材料和试剂

50 ml猎鹰管
15毫升猎鹰管
1.5 ml管
组织培养板（12或24孔； Falcon，目录号：353043或353047）
组织培养皿（35×10mm或60×15毫米和100×20毫米，隼，目录NU MBER 小号：353001或353002和353003）
盖玻片（18或12毫米1.5号）
显微镜载玻片（例如Fisher Fisher，目录号：12-544-2）
5 ml FACS管（Fisher Scientific，目录号：149595）
感兴趣的贴壁细胞（例如，小鼠胚胎成纤维细胞[MEF]，HEK293细胞）
SNAP-Cell俄勒冈绿色（New England BioLabs ，目录号：S9104S）
SNAP细胞块（New England BioLabs ，目录号：S9106S）
SNAP-细胞TMR明星（新英格兰生物实验室，目录号：S9105S）
胸苷（Sigma，目录号：T1895）
RO-3306（圣ç 鲁斯乙艾讴，目录号：SC-358700）
诺考达唑（Sigma，目录号：M1404）
延长钻石抗荧光淬灭封固（赛默飞世尔科技，目录号：P36970）
延长钻石抗淬灭封固用DAPI （赛默飞世尔科技，目录号：P36962）
药物用于稳定表达细胞的选择[ 例如，600 - 1200微克/毫升G418（遗传霉素），博来霉素（赛默飞世尔科技，产品目录号：R25001）]
Click- iT TM EdU 细胞增殖试剂盒，用于成像，Alexa Fluor TM 647染料（Thermo Fisher Scientific，目录号：C10340）
pSNAPf 载体（新英格兰生物实验室，目录号：N9183S）
pCCL-CellCycle （Sato et al。，2019）
合适的培养基和补充剂[ 例如，DMEM（Sigma ，目录号：D6429）补充有10％FBS（Atlanta Biologicals，Inc. ，目录号：S11150H）和100 U / m l 青霉素-链霉素（Sigma ，目录号：15140148））]
EDTA，0.5 M，pH 8.0，分子生物学等级（Sigma ，目录号：324506）
HEPES 溶液，1 M，pH 7.0-7.6，无菌过滤（Sigma ，目录号：H0887）
盖玻片涂层溶液，例如0.01％聚L-赖氨酸溶液（Sigma ，目录号：P4707），胶原蛋白涂层溶液（根据制造商的说明，Sigma ，目录号：SAFC-125-50）
无菌1 x PBS pH 7.4，无钙，无镁用于细胞培养（例如，C 序列号：21-031-CV）
10×DPBS，（例如Roche，目录号：11666789001）
32％（wt / vol）多聚甲醛（PFA）（电子显微镜科学，目录号：15714）
！小心：多聚甲醛是危险溶液和交联剂。戴上防护手套并在通风橱中操作。

Triton X- 100,0.1 ％（vol / vol）（Thermo Fisher Scientific，目录号：BD 151500）
无核酸酶的水（Thermo Fisher Scientific，目录号：10977-015）
浸油1.518，对于显微镜/ objec 略去
牛血清白蛋白（BSA）（西格玛（Sigma），目录号：A7030）
SNAP组蛋白表达载体及其稳定表达的细胞系的克隆（请参见食谱）
固定缓冲液（请参见配方）
透化缓冲液（请参见配方）
阻塞缓冲区（请参见食谱）
排序缓冲区（请参见食谱）

设备

涡旋混合器
台式离心机
尖头镊子
水浴
生物罩/生物安全柜（用于细胞培养工作）
细胞培养培养箱适合您选择的细胞培养（例如，37°C，5％CO 2 ）
宽网络视场荧光显微镜（例如，Olymp酒店我们，型号：BX-61，配备˚F 我们的过滤器集DAPI（Semrock ，型号：DAPI-50-60℃零），Cy3的（色度，型号：41007），FITC（Semrock ，型号：FITC-5050A零），和Cy5（小号emrock ，型号：Cy5-4040C零），一个ñEXFO X-引用系列120 PC金属卤化物光源，Photometri CS冷却SNAP HQ CCD照相机，和米olecular设备Metamorph 采集软件或等效的显微镜设置或等效的显微镜系统
流式细胞仪（BD Biosciences，型号：LSR II）

