材料和试剂

1. 透明指甲油（任何品牌）

2. 显微镜载玻片存放盒（任意品牌）

3. 剃须刀片（任何品牌）

4. 2 mm玻璃珠（Sigma，产品编号：Z273627）

5. 微量离心管（Sigma，目录号：CLS320）

6. Kimwipes公司

7. 胰岛素注射器，29规格，0.5毫升容量，12.7毫米针长（BD，目录号：324703）

8. 中型冷冻模具（Tissue-Tek，目录号：AGG4582）

9. 22 x 50 mm矩形1½盖玻璃（康宁，产品编号：2980-225）

10. Superfrost Plus显微镜载玻片（Fisherbrand，目录号：12-550-15）

11. C57BL/6J小鼠，雌性，8周大（杰克逊实验室，目录号：000664）

12. 70%乙醇

13. Epsilon protoxin（生物防御和新兴感染研究资源库，目录号：NR-856），储存温度-80°C

14. 固定化TPCK胰蛋白酶树脂（Thermo Scientific，目录号：20230），4°C下储存

15. 磷酸二氢钠脱水剂（西格玛，目录号：71505）

16. 无菌生理盐水溶液：0.9%氯化钠溶液，10毫升小瓶，单剂量，用作无菌稀释剂（Hospia，Inc.），室温下储存

17. FITC Na（荧光素钠盐）（Sigma，目录号：F6377），在室温下避光保存

18. 70 kDa FITC葡聚糖（平均分子量为70000 Da的异硫氰酸荧光素葡聚糖）（Sigma，目录号：46945），储存于4°C避光

19. BSA-594（来自牛血清的白蛋白），Alexa Fluor 594偶联物（Thermo Fisher Scientific，目录号：A13101），保存在4°C避光保存

20. PBS（Invitrogen，目录号：AM9625），室温储存

21. 甲苯噻嗪和氯胺酮鸡尾酒，从机构研究和动物资源中心或同等机构获得

22. Tissue Tek®OCT化合物（Sakura Finetek，目录号：4583），室温下储存

23. 颗粒和碎/粉状干冰

24. PBS（Boston BioProducts，目录号：BM-155）中的4%多聚甲醛（PFA），短期储存在4°C，长期储存在-20°C

25. Triton X-100（西格玛，目录号：T-8787）

26. 兔抗PDGFRβ抗体（Abcam，目录号：ab32570）

27. FITC-BSL1：荧光素标记的Griffonia（Bandeiraea）Simplicifolia凝集素I（GSL I，BSL I），（矢量实验室，目录号：F-1101），4°C避光保存

28. 带有DAPI的防褪色安装介质（Vectasheild，目录号：H-1200），储存于4°C避光

29. Trizma Base（Sigma，目录号：T1503）

30. 蛋白酶K（QIAGEN，目录号：19131），室温保存

31. EDTA（西格玛，目录号：EDS）

32. 甘油（Sigma，目录号：G5516）

33. 胎牛血清（FBS）（西格玛，目录号：F4135）

34. 胰蛋白酶消化缓冲液（见配方）

35. 6 mg/ml FITC Na溶液（见配方）

36. 20 mg/ml 70 kDa FITC葡聚糖溶液（见配方）

37. 1.5 mg/ml BSA-594（见配方）

38. 1x PBS（见配方）

39. PBS中30%蔗糖（任何品牌）溶液，在4°C下储存长达四周（见配方）

40. 抗体稀释剂（见配方）

41. Cy3结合亲和山羊抗鼠IgG（H+L）（Jackson Immunology Research Laboratories，目录号：115-165-003），在-20°C下储存（见配方）

42. FITC结合亲和驴抗兔IgG（H+L）（杰克逊免疫研究实验室，目录号：711-095-152），储存于-20°C（见配方）

43. 蛋白酶K抗原回收液（见配方）

设备

1. -80°C冷冻机

2. 台式微型离心机（Beckman Coulter，型号：Microfuge 18离心机，目录号：367160）

3. 振动管和旋转器（Thermo-Scientific，型号：4002110Q）

4. 心内灌注和脑收获手术设备（Gage等人，2012年；Sultan，2013年）

5. 可测量微克的分析天平（Sartorius，目录号：CPA22202S）

6. 台式涡流机（科学工业，目录号：（G560）SI-0236）

7. 可容纳15ml锥形管的离心机（Eppendorf，型号：5810R，目录号：022625101）

8. 分光光度计（Eppendorf，型号：Biophotrometer Plus，目录号：6132）

9. 试管（紫外试管）（Eppendorf，目录号：952010069）

10. 经心灌注仪（Gage等人，2012年）

11. 泡沫塑料冷却器或同等容器，用于盛装干冰

12. 不锈钢托盘或可装入盛放干冰的容器中的同等物

13. 滑梯加热器（马歇尔科学公司，型号：26020）

14. 低温恒温器（徕卡，型号：CM3050 S）

15. 荧光显微镜，带绿色（FITC）、红色（Cy3）和蓝色（DAPI）通道和摄像头（蔡司Axioskop2 Plus立式显微镜和Spot RT3摄像头，配有Spot RT3摄像头和Spot成像软件）

软件

1. Spot成像软件

2. Adobe Photoshop软件

程序

A、 ETX激活

1. 激活ETX时使用BSL2预防措施。

2. 在室温下解冻一小瓶epsilon protoxin（500μl/瓶）。epsilon原毒素浓度为0.5mg/ml或15μM。

3. 准备胰蛋白酶树脂。

a、通过旋涡或吸管使树脂再悬浮。

b、将125μl胰蛋白酶树脂转移到微离心管中。

c、用消化缓冲液洗涤胰蛋白酶。

i、向试管中加入500μl消化缓冲液。

二。在18000 x g下离心10分钟。

iii.去除上清液并丢弃。

d、重复两次，共洗三次。

4. 将500μl解冻的epsilon原蛋白转移到洗涤的胰蛋白酶树脂中。通过上下吸管小心地悬浮树脂。

5. 在37°C下培养两小时，用摇管器和旋转器轻轻搅拌。

6. 培养后，在18000 x g下离心10分钟。

7. 将400μl上清液转移到新的微型离心管中，并丢弃残留物和树脂颗粒。上清液含有活化的ETX。

8. 将小份活化的ETX制成10或20μl的等分试样，并在-80°C下储存长达6个月。

9. 活化的ETX浓度估计为337μg/ml或11μM（基于epsilon-protoxin浓度和体积稀释）。

注：我们建议通过对ETX敏感细胞（如MDCK或CHO-rMAL细胞）的细胞死亡试验来检测每个激活的ETX小瓶，以确认活化和ETX的效力(肖特等人，2000年;). 33kDaε原蛋白完全裂解为29kDa活性毒素也可以通过western印迹分析进行评估().

