIH 的支持（R01 AR068431 和 R01 HL133182）；肌肉萎缩症协会（MDA3 52845 到 MS）；美国心脏协会博士后奖学金（19POST34430178 to KAI）；日本学术振兴会（NK 19K07105，TM 19H03404）；日本医学研究开发机构（NK 的 19ek0109202 和 TM 的 JP20am0101080）；和赛车纪念基金会（到 TM）。该协议被改编，以小的修改S，从由艾耶出版先前的研究等。(2020)。

利益争夺

作者声明没有竞争利益s 。

参考

Cabra, V.、Murayama, T. 和 Samsó, M.（2016 年）。自关联 RyR2s 的超微结构分析。生物物理学杂志110(12): 2651-2662。
Gong, D.、Yan, N.和Ledford, HA (2020)。调节 Ryanodine 受体的结构基础。Trends Biochem Sci S0968-0004(20)30294-2。
Iyer, KA, Hu, Y., Nayak, AR, Kurebayashi, N., Murayama, T. 和 Samsó, M. (2020)。冷冻电镜在等效位点的两个功能获得性心脏和骨骼 RyR 突变的结构机制。Sci Adv 6(31)：eabb2964。
Lee, HB、Xu, L. 和 Meissner, G. (1994)。将骨骼肌兰尼碱受体-Ca 2+释放通道蛋白复合物重建为脂蛋白体。J Biol Chem 269(18): 13305-13312。
Ohi, M.、Li, Y.、Cheng, Y. 和 Walz, T. (2004)。负染色和图像分类 - 现代电子显微镜中的强大工具。生物学在线进行6：23-34。
Samsó , M. (2017)。通过cryoEM 对1 型兰尼碱受体3D 结构的指南。蛋白质科学26（1）：52-68。
Samsó, M.、Wagenknecht, T. 和 Allen, PD (2005)。通过冷冻电镜对 RyR1 钙释放通道跨膜结构域的内部结构和可视化。Nat Struct Mol Biol 12(6): 539-544。
Zissimopoulos, S., Seifan, S., Maxwell, C., Williams, AJ 和 Lai, FA (2012)。哺乳动物心脏中兰尼碱受体和 FK506 结合蛋白的关联差异。J. 细胞科学。125（7）：1759-69。