软件

用于图像采集的Metamorph 软件（https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software）
ImageJ的/斐济（Schindelin 等人，2012）（avalable 在https://fiji.sc/）
FlowJo （https://www.flowjo.com/solutions/flowjo/downloads）

程序

该协议包含五个主要过程：（我的SNAP-标记的组蛋白的表达载体和稳定表达细胞系的）代，（ⅱ）细胞周期同步的优化，（ⅲ）d 使用成像，全局和局部组蛋白掺入etection（ⅳ ）d 使用流式细胞仪整体组蛋白掺入etection，（v）的分析。尽管第一个过程（i ）解释了克隆和建立稳定表达细胞系的一般程序，但我们强调了有关如何设计SNAP标记组蛋白表达载体和稳定表达细胞分离的技巧。此协议的主要描述了程序第ë荧光标记方法使用显微镜来研究组蛋白周转（iii）和流式细胞术（ⅳ）（FI 克URE 1）。

D：\ Reformatting \ 2020-6-1 \ 2003151--1462 Hanae Sato 799386 \ Figs jpg \ Fig1 Workflow.jpg

图1 。协议的工作流程。方框显示了管道的三个部分，即构建体的生成，用于成像的样品制备和用于流式细胞术的样品制备。

（我）ģ 的SNAP标签组蛋白表达载体的生成及稳定表达细胞系

带有小表位的蛋白质标签对于在各种生化方法中检测目标蛋白质非常有价值。但是，标记小肽有时会干扰目标蛋白的生物学功能和蛋白的定位。通常，期望测试蛋白质的N-末端或C-末端标签改变其功能。在SNAP标记的组蛋白变体的定位可以用免疫荧光通过比较来确认与内源性组蛋白杂物NT 无论是禄在预期的染色质部位alized。另外，可能有必要测试SNAP标签的构建体是否在染色质中保留其特定功能。

为了确定组蛋白变体的精确周转率，强烈建议生成稳定表达的细胞系，因为当使用瞬时转染的SNAP标记的组蛋白时，有望在有丝分裂后改变表达水平。使用CRISPR / Cas9技术将SNAP-tag序列插入内源性组蛋白基因座是理想的，但不是必需的。SNAP表达载体可从NEB商购，其含有新霉素选择基因。在建立稳定表达的细胞系的过程中，需要滴定细胞中的药物浓度才能分离出阳性细胞。如果您的细胞系已经获得了新霉素抗性，例如用具有新霉素抗性的大T抗原永生化的HEK 293T细胞，则需要更换新霉素选择标记。

SNAP标记的组蛋白的表达水平也可能影响组蛋白掺入的时机。由于组蛋白变体的过表达可能导致不希望的非特异性结合到染色质中，因此建议在进行脉冲追踪实验之前通过荧光激活细胞分选（FACS）分离具有中等至较低SNAP标签组蛋白表达的细胞群。我们还建议在建立细胞系后通过蛋白质印迹法在纯化的染色质组分中测试SNAP组蛋白变体与内源性组蛋白变体的水平。

（ⅱ）ø 细胞周期同步的ptimization

细胞周期同步是使整个细胞群体停滞到特定细胞周期阶段的一种常用方法。大多数细胞周期同步方法依赖于药物的使用，该药物阻断了细胞周期进程所需的特定功能。尽管过去建立了各种细胞周期同步方法（表1 ），但与药物浓度同步的效率可能取决于所用细胞的类型。优化现有药物和新掺入的组蛋白的药物处理和染色方案后，可以在该方案中使用任何细胞同步方法。在这里，我们介绍了在HEK293T细胞中使用双胸腺嘧啶核苷在G1 / S阶段进行同步，并在M2 / G阶段进行有丝分裂摇动以进行同步的协议（图2）。两者都被广泛用作一般的细胞周期同步方法。成功的细胞同步和释放应通过流式细胞术，蛋白质印迹或带有细胞周期指示剂或标记物的免疫荧光（IF）来证实，例如共同表达Fucci 细胞周期报告子（Sakaue-Sawano 等人，2008），用Hoechst进行DNA染色33342，丝氨酸28的抗磷酸化组蛋白3（M期标记）或任何其他细胞周期标记。

D：\ Reformatting \ 2020-6-1 \ 2003151--1462 Hanae Sato 799386 \ Figs jpg \ Fig2单元格和label.jpg的同步