B、 ETX诱导的BBB渗透率

笔记：

a。在我们的实验中，通过腹腔注射（IP）的致死剂量为每克体重小鼠5 ng ETX（5 mg/kg），用活化的ETX处理小鼠，诱导BBB通透性。这种剂量通常会在1-3小时内引起垂死症状，但可能取决于小鼠的劳损、体重、年龄和性别。当雌性C57BL/6小鼠（8周龄，18-20g）每克体重小鼠用5ng ETX治疗时，我们在ETX治疗后1小时出现BBB通透性轻度症状。轻度症状包括活动减少；特别是，与对照组相比，小鼠较少探索笼子和周围环境。ETX治疗后约3小时，症状变得垂死。垂死的症状包括严重的抑郁/嗜睡和偶尔的抽搐。经历严重抑郁/嗜睡的老鼠，如果轻轻推推，将不会移动，只有在手动控制下才会表现出逃跑行为。值得注意的是，我们从来没有观察到老鼠使用这种剂量后从轻微症状中恢复过来。所有表现出轻微症状的老鼠最终都会奄奄一息。因此，有症状的老鼠，即使是症状轻微的老鼠，也需要仔细观察。我们建议研究人员对自己的小鼠群体进行初步实验，以确定最佳的ETX治疗时间。

b。为了获得最一致和可比较的结果，我们建议使用体重相似的小鼠，最好在2克范围内。ETX剂量是基于整个动物的体重，所以用相似体重的动物治疗可以确保ETX总剂量的一致性。

1. 使用ETX时使用BSL2预防措施。

2. 在无菌生理盐水中制备500 ng/ml ETX工作液。在室温下解冻活化ETX的冷冻小份，并在无菌生理盐水中稀释1:674（337μg/ml储备液除以500 ng/ml工作液）。

3. 在治疗前，给每只老鼠称重。

4. 对于ETX治疗，使用29号胰岛素注射器，通过IP注射将每克体重的ETX注射到无菌生理盐水中5 ng。简单地说，用一只手抑制老鼠，用拇指和食指抓住颈背周围多余的皮肤，并将尾巴放在第三和第四个手指之间。把动物的头向下倾斜45度。在腹部右下象限，将注射器与身体呈90度角插入，并给药。有关如何执行IP注入的更详细说明，请参阅以前发布的方法（）。Machholz等人，2012年

例如，通过注射200μl 500 ng/ml的ETX溶液，一只20g小鼠将获得总共100ng的ETX。

a、 20 g小鼠乘以每克小鼠5 ng ETX=100 ng总ETX

b、 100 ng总ETX除以500 ng/ml=200μl 500 ng/ml ETX溶液

5. 对照治疗，通过IP向小鼠注射等量的无菌生理盐水。

6. 观察小鼠的濒死症状。最常见的症状是严重的抑郁/嗜睡。经历过严重抑郁/嗜睡的老鼠，如果轻轻地推着，就不会移动，只有在被手动控制时才会表现出逃跑行为。

C、 FITC-Na法评价BBB渗透率

注：本实验评估BBB对376Da及以下物质的渗透性。这项技术还可以相对容易地评估BBB对整个大脑的通透性，而无需经心灌注或组织切片。然而，这项技术不能确定BBB通透性的具体神经解剖位置。该方法也适用于其它FITC共轭示踪剂的应用。

1. 治疗前准备和组织收获

a、本实验在动物解剖区附近设置分析天平，称船方便。

b、准备15毫升锥形管，其中含有大约10-15个2毫米的玻璃珠和1毫升多溴联苯。为每只动物准备一根管子。在室温下储存。

c、在无菌生理盐水中制备6 mg/ml FITC Na溶液。FITC Na溶液应每天新鲜制备，并储存在室温下避光的容器中。

d、在PBS中用以下浓度创建FITC-Na标准曲线：6μg/ml、3μg/ml、1.5μg/ml、0.75μg/ml、0.375μg/ml、0.186μg/ml和0.094μg/ml。使用分光光度计在490nm或同等条件下测量并记录每个标准品的吸光度。每天应使用新制备的6 mg/ml FITC Na溶液生成新的标准曲线。

2. 给小鼠注射FITC-Na

a、如上文所述，用ETX治疗小鼠达到所需的时间。

b、使用6mg/ml的FITC-Na溶液，使用29号胰岛素针通过尾静脉向小鼠静脉注射每克体重60μg的FITC-Na。简单地说，把动物放在一个圆柱形的约束管里。温暖整个动物或尾巴以扩张尾部血管。将针头插入尾静脉外侧近三分之一处。慢慢注入材料。如果针头已正确插入静脉，则在压下柱塞和注入溶液时不会产生阻力。另外，由于静脉注射的是暂时性的血液，所以应该在静脉注射。有关如何进行静脉注射的更详细说明，请参阅以前发布的方法（）。Gage等人，2012年

例如，一只20g的小鼠通过注射200μl 6 mg/ml的FITC-Na溶液，将获得总共1.2mg的FITC-Na。

i、 20 g小鼠乘以每克小鼠60μg FITC-Na=1.2 mg总FITC-Na

二。1.2 mg总FITC Na除以6 mg/ml FITC Na溶液=200μl 6 mg/ml FITC Na溶液

c、给药后观察动物10分钟。

d、用29号胰岛素针注射致死剂量的甲苯噻嗪和氯胺酮鸡尾酒（450 mg/kg和45 mg/kg）对动物实施安乐死。麻醉剂的致死剂量通常是手术剂量的三倍。在我们手中，死亡通常发生在给药后30分钟。值得注意的是，作为安乐死的一种方法，二氧化碳给药不适用于BBB通透性研究，因为二氧化碳会导致BBB通透性（和1958年）。克莱梅德森等人，1956年