图2 。细胞同步和组蛋白标记的工作流程。显示了细胞同步方法的每个步骤（A. 双胸腺嘧啶核苷和B. 有丝分裂），以及预先标记组蛋白的时间。

表1.用于细胞同步的常用药物清单

名称

相

机制

参考文献

胸苷

G1 / S

过量的胸腺嘧啶核苷对DNA复制的反馈抑制作用

（Whitfield 等，2002）

蚜虫

G1 / S

DNA聚合酶抑制剂α

（Wang，1991年）

羟基脲

G1 / S

核糖核苷酸还原酶抑制剂

（Biegel 等，1987；Gallo 等，198 4 ）

甲氨蝶呤

G1 / S

胸苷生物合成抑制剂

（Yunis 等，1981）

氟脱氧尿苷

G1 / S

胸苷生物合成抑制剂

（韦伯和加森，1983年）

丁酸盐

G1 / S

组蛋白脱乙酰基酶抑制剂

（Lampkin et al。，1971 ; Li，2011 ）

洛伐他汀

G1

导致抑制CDK2活性的CDK抑制剂的积累

（Keyomarsi 等，1991）

诺考达唑

G2 / M

微管聚合的抑制剂

（Hoebeke et al。，1976）

RO-3306

前期

CDK1 / cyclin B1和CDK1 / cyclin A的抑制剂

（Vassilev，2006年）

秋水仙碱

中期

微管中的微管蛋白解聚

（Boquest 等，1999）

（ⅲ）挪威全局和局部组蛋白掺入使用成像的挠度

成像检测的关键步骤是在盖玻片上生长细胞。用于盖玻片的涂覆具体程序可能需要FO ř 不同CE LL类型。在整个过程中，小心处理对于使粘附细胞保持附着在盖玻片上非常重要。具有特定染色质结构的组蛋白变体的定位可以通过在细胞固定后使用IF用所需染色质结构的标记进行共定位分析来解决。在这种情况下，请仔细考虑荧光团的选择和显微镜的滤光片设置，以避免对荧光团进行不兼容的渗漏检测。

在S-G2阶段标记组蛋白掺入● 时间5天
1 将盖玻片放在12孔或24孔板中，并在室温下进行盖玻片（例如0.01％的聚L赖氨酸，0.01％的胶原蛋白）包被1小时。用两次蒸馏水洗涤3次后，将细胞铺在带涂层的盖玻片上，并使细胞生长至少24小时。

2 G1 / S处的细胞同步可使用双胸苷阻断方法进行（Jackman和O'Connor，2001）。必须针对每种细胞类型优化孵育时间和药物浓度。使细胞在G1 / S转换时与2 mM胸腺嘧啶核苷同步处理16 h，从胸腺嘧啶核苷释放9 h，然后再次用2 mM胸腺嘧啶核苷处理17 h。

？故障排除（表2）

表2.故障排除表

步

问题

可能的原因

解

2 5 5

单元不同步

药物浓度或孵育时间未优化。

必须优化药物浓度或孵育时间，或尝试使用其他细胞同步方法。

5、13

单元未从同步释放

药物浓度或孵育时间未优化。

必须优化药物浓度或孵育时间，或尝试使用其他细胞同步方法。

13

细胞未附着在培养皿上

药物浓度或孵育时间未优化。

必须优化药物浓度或孵育时间，或尝试使用其他细胞同步方法。

3 用SNAP-Cell Oregon Green（1 µM）在培养基中在5％CO 2中于37°C孵育30分钟，以对预先存在SNAP标签的组蛋白进行标记。

4 用非荧光SNAP底物封闭SNAP标签的未标记的组蛋白，将SNAP细胞封闭（10 µM）在37°C的5％CO 2 培养基中处理30分钟。

关键步骤：该步骤对于避免对预先存在的组蛋白进行充分的初始标记是很重要的，因为这将导致新结合的组蛋白的检测不准确。

5 添加含有10的培养基 μ中号的的EdU 和10 μ 中号RO-3306孵育12小时，在37℃在5％CO 2 。

？故障排除（表2）

6 使用SNAP-Cell TMR（1 µM）在含RO-3306的培养基中于37°C于5％CO 2 中培养30分钟，以标记新掺入的SNAP组蛋白。

在G1阶段标记组蛋白掺入● 时间5天
为了收集有丝分裂细胞，可以进行有丝分裂摆脱。

7将细胞铺在100毫米的培养皿中。

8 将S / G1边界的细胞与2 mM胸腺嘧啶核苷同步24 h，然后用20-500 nM Nocodazole处理12 h。必须针对每种细胞类型优化孵育时间和药物浓度。

9 使用光学显微镜检查细胞是否形成圆形和附着力弱。

关键步骤：如果单元未形成圆形，则M相位同步将失败。

？故障排除（表2）

10 轻轻摇动培养皿，将有丝分裂细胞收集到1.5 ml Eppendorf管或15 ml F alcon管中。

11 以500 xg 离心细胞4分钟，并用培养基洗涤细胞。

12 用培养基洗涤细胞两次，然后按照步骤1 所述将细胞铺在预涂的盖玻片上。

13 一到两个小时后，检查细胞是否附着在盖玻片上。

关键步骤：电池必须固定在玻璃盖上。如果不是这样，从诺考达唑治疗中释放就不会成功。

？故障排除（表2）

14 用SNAP-Cell Oregon Green（1 µM）在培养基中在5％CO 2中于37°C的条件下，用SNAP-Cell Oregon Green（1 µM）标记预先存在的SNAP标签的组蛋白。

15 用非荧光SNAP底物封闭未标记的SNAP标签组蛋白，SNAP细胞封闭（10 µM）在37 °C的5％CO 2 培养基中30分钟。

关键步骤：该步骤对于避免对预先存在的组蛋白进行充分的初始标记是很重要的，因为这将导致新结合的组蛋白的检测不准确。

16 在37°C的5％CO 2中于培养基中加入10 µM EdU 和2 mM胸腺嘧啶核苷12-18 h 。

17 使用SNAP-Cell TMR（1 µM）在含2 mM胸苷的培养基中于37°C于5％CO 2中标记30分钟，以标记新掺入的SNAP组蛋白。

细胞固定，通透性和Click- it EdU 标记● 时间2天
18 在室温下用固定缓冲液固定细胞15分钟。

暂停点：固定的细胞可以在PBS中于4°C下保存1个月。

！小心多聚甲醛是危险溶液和交联剂。戴上防护手套并在通风橱中操作。

19 用透化缓冲液在室温下透化细胞15分钟。

20使用1x含3％BSA的PBS 封闭细胞1 h，并按照制造商的说明进行点击EdU 标记。

21 （可选）如果需要解决与组蛋白的共定位问题，可以使用所需抗体进行免疫荧光（IF）。但是，需要对显微镜滤光片的设置和波长范围进行谨慎的优化，以避免从同一细胞中共同标记的其他荧光团渗出。

22 用DAPI或Hoechst 33342进行DNA染色。

23 摩盖玻片使用抗时延钻石抗荧光淬灭封固。

使用显微镜进行检测● 时间为1-2天
24 可以使用60 x 1.4 PlanApo 物镜或等效物，通过Olympus BX61宽视野落射荧光显微镜获取图像。DAPI（Semrock ），Cy3（Chroma），FITC（Semrock ）和Cy5（Semrock ）的滤光片组，带有EXFO X-Cite系列120 PC金属卤化物光源，Photometrics Cool SNAP HQ CCD相机，Olympus Type-F浸入式需要使用油（nd 1.516）和Molecular Devices Metamorph 采集软件或等效的显微镜设置。图像可以采取使用0.5光学切片微米Z步长，跨越6〜10.0 微米的总取决于每种细胞类型的厚度Z向深度。È 的10至200倍xposure MS 通常被用于获取所述的Cy3，Cy5的，FITC每个平面和DAPIÇ hannels。

（ⅳ）挪威使用流式细胞术全球掺入挠度

我们还介绍了使用流式细胞仪检测解决全球组蛋白更新的协议。尽管这种方法可以确定整体组蛋白动力学，但它无法在特定的基因组位点或染色质结构上检测组蛋白动力学。

组蛋白掺入的标签
25 在35毫米或60毫米的皿中的12个中散布细胞。

26 通过双胸腺嘧啶核苷使细胞在G1 / S转变处同步。简而言之，用2 mM胸腺嘧啶核苷处理细胞16小时，用1 x PBS 洗涤3次，并通过更换培养基9 h从胸腺嘧啶核苷中释放出来，并再次用2 mM胸腺嘧啶核苷处理17 h。