3. FITC Na测量

a、在老鼠过期（没有心跳）后，让动物在断头之前“休息”5分钟，以防止失血。

b、在老鼠身上喷70%的乙醇以弄湿皮毛。

c、将老鼠斩首，取出整个大脑。有关如何进行大脑解剖的详细说明，请参阅以前出版的方法（）。苏丹，2013年

d、将一个新的称重船放在分析天平上，给仪器去皮或调零。

e、将整个大脑转移到分析天平上称船的重量，并记录采集的大脑的重量。

f、用一把新鲜的剃须刀，将脑组织切成大约1-2毫米的小块，然后转移到含有玻璃珠和1毫升多溴联苯的15毫升锥形管中。在室温下保存，直到所有的大脑都被收获。

g、固定锥形盖，并在顶部设置剧烈涡流两分钟。

h、对所有剩余的动物重复上述步骤。

i、离心15毫升锥形管（含1500 x g均质大脑）10分钟，制成小球。

j、将上清液转移到微离心管中，并在18000 x g下离心以清除细胞碎片。

k、将清除的上清液转移到新的微离心管中。

l、使用分光光度计在490 nm或同等条件下测量清除上清液的吸光度。

m、使用先前生成的FITC-Na标准曲线计算清除上清液中FITC-Na的浓度。

n、将上述步骤中计算出的FITC-Na浓度除以收获脑的重量（μg/ml/brain），计算出每克收获大脑的FITC-Na含量。

o、或者，可以将结果标准化为对照治疗小鼠，并表示为FITC-Na外倾（%CT）（图2A）。

例如，因为我们的实验持续了好几天，而且每天都需要准备一个新鲜的FITC-Na溶液，所以每个ETX治疗的小鼠都与同一天进行的盐水处理的对照动物相匹配。每个ETX处理小鼠的FITC Na浓度标准化（除以）为其盐水处理对照组的FITC Na浓度。盐水处理的对照组小鼠被正常化（分成）到自己身上。以百分比表示结果，并计算每个治疗组的平均值和标准差。

或者，如果所有动物都在同一天进行处理，则计算对照组的平均FITC-Na浓度（μg/ml/脑）。将对照组和ETX治疗组的每个值标准化（除以）平均控制值。以百分比表示结果，并计算每个治疗组的平均值和标准差。

图2。使用所述方法对BBB渗透率进行代表性评估。结果转载自Linden等人，2019年。如前所述，用ETX或生理盐水（CT）治疗小鼠。A、以FITC-Na为示踪剂评价BBB通透性，然后用分光光度法进行脑匀浆和FITC-Na测定。*结果用平均值±STDEV表示，P<0.05，采用非配对t检验。B、使用70 kDa FITC葡聚糖和荧光显微镜获得的BBB通透性显微照片。断面距中矢状面左侧约1.5毫米。虚线表示胼胝体。OB，嗅球。CB，小脑。C、内源性IgG（红）染色观察BBB通透性的显微照片。PBS的矢状切面仅灌注动物。FITC-BSL1（绿色）用于识别微血管。虚线表示胼胝体的宽度。白色箭头表示大血管无明显IgG外渗。白色箭头表示大血管周围有IgG外渗区域。D、用荧光强度法半定量测量对照组和ETX处理小鼠的IgG外渗。*结果用平均值±标准偏差表示，P=0.05，通过非配对t检验确定。

D、用70kda-FITC葡聚糖评价BBB的渗透性

注：使用外源性70 kDa FITC葡聚糖作为BBB渗透性研究的示踪剂，评估70 kDa或更少材料的外渗。不同分子量（4000、40000和150000 kDa）的FITC葡聚糖也可用于本程序。FITC公司-右旋糖酐不能被PFA固定，因此不建议用这种示踪剂进行心脏灌注。此外，我们建议在不使用固定剂、染色程序或安装介质的情况下对组织切片进行“干燥”成像，因为使用任何水性材料或溶剂都可能导致示踪剂的浸出(Hoffmann等人，2011年). 虽然这只是一种测量BBB通透性的定性方法，但它能很好地识别BBB通透性的特定神经解剖位置。在对照组织中，70 kDa的FITC右旋糖酐应局限于血管腔，在已知BBB通透性的神经解剖区域有一些外渗。在功能失调的BBB活动的大脑中，70kda的FITC葡聚糖大量积聚或“晕”出现在脑实质中，被认为是BBB通透性的标志。

1. 治疗前准备和组织收获：

a、在无菌生理盐水中制备20 mg/ml 70 kDa FITC葡聚糖。在4°C下储存一个月，并避光。给动物服用前，将溶液预热至室温或37°C。

b、在使用前，通过在容器中的干冰颗粒上预冷金属板至少20分钟，准备冷冻收获的大脑材料。

c、如有必要，压碎干冰颗粒，制成干冰粉，并储存在容器中直到使用。

2. 70 kDa FITC葡聚糖注射小鼠

a、如上文所述，用ETX治疗小鼠达到所需的时间。

b、使用29号胰岛素针和20 mg/ml 70 kDa FITC葡聚糖溶液，经尾静脉静脉静脉注射，每克体重服用0.2 mg 70 kDa FITC葡聚糖溶液。简单地说，把动物放在一个圆柱形的约束管里。温暖整个动物或尾巴以扩张尾部血管。将针头插入尾静脉外侧近三分之一处。慢慢注入材料。如果针头已正确插入静脉，则在压下柱塞和注入溶液时不会产生阻力。此外，静脉注射时应暂时清除血液。有关如何进行静脉注射的更详细说明，请参阅以前发布的方法（）。Machholz等人，2012年