27 用SNAP-Cell Oregon Green（1 µM）在培养基中在5％CO 2中于37°C放置30分钟的标签，将预先存在SNAP标签的组蛋白标记。

28 在37°C的5％CO 2 中的培养基中，用SNAP细胞块（10 µM）处理细胞30分钟，以掩盖不存在SNAP标记的组蛋白对非荧光SNAP底物的标记不足。

关键步骤：该步骤对于避免对预先存在的组蛋白进行充分的初始标记是很重要的，因为这将导致新结合的组蛋白的检测不准确。

29 从细胞同步中释放6个培养皿，以检测12到22小时的时间点。保持同步其他6道菜以检测2到12小时的时间点。

30 孵育细胞12小时。

31 从细胞同步中释放其他6个培养皿，以检测2到12小时的时间点。

每2 h收获32个细胞，并将细胞储存在-80°C下。

暂停点：冻结的培养基和协议取决于细胞类型。

33 解冻细胞，并用预热的培养基洗涤一次。

34 通过将含有SNAP-JF646（1 µM）的培养基添加到细胞沉淀中，标记新掺入的SNAP组蛋白。吸移细胞并在37°C水浴中孵育30分钟。

35 在室温下将细胞以500 xg离心4分钟，并用预热的培养基洗涤两次。

36 （可选）检测细胞周期的染料（例如，Hoechst 33342）也可以替代Fucci 细胞周期指示剂。

37 使用流式细胞仪检测俄勒冈绿色（已有组蛋白），JF646（新加入的组蛋白），mCherry （S-G2期细胞周期指示剂）和TagBFP （G1期细胞周期指示剂）的表达水平

方框1.手动成像分析全球现有和新合并的组蛋白的工作流程（另请参见图3）

D：\ Reformatting \ 2020-6-1 \ 2003151--1462 Hanae Sato 799386 \ Figs jpg \ Fig3成像分析工作流程.jpg

图3.成像分析工作流程。显示了成像分析的概述，以检测预先存在的，新引入的组蛋白的强度，核染色（例如，DAPI 和Hoechst 33342）和EdU （S相标记）。

使用batch处理功能将所有图像集处理为最大强度Z投影，如下所示：
处理/批处理/宏。
在“输入...”中选择输入文件夹。
在“输出...”中选择输出文件夹。
（Ø 在ptional）将特定的名称为“文件名包含：”如果选择的文件夹需要特定的文件进行处理。
输入宏代码“ run（“ Z Project ...”，“ projection = [Max Intensity]”）;“ 在脚本框中。
点击“处理”。
可以按以下方式进行手动处理：

通过将文件拖到FIJI 的主界面中或以下方式来打开四个图像：
File / Open / ，然后选择您的图像。

图像/堆栈/ Z项目/ ，然后选择投影类型“最大强度”。
定义目标区域（ROI），以通过使用核染色（如DAPI的DNA染色）制作掩模来测量先前存在的和新结合的组蛋白的强度，以及EdU 结合的强度。
复制显示DNA染色的图像，例如DAPI。

选择复制的DAPI 通道映像。
图片/副本...
使用核染色强度定义核区域。

图像/调整/阈值；然后选择合适的阈值方法（可以选择默认值作为开始），选中“深色背景” 并应用。
处理/二进制/转换为遮罩。
（可选）处理/二进制/填充孔。
（可选）流程/二进制/分水岭（https://imagej.net/Nuclei_Watershed_Separation）。
分析/设置测量值，检查“面积”，“平均灰度值” 和“显示标签”，然后单击确定。
分析/分析粒子，在“大小（pixel ^ 2）” 和“圆度”中添加适当的数字以完成适当区域的选择，选中“ 添加到管理器” ，然后单击确定。
使用目标区域（ROI）在遮罩区域中测量DAPI 信号（DNA）。
选择频道图片。
在ROI Manager中单击“ 测量” 。
使用ROI测量俄勒冈州的绿色信号（预先存在的组蛋白）。
选择俄勒冈绿色通道图像。
在ROI Manager中单击“ 测量” 。
使用ROI测量TMR-STAR信号（新加入的组蛋白）信号。
选择“ TMR-STAR”频道图像。
在ROI Manager中单击“ 测量” 。
使用ROI 测量EdU 信号（新生DNA）。
选择的EdU Ç hannel图像。
在ROI Manager中单击“ 测量” 。
保存结果并进行分析。

的BOX 2.分析工作流局部预先存在的，并使用颜色分析器或分析器RBG新掺入的组蛋白（小号EE也图5A）

在Fiji / ImageJ软件中安装插件。
通过将文件拖到FIJI 的主界面中或以下方式来打开所有要比较的图像集：
File / Open /，然后选择您的图像。

将这些图像合并为一个图像。
图像/颜色/合并通道。

将图像类型更改为RGB颜色。
图像/类型/ RGB颜色。

进行线条制作轮廓。
选择线工具。
排队。
插件/ RGB Profiler 。

影像分析（约1周）

步骤1-6，使用双胸腺嘧啶核苷和标记预先存在的组蛋白进行细胞同步以进行成像分析：4天。

步骤7-17，使用有丝分裂摇动细胞同步，并标记先前存在的和新掺入的组蛋白进行成像分析：4天。

步骤18-19，细胞的固定和通透性：1 h 。

步骤20，使用点击工具包标记EdU ：1 h 。

步骤21，（可选）IF使用所需抗体确定特定染色质结构或因子下的组蛋白沉积：3 h 。

步骤22-23 ，DNA染色和盖玻片：隔夜。

步骤24，显微镜成像：1天。

流式细胞仪分析（约1周）

步骤25，使用双胸腺嘧啶阻断剂扩散细胞并同步细胞，并标记预先存在的组蛋白：4天。

步骤32，从细胞同步释放并收获细胞：2天。

步骤s 34-37，新合并细胞的标记和流式细胞仪分析：2 h 。

数据一nalysis

我们介绍了使用FIJI / ImageJ（一种免费的开源图像处理软件包）进行成像的基本分析流程。如果您熟悉编程，那么使用ImageJ宏代码进行的自动分析将为大型数据集节省时间。此外，许多其它的成像处理方案（例如，Matlab的）可以是也有很大的选项处理巨大的数据集。

使用流式细胞仪，例如LSR II（BD Bioscience），可以轻松完成使用流式细胞仪检测进行全局组蛋白更新的数据分析。FlowJo （BD Bioscience）等软件可以评估FCS数据集并允许可视化复杂的细胞计数数据集。在此协议中，我们可以使用整个细胞群体中具有单个细胞分辨率的荧光团总强度的平均值或中值来研究组蛋白掺入和沉积的时间。在此方案中显示通过标记预先存在的和新掺入的组蛋白以及细胞周期标记物标记的荧光强度的直方图，可以帮助可视化全局组蛋白动力学的时间，包括解散先前存在的组蛋白和合并新合成的组蛋白。细胞周期。

预期结果

在此协议中，我们总结了先前发表的关于HEK293T细胞中组蛋白H3.1和macroH2A1.2的细胞周期特异性动力学的结果，以表明SNAP标记脉冲追踪系统可靠地工作，并说明了如何分析成像数据集（Sato 等人，2019）。

尽管我们在此方案中说明了三个部分（图1 ），包括构建体的生成，用于成像的样品制备和用于流式细胞术的样品制备，但我们主要描述了后两个的详细方案。我们还将说明如何使用ImageJ / FIJI分析成像数据集（图3 和方框1 ）。在这里，我们介绍了使用成像方法检测SNAP组蛋白H3.1（图4 ）的细胞周期中SNAP脉冲追踪检测的示例。我们展示了两种类型的细胞同步性，双胸苷阻滞和有丝分裂摆脱，以调查在S-G2或G1期的组蛋白掺入和解离。如图4A-4B所示，在HEK 293T中稳定表达的先前存在的和新掺入的SNAP-H3.1进行了标记。还执行了EdU 单击检测以确认成功的单元同步。单个细胞中的整体组蛋白掺入率取决于新掺入的组蛋白（TMR-Star）的像素强度平均值，该平均值通过细胞核中先前存在的组蛋白（俄勒冈州绿）的像素强度平均值进行标准化。使用这种方法，我们在S-G2阶段检测到H3.1掺入，这被称为DNA复制依赖性沉积（图4C-4D ）。