例如，20 g小鼠通过注射200μl 20 mg/ml 70 kDa FITC右旋糖酐溶液，可获得总共4 mg的70 kDa FITC葡聚糖

i、 20 g小鼠乘以每克小鼠0.2 mg/ml 70 kDa FITC葡聚糖=4 mg总70 kDa FITC葡聚糖

二。4 mg总70 kDa FITC葡聚糖除以20 mg/ml 70 kDa FITC葡聚糖溶液=200μl 20 mg/ml 70 kDa FITC葡聚糖溶液

c、给药70 kDa FITC葡聚糖后观察动物10分钟。

d、用29号胰岛素笔注射致死剂量的甲苯噻嗪和氯胺酮鸡尾酒（450 mg/kg和45 mg/kg）对动物实施安乐死。麻醉剂的致死剂量通常是手术剂量的三倍。在我们手中，死亡通常发生在给药后30分钟。值得注意的是，作为安乐死的一种方法，二氧化碳给药不适用于BBB通透性研究，因为二氧化碳给药可导致BBB通透性（和1958年）。克莱梅德森等人，1956年

3. 大脑收获和冷冻

a、老鼠过期后（没有心跳），让动物在断头前“休息”5分钟，以防止失血。

b、在老鼠身上喷70%的乙醇以弄湿皮毛。

c、将老鼠斩首，取出整个大脑。有关如何进行大脑解剖的详细说明，请参阅以前出版的方法（）。苏丹，2013年

d、在贴有标签的低温模具底部涂上一层薄薄的OCT介质。

e、轻轻地将大脑转移到OCT内衬的冷冻模具中，腹侧朝下。

f、在避免气泡的同时，用OCT填充冷冻模具，直到大脑组织被完全覆盖。

g、将低温模具转移到容器中干冰上的预冷金属板上。用动力/压碎的干冰快速包围低温模具的所有四个侧面。

h、一旦OCT变得不透明，冰冻的标本可能会被储存在干冰颗粒上，而其他大脑则被采集和冷冻。

i、将冷冻样品用铝箔包裹在低温模具内，并转移至-20°C保存。

4. 组织切片和成像

a、用铅笔给显微镜载玻片编号，从1到150。

b、沿矢状面将组织切片，从左侧向中线移动，将四个连续切片转移到一个显微镜载玻片上，从载玻片1开始（图3）。

图3。组织切片策略示意图。A、收获的小鼠脑背视图。红色虚线表示从左腹侧开始向中线移动的矢状切面，从第1节到第4节开始。B、将组织切片放在显微镜载玻片上，从第1至第4节开始，从左到右移动。

c、将载玻片放入储存盒，继续切片，直到所需数量的大脑被取样。使用这种方法，通常需要150张幻灯片来切片整个大脑。

d、切片样品可在-20°C下保存，直到成像。然而，我们建议切片后立即成像，因为冷冻切片在解冻时可能会聚集冷凝液，导致荧光示踪剂出血。

e、使用绿色通道在荧光显微镜上检查载玻片。

f、比较不同动物的解剖位置和理想的治疗方法。使用编号的幻灯片定位相似的解剖区域进行比较。与所有显微镜比较一样，确保所有比较使用相同的显微镜（放大倍数）和成像设置（曝光等）（图2B）。

g、在我们的实验中，使用蔡司Axioskop2 Plus立式显微镜和Spot RT3相机及软件对组织进行成像，并在Adobe Photoshop中使用相同的设置进行后期处理。通常，使用默认设置和手动曝光的荧光图像类型，以100倍或200倍的灰度单色放大率拍摄图像。每个荧光团和实验的曝光时间应独立确定。为了选择最佳曝光时间，我们建议您使用单色显示饱和像素的功能。此功能可以通过防止过多的饱和像素来帮助减少数据丢失。启用时，此功能以红色指示饱和像素。通过使用这个特性，你可以选择一个曝光时间来最小化红色（饱和）像素的数量，同时允许负片变成黑色。

E、用内源性IgG评价BBB通透性

注：本方法以内源性IgG作为BBB通透性的标志物。评估155 kDa或更小物质的外渗。给动物灌流PBS只是为了去除管腔IgG。因为这种方法需要冷冻新鲜的、仅灌注PBS的组织，因此切片组织可以使用多种免疫荧光分析（IFA）和IHC应用进行染色，而不需要使用抗原回收。然而，切片组织的形态不如灌注固定液的组织。因为动物是灌流的，所有的管腔IgG都会被清除。因此，任何随后在脑实质中观察到的IgG信号或与血管系统共定位，都应被视为BBB通透性的标志。观察到的IgG与血管系统共定位可能表明IgG在BEC内化或IgG沉积在血管壁上。

1. 治疗前准备和组织收获

a、准备泵装置和PBS试剂用于心内灌注（）。Gage等人，2012年

b、在使用前，通过在容器中的干冰颗粒上预冷金属板至少20分钟来准备冷冻收获的大脑的材料。

c、如有必要，压碎干冰颗粒，制成干冰粉，并储存在容器中直到使用。

2. 心内灌注与脑收获

a、如上文所述，用ETX治疗小鼠达到所需的时间。

b、用手术剂量的甲苯噻嗪和氯胺酮鸡尾酒（150 mg/kg和15 mg/kg）通过静脉注射和29号胰岛素针对动物进行深度麻醉。完全麻醉一般发生在20分钟内。

c、按照先前公布的方法，用至少20毫升PBS进行心脏灌注（）。简单地说，将鼠标放在仰卧位，双腿伸直。在腹部向胸腔开一个中线切口，然后在胸腔下方做一个横向交叉切口，露出腹腔。小心不要划伤任何内脏，尤其是肝脏。轻轻地将肝脏从横膈膜上轻轻地推离，使肝脏与横膈膜分离。小心地切开横膈膜，露出胸膜腔。从左右两侧切开胸腔，将胸骨上下翻转，朝向头部，仔细修剪与心脏相连的任何组织。将一根连接到泵装置和PBS的针头插入左心室后端，直至升主动脉。用止血器固定针头，在右心房开一个小切口。在动物体内泵入至少20毫升PBS。应观察到血液从右心房流出，逐渐向PBS清除。老鼠已经被充分灌注的一个迹象是肝脏从暗红色到浅棕色的去饱和度。Gage等人，2012年