我们还说明了使用RGB Profiler在成像分析中共定位的检测（图5A 和方框2 ）。在这里，我们在HEK在293T灭活X染色体（Xi）的C存在新掺入的macroH2A组蛋白变体的共定位厄尔（图小号5A-5B ）。如图4A 所示标记先前存在的和新掺入的SNAP-macroH2A1.2，并且通过与先前存在的SNAP-macroH2A1.2共定位来确定Xi中SNAP-macroH2A1.2在细胞周期中的掺入。如图5B 所示，在G1阶段将macroH2A1.2结合到Xi中。

整体组蛋白的结合和解离也可以通过流式细胞仪检测。我们展示了SNAP-macroH2A1.2脉冲追踪方法，并通过流式细胞仪检测了全球SNAP-macroH2A动态，如图5C-5D所示。在这里，我们同步了G1 / S边界处的细胞，并用俄勒冈绿色标记了先前存在的SNAP-macroH2A1.2，然后从细胞同步释放后每两小时检测到新并入的SNAP-macroH2A1.2。尽管我们使用Fucci 细胞周期传感器确定了细胞周期的过渡（图5C [ 两个右图] 和5D [ 顶部] ），但也可以选择其他细胞周期指示剂，例如Hoechst 33342 DNA染色（图6 ）。直方图显示细胞群体的荧光强度。先前存在的SNAP-macroH2A1.2（俄勒冈绿色，图5C [ 左] 和5D [ 中] ）的信号强度转变表明，当细胞进入有丝分裂时，信号强度下降，但是几乎没有SNAP-macroH2A与染色质解离在整个细胞周期中新合并的SNAP-macroH2A1.2（JF646，图5C [ 左下] 和5D [ 下] ）的过渡。

D：\ Reformatting \ 2020-6-1 \ 2003151--1462 Hanae Sato 799386 \ Figs jpg \ Fig4 Histone detection.jpg

图4.在特定细胞周期中检测整体先前存在的和新掺入的组蛋白H3.1。A. 在BD中分析S / G2和G1相标记组蛋白的图解。（左图）为了标记新掺入的S / G2相中的组蛋白，稳定表达SNAP标签的H3的HEK 293T细胞在G1 / S相边界处被双胸腺嘧啶核苷同步化，如TH所示。预先存在的组蛋白用SNAP-俄勒冈绿色（绿色箭头）标记，随后使用非荧光SNAP-Block试剂封闭，以避免标记不足。使细胞从同步释放，前进到G2 / M转变，直到使用RO-3306（CDK1 / cyclin B1和CDK1 / cyclin A抑制剂，显示为RO）在G2 / M边界同步，然后重新整合SNAP标记的组蛋白用SNAP-TMR Star（红色箭头）标记。（右图）为检测G1期新掺入的组蛋白，在诺考达唑处理12小时后通过摇晃收集有丝分裂细胞，并铺在盖玻片上（显示为Noc ）。后2 小时，预先存在的SNAP-H3分别标记有俄勒冈绿和与阻挡试剂处理。从同步释放细胞，并使用双胸腺嘧啶阻断进行到G1 / S过渡，然后用SNAP-TMR Star标记新掺入SNAP标签的组蛋白。从第一次同步释放后，还用EdU 处理细胞，直到第二次同步，从而鉴定出已进行DNA合成的细胞。B. S / G2或G1阶段中已存在和新合成的带有SNAP标签的H3.1的代表性图像。标度b ar = 10 µm。图像分析显示在S-G2相（CD ）期间组蛋白H3的掺入率更高。C. 在S-G2和G1细胞周期阶段中组蛋白结合率的频率分布。组蛋白掺入率是通过在S / G2和G1阶段中核中红色（新掺入的组蛋白）的平均像素强度和绿色（已存在的组蛋白）的平均像素强度进行归一化计算的。EdU 标记确认单元同步成功。在以下分析中，进行了Hoechst 33342标记以定义核的面积。D. 在S-G2和G2阶段中组蛋白掺入率的定量。每个点表示来自单个细胞的掺入率，如图4C中所述。误差线表示与单个单元格数量的一个标准偏差（n =每个数据集上指示的数量。* P < 0.0001。P 值是使用两尾不成对t 检验确定的。

D：\ Reformatting \ 2020-6-1 \ 2003151--1462 Hanae Sato 799386 \ Figs jpg \ Fig5 mH2A local incorporation2.jpg

图5.在特定细胞周期中检测局部和全局预先存在的和新掺入的组蛋白macroH2A1.2。A. 使用RBG Profiler插件（https://imagej.nih.gov/ij/plugins/rgb-profiler.html，Color Profiler插件（https://imagej.nih.gov/ij/plugins/ color-profiler.html）还提供了相同的功能），以解决新合并的组蛋白与预先存在的组蛋白的共定位问题。也可以通过使用IF检测染色质结构来解决特定染色质结构上细胞周期特异性组蛋白的掺入。在这里，我们展示了检测与现有和新加入的组蛋白共定位的示例。B. 使用Cell Profiler进行图像分析的示例。在S-G2（上部）和G1（下部）阶段中，将预先存在的（俄勒冈绿色：绿色），新合并的（TMR：红色）SNAP标签的macroH2A的左侧图像合并为单个图像，并在两个非活动X上进行共定位在HEK 293T细胞中确定了染色体（Xi）。在右上方和右下方的面板中，显示了沿既有图像和新合并图像中的白线测量的信号强度。C. 现有细胞（左：俄勒冈州绿）和新整合的macroH2A（左第二：JF646），S-G2（右第二：mCherry 标记的hGeminin ）和G1（右：TagBFP 标记的hCdt1）细胞的流式细胞仪分析循环标记来自Fucci 传感器。直方图表示从G1 / S边界同步释放后的每个时间点（2-22小时）的荧光强度。从Fucci 细胞周期传感器估计每个时间点的细胞周期。D. 之前存在的（中间：俄勒冈州绿色）和新加入的macroH2A（底部：JF646）以及S-G2和G1（顶部：mCherry 标签的hGeminin 和TagBFP 标签的hCdt1）的荧光强度的中值绘制流式细胞仪分析。误差线表示95％的置信区间。

D：\ Reformatting \ 2020-6-1 \ 2003151--1462 Hanae Sato 799386 \ Figs jpg \ Fig6 Hoechst.jpg

图6 。使用Hoechst 33342染色和流式细胞术检测确定细胞周期。A. 如步骤25-36所述，对细胞周期（左：Hoechst 33342）和已存在并标记并从细胞同步释放的SNAP-macroH2A（右：俄勒冈绿色）进行流式细胞仪分析。直方图表示从G1 / S边界同步释放后的每个时间点（2-22 h）的荧光强度。每个时间点的细胞周期可以通过细胞群中Hoechst 33342的强度转变来确定。B. 绘制流式细胞术分析的DNA染色的荧光强度的中值（上图：Hoechst 33342）和预先存在的SNAP-macorH2A1.2（中：俄勒冈州绿）。误差线表示95％的置信区间。

菜谱

SNAP组蛋白表达载体的克隆及其稳定表达的细胞系
需要通过常规克隆方法克隆编码带有SNAP标签的所需组蛋白的质粒。pSNAPf 载体（NEB的产品目录号N9183S）可用于建立您的构建体并稳定表达细胞系，因为它含有新霉素抗性基因，可进行有效的药物选择。

固定缓冲液
1 x PBS中4％（wt / vol）PFA

注意：该溶液可以由32％（wt / vol）PFA 制备。避光长达2年。

通透缓冲液
0.5％Triton在1 x PBS中

阻塞缓冲区
1 x PBS中的3％BSA

排序缓冲区
1毫米EDTA

25 mM HEPES pH 7.0

1 x DPBS中的1％FBS（热灭活）

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助R01 DA030317（JMG）的支持。我们感谢Greally 和Singer实验室的成员进行的讨论，爱因斯坦FACS和Genomics核心。我们也感谢L. Lavis 的SNAP-JF646。该协议是从以前的工作中采用的（Sato et al。，2019）。

作者贡献声明：HS设计并进行了实验并分析了数据。HS，JMG和RHS撰写了手稿。JMG和RHS监督了这项研究。

利益争夺

作者宣称没有相互竞争的经济利益。

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