d、灌流后，用70%乙醇大量喷洒小鼠，使其皮毛湿润。

e、将老鼠斩首，取出整个大脑。有关如何进行大脑解剖的详细说明，请参阅以前出版的方法（）。苏丹，2013年

f、在贴有标签的低温模具底部涂上一层薄薄的OCT。

g、轻轻地将大脑转移到OCT内衬的冷冻模具中，腹侧朝下。

h、在避免气泡的同时，用OCT填充冷冻模具，直到大脑组织被完全覆盖。

i、将低温模具转移到容器中干冰上的预冷金属板上。用动力/压碎的干冰快速包围低温模具的所有四个侧面。

j、一旦OCT变得不透明，冷冻标本可以储存在干冰颗粒上，而其他小鼠则被灌注等。

k、将冷冻样品用铝箔包裹在低温模具内，并转移至-20°C保存。

3. 组织切片

a、用铅笔对显微镜切片1到150张进行编号。不要使用墨水笔，因为各种固定剂会导致墨水出血，并可能导致后续的染色伪影。

b、从载玻片1开始，沿矢状面从左侧向中线移动16μm切片，将四个连续切片转移到一个显微镜载玻片上（图3）。

c、将载玻片放入储存盒，继续切片，直到所需数量的大脑被取样。使用这种方法，通常需要150张幻灯片来切片整个大脑。

d、载玻片可储存在-20°C。

4. FITC-BSL1和抗小鼠IgG组织染色

a、从-20°C的温度下取出载玻片，并使其升温至室温。

b、为了增加染色过程中的组织粘附性，在染色前，在载玻片加热器上预热载玻片20分钟。冷却至室温。

c、在室温下将载玻片固定在4%PFA/PBS中10分钟。

d、在室温下用PBS清洗载玻片三次，持续5分钟。

e、室温下封闭抗体稀释液30分钟。

f、切片阻断时，将Cy3抗鼠IgG抗体1:500和FITC-BSL1 1:200稀释在同一抗体稀释液中配制染色液。

g、在室温下用PBS清洗载玻片两次，时间为5分钟。

h、用准备好的染色液在室温下孵育载玻片一小时或在4℃下过夜。

i、在室温下用PBS清洗载玻片三次，持续5分钟。

j、将带有DAPI的安装介质涂在幻灯片和封面纸上。

k、使用Kimwipes或等效物，轻轻地用DAPI从载玻片上吸干多余的安装介质。

l、用透明指甲油密封盖滑片的边缘。

m、染色的载玻片可在4°C下保存，直到成像。在成像之前，让幻灯片加热到室温。

h、用荧光显微镜检查载玻片，绿色（FITC）显示血管系统，红色（Cy3）通道显示IgG，蓝色（DAPI）通道显示核染色（图2C）。在我们的实验中，使用蔡司Axioskop2 Plus立式显微镜和Spot RT3相机及软件对组织进行成像，并在Adobe Photoshop中使用相同的设置进行后期处理。通常，使用默认设置和手动曝光的荧光图像类型，以200倍或400倍的灰度单色放大率拍摄图像。每个荧光团和实验的曝光时间应独立确定。为了选择最佳曝光时间，我们建议您使用单色显示饱和像素的功能。此功能可以通过防止过多的饱和像素来帮助减少数据丢失。启用时，此功能以红色指示饱和像素。通过使用这个特性，你可以选择一个曝光时间，这将最小化红色（饱和）像素的数量，同时允许负片变黑。

5. IgG渗出量的测定

a、为了比较不同治疗组之间IgG的通透性，必须检查不同小鼠的相同神经解剖位置。用编号的玻片和由核DAPI染色和血管FITC-BSL1染色勾画的解剖标志定位所需区域。对于每种治疗条件，我们建议至少检查每只动物的三个组织切片，每种情况检查三只动物。此外，所有对照和经ETX处理的载玻片需要同时使用相同的制备试剂染色。与所有显微镜比较一样，确保所有比较使用相同的显微镜（放大倍数）和成像设置（曝光等）。

例如，在我们之前发表的实验中，我们对胼胝体周围组织的IgG渗透性感兴趣。所有小鼠的图像都是在大脑皮质的髓鞘区，海马体和侧脑室上方，从胼胝体到皮质下灰质。Linden等人，2019年

为了测量IgG的通透性，用荧光显微镜在红色（Cy3）通道上捕捉图像。在我们的实验中，使用蔡司Axioskop2 Plus立式显微镜和Spot RT3相机及软件对组织进行成像。通常，使用默认设置和手动曝光的荧光图像类型，在200倍放大率下以灰度单色方式捕捉图像。每个荧光团和实验的曝光时间应独立确定。为了选择最佳曝光时间，我们建议您使用单色显示饱和像素的功能。此功能可以通过防止过多的饱和像素来帮助减少数据丢失。启用时，此功能以红色指示饱和像素。通过使用这个特性，你可以选择一个曝光时间，这将最小化红色（饱和）像素的数量，同时允许负片变黑。

b、为了测量不同条件下动物之间的相对IgG荧光，将图像导入ImageJ64并转换为8位灰度格式。

c、为所有导入的图像调整相同的阈值。

d、计算每个单独图像的平均和积分密度，作为荧光密度的测量。

e、计算每只老鼠的平均荧光密度。

f、计算整个治疗组的平均荧光密度。

g、或者，将结果标准化以控制治疗，并将结果表示为IgG外渗（%CT）（图2D）。

例如，计算对照组的平均荧光密度。将对照组和ETX治疗组的每个值标准化（除以）平均控制值。以百分比表示结果，并计算每个治疗组的平均值和标准差。

可选：免疫荧光染色程序

NOTE: In this procedure, we will describe how to stain for both endogenous IgG leakage and pericytes using a rabbit anti-PDGFbeta marker. Use of a pericyte marker can help identify areas of IgG permeability that extend beyond endothelial cells. Alternate antibodies may be substituted for this procedure. When selecting antibodies to use, ensure that the primary antibody is not of mouse origin; we have the most success using rabbit antibodies. We also highly suggest that the secondary antibodies used for this procedure (in our case, FITC conjugated donkey anti-rabbit IgG) be pre-absorbed to mouse IgG to minimize cross-reaction.

a. Remove slides from -20 °C and allow to warm to room temperature.

b. To increase tissue adherence during staining, pre-heat slides at 55 °C on a slide warmer for 20 min before staining. Allow to cool to room temperature.

c. Fix slides in 4% PFA/PBS for ten min at room temperature.

d. Wash slides three times in PBS for five min at room temperature.

e. Block in antibody diluent for 30 min at room temperature.

f. While sections block, prepare primary staining solution by diluting rabbit anti-PDGFR beta antibody 1:100 in antibody diluent.

g. Wash slides twice in PBS for five min at room temperature.

h. Incubate slides with prepared primary staining solution for one hour at room temperature or overnight at 4 °C.

i. Wash slides three times in PBS for five min at room temperature.

j. While slides wash, prepare the secondary staining solution by diluting the Cy3 anti-mouse IgG antibody 1:500 and the FITC anti-rabbit IgG antibody 1:500 in the same antibody diluent.

k. Incubate slides with prepared secondary staining solution for one hour at room temperature or overnight at 4 °C.

l. Wash slides three times in PBS for five min at room temperature.

m. Apply mounting media with DAPI to slides and coverslip.

n. Using Kimwipes or equivalent, gently blot excess mounting media with DAPI off of slides.

o. Seal edges of coverslips with clear nail polish.

p. Stained slides may be stored at 4 °C until imaging. Allow slides to warm to room temperature before imaging.

i. Examine slides on fluorescent microscope using the green (FITC) to visualize pericytes, the red (Cy3) channel to visualize IgG, and the blue DAPI channel to visualize nuclear staining. For our experiments, tissues are imaged using Zeiss Axioskop2 Plus upright microscope and Spot RT3 camera and software and post-processed using identical settings in Adobe Photoshop. Typically, images are captured at 200x or 400x magnification in gray scale monochrome using the fluorescence image type with default settings and manual exposure. Exposure times should be identified independently for each fluorophore and experiment. To select the best exposure times, we suggest utilizing the feature that allows you to indicate saturated pixels in monochrome. This feature can help reduce data loss by preventing too many saturated pixels. When enabled, this feature indicates saturated pixels in red. By using this feature, one can select an exposure time, which minimizes the amount of red (saturated) pixels while allowing negative areas to be black.

F. Evaluation of BBB permeability using BSA-594

Note: Use of exogenous BSA as a tracer for BBB permeability evaluates extravasation of materials 66.5 kDa or less. BSA is fixable with 4% PFA, making it an ideal tracer to be used for permeability studies requiring tissue perfusion with 4% PFA/PBS. This technique, in combination with sucrose cryoprotection, results in superior morphology preservation. However, sectioned tissue prepared using this method may require antigen retrieval prior to IFA or IHC applications. 因为动物是灌流的，所有的管腔BSA-594都会被移除。因此，任何随后在脑实质中观察到的BSA-594信号或与血管系统共定位都应被视为BBB通透性的标志。BSA-594与血管系统共定位可能表明BSA-594被BEC内化。对白蛋白的通透性被认为是通过小窝依赖性机制增加跨细胞作用的结果(Schnitzer等人，1994年;;). 然而，BBB渗透率的具体机制还需要通过其他实验方法来证实。

1. 治疗前准备和组织收获：

a、在无菌生理盐水中制备1.5 mg/ml BSA-594。在4°C下储存一个月，并避光。给动物服用前，将溶液预热至室温或37°C。

b、准备泵装置、PBS和4%PFA/PBS试剂进行心内灌注。

c、对于每个要采集的大脑，准备50 ml锥形管和10 ml 4%PFA/PBS溶液和一个单独的50 ml锥形管和10 ml 30%蔗糖溶液。

2. 向小鼠注射BSA-594

a、如上文所述，用ETX治疗小鼠达到所需的时间。

b、使用1.5 mg/ml BSA-594溶液，使用29号胰岛素针，通过尾静脉向小鼠静脉注射每克体重15μg的BSA-594。简单地说，把动物放在一个圆柱形的约束管里。温暖整个动物或尾巴以扩张尾部血管。将针头插入尾静脉外侧近三分之一处。慢慢注入材料。如果针头已正确插入静脉，则在压下柱塞和注入溶液时不会产生阻力。此外，静脉注射时应暂时清除血液。有关如何进行静脉注射的更详细说明，请参阅以前发布的方法（）。Machholz等人，2012年

例如，20 g小鼠通过注射200μl 1.5 mg/ml的BSA-594溶液，可获得总共300μg的BSA-594

i、 20 g小鼠乘以每克小鼠15μg BSA-594=300μg总BSA-594

二。300μg BSA-594除以1.5 mg/ml BSA-594溶液=200μl 1.5 mg/ml BSA-594溶液

c、治疗后观察动物10min。

3. 心内灌注与脑收获

a、用致死剂量的甲苯噻嗪和氯胺酮鸡尾酒（150 mg/kg和15 mg/kg）用29号胰岛素针进行IP注射，使动物深度麻醉。完全麻醉一般发生在20分钟内。

b、用至少20毫升PBS和至少20毫升先前公布的4%PFA/PBS溶液进行心脏灌注（）。简单地说，将鼠标放在仰卧位，双腿伸直。在腹部向胸腔开一个中线切口，然后在胸腔下方做一个横向交叉切口，露出腹腔。小心不要划伤任何内脏，尤其是肝脏。轻轻地将肝脏从横膈膜上轻轻地推离，使肝脏与横膈膜分离。小心地切开横膈膜，露出胸膜腔。从左右两侧切开胸腔，将胸骨上下翻转，朝向头部，仔细修剪与心脏相连的任何组织。将一根连接到泵装置和PBS的针头插入左心室后端，直至升主动脉。用止血器固定针头，在右心房开一个小切口。通过动物泵送至少20毫升PBS。应观察到血液从右心房流出，逐渐向PBS清除。老鼠已经被充分灌注的一个迹象是肝脏从暗红色到浅棕色的去饱和度。随后加入20ml 4%PFA/PBS。在PFA/PBS灌注结束时，应观察固定震颤和动物僵硬。Gage等人，2012年

c、灌流后，用70%乙醇大量喷洒小鼠，使其皮毛湿润。将老鼠斩首，取出整个大脑。有关如何进行大脑解剖的详细说明，请参阅以前出版的方法（）。苏丹，2013年

d、收获后，通过将组织转移到含有10ml4%/PFA/PBS溶液的50ml锥形管中，固定后收获的大脑。在4°C下培养16小时。

e、将固定的脑组织转移到含有10 ml 30%蔗糖/PBS溶液的50 ml锥形管中。在4°C下培养，直到组织下沉或过夜。

4. 冷冻保护大脑

a、在使用前，通过在容器中的干冰颗粒上预冷金属板至少20分钟来准备冷冻收获的大脑的材料。

b、如有必要，压碎干冰颗粒，制成干冰粉，并储存在容器中直到使用。

c、在贴有标签的低温模具底部涂上一层薄薄的OCT介质。

d、轻轻地将冷冻保护的大脑转移到OCT中衬低温模具中，腹侧朝下。

e、在避免气泡的同时，用OCT培养基填充冷冻模具，直到脑组织完全覆盖。

f、将低温模具转移到容器中干冰上的预冷金属板上。用动力/压碎的干冰快速包围低温模具的所有四个侧面。

g、一旦OCT变得不透明，冰冻的标本可能会被储存在干冰颗粒上，而其他大脑则被采集和冷冻。

h、将冷冻样品用铝箔包裹在低温模具内，并转移至-20°C保存。

5. 组织切片

a、用铅笔对显微镜切片1到150张进行编号。不要使用钢笔，因为各种固定剂会导致墨水出血，并可能产生染色伪影。

b、从载玻片1开始，沿矢状面从左侧向中线移动16μm切片，将四个连续切片转移到一个显微镜载玻片上（图3）。

c、将载玻片放入储存盒，继续切片，直到所需数量的大脑被取样。使用这种方法，通常需要150张幻灯片来切片整个大脑。

d、在使用前，载玻片可在-20°C下保存。

6. FITC-BSL1组织染色

a、染色前，在TE缓冲液中稀释蛋白酶K储备液（20 mg/ml）1:1000，制备最终浓度为20μg/ml的蛋白酶K抗原回收液。该溶液可在4°C下储存6个月。

b、从-20°C的温度下取出载玻片，并使其升温至室温。

c、为了增加组织对载玻片的粘附性，在载玻片加热器上将载玻片在55℃下预热20分钟，然后冷却至室温。

d、在37°C的蛋白酶K抗原回收液中培养载玻片15分钟。

e、在室温下用PBS清洗载玻片三次，持续5分钟。

f、室温下封闭抗体稀释液30分钟。

g、切片阻断时，将FITC-BSL1 1:200稀释在抗体稀释液中制备染色液。

h、在室温下用PBS清洗载玻片两次，时间为5分钟。

i、用准备好的染色液在室温下孵育载玻片一小时或在4℃下过夜。

j、在室温下用PBS清洗载玻片三次，持续5分钟。

k、将带有DAPI的安装介质涂在幻灯片和封面纸上。

l、用Kimwipes，轻轻地用DAPI从幻灯片上吸干多余的安装介质。

m、用透明指甲油密封盖滑片的边缘。

n、染色的载玻片可在4°C下保存，直到成像。在成像之前，让幻灯片加热到室温。

j、在荧光显微镜下用FITC（BSL1/血管系统）、Cy3（BSA-594）和DAPI（核）通道检查载玻片。在我们的实验中，使用蔡司Axioskop2 Plus立式显微镜和Spot RT3相机及软件对组织进行成像，并在Adobe Photoshop中使用相同的设置进行后期处理。通常，使用默认设置和手动曝光的荧光图像类型，以200倍或400倍的灰度单色放大率拍摄图像。每个荧光团和实验的曝光时间是独立确定的。要选择最佳曝光时间，请使用允许以单色显示饱和像素的功能。此功能可以通过防止过多的饱和像素来帮助减少数据丢失。启用时，此功能以红色指示饱和像素。通过使用一个红色的特征来选择一个红色的区域来最小化曝光量。

食谱

1. 胰蛋白酶消化缓冲液

15.61毫克磷酸二氢钠

10毫升去离子水

每次都做新鲜的

2. 6 mg/ml FITC Na溶液

60毫克荧光素钠盐

10ml无菌生理盐水（0.9%氯化钠）

每次都做新鲜的

3. 20 mg/ml 70 kDa FITC葡聚糖溶液

直接在100mg瓶中制备

100毫克异硫氰酸荧光素-葡聚糖，平均分子量70000

5ml无菌生理盐水（0.9%氯化钠）

储存在4°C避光

4. 1.5毫克/毫升BSA-594

直接在5mg瓶中制备

5毫克牛血清白蛋白，Alexa Fluor 594结合物

3.333ml无菌生理盐水（0.9%氯化钠）

储存在4°C避光

5. 1个PBS

100毫升10x PBS

900毫升去离子水

无菌过滤器

室温下储存

6. 30%蔗糖溶液

30克蔗糖（和品牌）

100毫升1x PBS

在4°C下储存长达四周

7. 抗体稀释液

10ml FBS（任何品牌）

50μl triton X-100

40毫升1x PBS

在4°C下储存最多两周

8. Cy3亲和山羊抗鼠IgG（H+L）

在2mg瓶中直接配制1.5mg/ml溶液

2mg Cy3亲和山羊抗鼠IgG（H+L）

750μl甘油（任何品牌）

750μl去离子水

在-20°C避光保存

9. FITC结合亲和驴抗兔IgG（H+L）

直接在0.5mg瓶中配制1.5mg/ml溶液

0.5mg FITC结合亲和驴抗兔IgG（H+L）

166.5μl甘油（任意品牌）

166.5μl去离子水

在-20°C避光保存

10. 蛋白酶K抗原回收液

6.1g Trizma碱

0.37 g EDTA（任何品牌）

5毫升Triton X-100

1000ml去离子水

使用HCl将pH值调整为8.0

室温下储存

致谢

这项工作，部分是由威尔玛S.和劳伦斯A.蒂什基金会资助的。我们感谢之前帮助影响这些方法的工作，包括Saunders等人，2015年Hoffmann等人，2011年和。

相互竞争的利益

不存在利益冲突或利益冲突。

伦理学

所有动物研究均经威尔康奈尔医学院动物护理和使用委员会批准，研究方案编号2012-0030。这些政策和程序是根据《动物福利法》、美国农业部动植物卫生监督局、国家卫生研究所实验动物福利办公室、公共卫生服务政策等授权和执行的联邦法规和法律制定的，美国兽医协会安乐死指南，国家健康振兴法研究所，美国政府。氯胺酮和甲苯噻嗪用于麻醉和安乐死用于体内研究。

工具书类

1. Abbott，N.J.和Friedman，A.（2012年）。概述与简介：血脑屏障在健康与疾病中的作用。癫痫53补遗6:1-6。

2. 阿伯特，N.J.，Ronnback，L.和Hansson，E.（2006年）。血脑屏障上星形胶质细胞与内皮细胞的相互作用。神经科学杂志7（1）：41-53。

3. Alvarez，J.I.，Katayama，T.和Prat，A.（2013年）。胶质细胞对血脑屏障的影响。Glia 61（12）：1939-1958。

4. Balabanov，R.和Dore Duffy，P.（1998年）。中枢神经系统微血管周细胞在血脑屏障中的作用。神经科学研究杂志53（6）：637-644。

5. Buxton，D.（1978年）。应用免疫过氧化物酶技术，通过光镜和电镜观察魏氏梭菌D型ε毒素在小鼠体内的结合部位。医学微生物学杂志11（3）：289-292。

6. 克莱梅德森，C.J.，哈特利厄斯，H.和霍姆伯格，G.（1956年）。二氧化碳吸入对血脑屏障的影响。《自然》178（4539）：915。

7. 克莱梅德森，C.J.，哈特利厄斯，H.和霍姆伯格，G.（1958年）。二氧化碳吸入对脑血管对台盼蓝（血脑屏障）通透性的影响。病理微生物学学报42（2）：137-149。

8. De Bock，M.，Van Haver，V.，Vandenbroucke，R.E.，Decrock，E.，Wang，N.和Leybaert，L.（2016年）。穿越血脑屏障进入一个相当未知的区域。胶质细胞64（7）：1097-1123。

9. Engelhardt，B.（2003年）。血脑屏障的发展。细胞组织研究314（1）：119-129。

10. Frank，P.G.，Woodman，S.E.，Park，D.S.和Lisanti，M.P.（2003年）。小窝蛋白、小窝和内皮细胞功能。动脉硬化血栓血管生物学23（7）：1161-1168。

11. Gage，G.J.，Kipke，D.R.和Shain，W.（2012年）。啮齿动物全动物灌注固定。视觉实验（65）：3564。

12. Gloor，S.M.，Wachtel，M.，Bolliger，M.F.，Ishihara，H.，Landmann，R.和Frei，K.（2001年）。血脑屏障的分子和细胞通透性控制。脑研究脑资源回顾36（2-3）：258-264。

13. Hoffmann，A.，Bredno，J.，Wendland，M.，Derugin，N.，Ohara，P.和Wintermark，M.（2011年）。高、低分子量异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖评估血脑屏障破坏：技术考虑。笔划研究2（1）：106-111。

14. Linden，J.R.，Flores，C.，Schmidt，E.F.，Uzal，F.A.，Michel，A.O.，Valenzuela，M.，Dobrow，S.和Vartanian，T.（2019年）。产气荚膜梭菌epsilon毒素通过小窝依赖性的转细胞作用诱导血脑屏障通透性，并需要MAL.PLoS Pathog 15（11）：e1008014的表达。

15. Linden，J.R.，Telesford，K.，Shetty，S.，Winokour，P.，Haigh，S.，Cahir McFarland，E.，Antogneti，G.，Datta，A.，Wang，T.，Meier，W.和Vartanian，T.（2018年）。一种新型兔单克隆抗体及其多种应用，包括抑制产气荚膜梭菌Epsilon毒素寡聚化。抗体（巴塞尔协议）7（4）：37。

16. Machholz，E.，Mulder，G.，Ruiz，C.，Corning，B.F.和Pritchett Corning，K.R.（2012年）。小鼠和大鼠的手动约束和常用的化合物给药途径。视觉实验杂志（67）：2771。

17. 2003年，纳格。血脑屏障通透性的示踪剂和免疫组织化学。方法分子医学89:133-144。

18. Preston，J.E.，Joan Abbott，N.和Begley，D.J.（2014年）。大分子在血脑屏障的跨细胞作用。Adv药理学71:147-163。

19. Rumah，K.R.，Ma，Y.，Linden，J.R.，Oo，M.L.，Anarate，J.，Schaeren Wiemers，N.，Alonso，M.A.，Fischetti，V.A.，McClain，M.S.和Vartanian，T.（2015年）。髓鞘和淋巴细胞蛋白MAL是产气荚膜梭菌epsilon毒素结合和活性所必需的。《公共科学图书馆病理学》11（5）：e1004896。

20. 桑德斯，N.R.，Dziegielewska，K.M.，Mollgard，K.和哈布古德医学博士（2015年）。血脑屏障完整性的标志物：伊文思蓝在21世纪有多合适？有什么替代品？前神经科9:385。

21. Schnitzer，J.E.，Oh，P.，Pinney，E.和Allard，J.（1994年）。菲利平敏感的小窝介导的内皮细胞转运：减少转运，清除剂内吞，毛细血管通透性选择大分子。细胞生物学杂志127（5）：1217-1232。

22. 舒伯特，W.，弗兰克，P.G.，拉扎尼，B.，帕克，D.S.，周，C.W.和利桑蒂，M.P.（2001）。小窝缺陷型内皮细胞在体内对白蛋白的摄取和转运存在缺陷。生物化学杂志276（52）：48619-48622。

23. 肖特，S.J.，Titball，R.W.和Lindsay，C.D.（2000年）。产气荚膜梭菌D型ε毒素对人和动物细胞的体外毒理学评价。人体实验毒理学19（2）：108-116。

24苏丹，F.A.（2013年）。小鼠海马不同区域的解剖。24苏丹，F.A.（2013年）。小鼠海马不同区域的解剖。生物协议3（21）。

25Tietz，S.和Engelhardt，B.（2015年）。脑屏障：复杂紧密连接和粘连连接之间的串扰。25Tietz，S.和Engelhardt，B.（2015年）。脑屏障：复杂紧密连接和粘连连接之间的串扰。细胞生物学杂志209（4）：493-506。

26. Wolburg，H.和Lippoldt，A.（2002年）。血脑屏障紧密连接：发育、组成和调节。血管药理学38（6）：323-337。