材料和试剂

1. 约束管：50 ml锥形管（直径约30 mm，长度115 mm）（Corning®，目录号：430921，其他），开口允许呼吸（见程序）

2. 纸巾（Scott®多折毛巾，目录号：01804，其他）

3. C57BL/6青少年或成年小鼠（见“MAS协议的变化”注释）

4. 95%乙醇清洗

设备

1. 多用途旋转器/轨道摇床（Thermo Scientific，型号：2314）或台式实验室摇杆（IBI Scientific Roca115S Hi/Lo剖面摇杆，115V，亚马逊网站)

2. 立体声系统（Sony CFD-510超低音盒式录音机，其他）或音频放大器（例如，立体声20W D级音频放大器，MAX9744，Adafruit产品ID:1752，但任何音频放大器都可以工作）、高频响应扬声器（例如，用于汽车音频1.5英寸400瓦4欧姆超高频的高性能压电高音扬声器，亚马逊网站), 以及一个Arduino UNO R3板（Arduino，产品代码：8058333490090），带有2 x 12 V电源（12V 2A 24W AC DC开关电源适配器，亚马逊网站)

3. 音频格式与立体声或Adruino代码兼容（提供）

4. 1-2个空的鼠笼或塑料盒，可安装在旋转器上（20 cm宽x 36 cm长x 13 cm高或类似）

5. 精度为十分之一克的天平（Sartorius，型号：PT600，其他）

6. 分贝计（或同等的手机应用）

7. 耳塞（3MTM，目录号：70005103141，其他）

8. 固定锥形管的C形夹或台钳

9. 带钻头的电钻（最大¼英寸）

10. 砂纸

11. Arduino接线用跨接电缆（EDGELEC 120根试验板跨接线，亚马逊网站)

12. USB电缆（用于Arduino UNO/Arduino Mega 2560 Rev 3 R3微控制器的USB数据同步电缆，亚马逊网站)

13. 电源板（AmazonBasics 6-插座电涌保护器电源板，亚马逊网站)

14. LED光源（例如，RGB LED聚光灯，LOFTEK 10W，亚马逊网站)

程序

注意：在进行此实验之前，必须获得相应动物使用委员会的批准。

第一部分：准备材料

A、建造约束管

1. 建造尽可能多的约束管，以便一次给你想要的最大数量的老鼠加上几个额外的压力。如果所有的老鼠都在一个笼子里受到压力，那么最大的老鼠数量将是6-8只（取决于笼子的大小），如果使用两个笼子的话，老鼠的数量会增加一倍。在笼子里，应该有足够的空间让被束缚的老鼠被推挤至少几厘米。如果使用多个保持架，则应并排放置在转子上。如果两个保持架一起悬挂在旋转器的边缘上，则不建议这样做。练习在没有老鼠的情况下以所需的速度操作旋转器，以确保笼子不会滑落，并考虑增加笼子底部的牵引力以防止滑倒。

注：至少应使用两只小鼠来包含“社会压力”的一部分（参见注释部分的“MAS协议的变化”）。同时给太多的老鼠施加压力可能会产生混合的结果，并且会使设置（如果只有一个实验者在执行）在技术上更具挑战性。请参阅注释部分的“行为测试注意事项”，了解如何错开这一程序以适应更多动物而不影响重要时间点的提示。

2. 使用任何品牌的50毫升锥形塑料管，直径约为30毫米，长度为115毫米。管子的宽度和长度应足够大，以使老鼠感到舒适，既不被压扁，也不足以自由移动，只能蠕动。我们不建议使用超过38克的这种大小的试管，否则它们可能在取出后受伤。给试管提供唯一的标识符（数字、字母和/或不同颜色的盖子），以便在压力下更好地跟踪老鼠。

3. 用台钳或夹子固定住50毫升的试管（图2A）。在管子的底部钻一个气孔。从一个足够小的钻头开始，形成一个干净的孔，然后逐渐增加钻头尺寸，直到孔尺寸合适为止。这个洞应该足够大，让老鼠的鼻子穿过（大约6毫米）。较大的洞可能会导致老鼠的牙齿卡住，从而导致受伤。使开口光滑，并用砂纸去除所有锯齿状的塑料。

4. 重复此过程，沿管道长度制造类似尺寸的孔（图2B）。应该有足够的开口来提供足够的通风，但不足以让老鼠的四肢经常被抓住。总共有五个空缺是个不错的最低要求。将这些孔放在靠近管的圆锥形尖端（与盖子相对）的位置，因为这是鼠标的位置。

图2。建造约束管。A、钻孔时，用C形夹（如图所示）或任何其他夹具或台钳固定锥形管。管子应夹紧到不移动但不被压碎的程度。B、通风约束管示例。在锥形管的顶端钻一个孔，用来装机头。沿着约束管的侧面钻几个孔以增加额外的通风。确切的气孔数量可能会有所不同，但要避免过多或过大的气孔，否则会导致肢体卡住。

5. 这就完成了一个约束管。对所需管数重复该过程。

6. 使用前，将带盖的约束管存放在无尘袋或无尘箱中。

B、产生巨大噪音

选择1：利用任何可以播放90分贝或更高音量音乐的立体声系统。典型的说唱乐或嘻哈音乐是按照第二部分步骤A4所述播放的。

选项2：设置带立体声放大器和扬声器的Arduino UNO。

1. 下载并安装Arduino交互式开发环境(https://www.arduino.cc/en/Main/Donate).

2. 使用USB电缆将Arduino Uno连接到PC或Mac电脑。

3. 运行窥视者.ino双击文件。这将启动Arduino IDE。

4. 单击Arduino IDE中的Upload。从这一点开始，就不需要PC了；Arduino Uno在通电时将运行噪声发生器。

5. 使用跨接电缆将Arduino UNO针脚13和接地连接到MAX 9744音频放大器（分别为“L”和“-”端口），并将扬声器电缆插入放大器输出（接线图见图3）。

6. 把扬声器放在实验室摇床顶部的笼子里。

图3。声音发生器设置接线图。A、 Arduino可按示意图所示接线。跨接电缆可以直接焊接到MAX 9744放大器板上，也可以通过提供的螺丝端子固定。在装配和草图上传后，整个装配可以启动并运行一段时间的应力暴露，只需给两个12V电源供电，而不需要连接到计算机。B、显示实际的Arduino设置。

第二部分：运行MAS

A、设置MAS

1. 使用前清洁约束管。用蒸馏水冲洗试管和瓶盖的内外部，用手指或适当大小的瓶刷擦洗。特别注意可能积聚污垢的气孔。用95%的乙醇大量冲洗，倒置晾干。应力前一天晚上或几个小时前清洁管子。使用前，约束管必须完全干燥。

2. 准备纸巾在管子里垫老鼠。把纸巾撕成两半。对于一只普通的雄性老鼠（25-38克），一条半纸巾就足够了。对于较小的老鼠和大多数雌性老鼠（15-25克），可能需要一条半加四分之一的纸巾来保持足够的固定。根据你的平均鼠标大小和纸巾厚度调整准备。

3. 在实验室里，用一个或两个空的笼子放在旋转器的顶部。将转子设置到所需的速度。对于型号为2314的Thermo Scientific振动筛，这是max的第四个设置，其中最大速度为220 RPM（速度演示见视频1）。

视频1。MAS振动筛速度。为了制造“推挤”的物理压力源，2314号热科学振动筛从最大速度设置为第四个设置。在本演示中，约束管是空的。

4. 在运行压力之前，测试音频音量。可以播放音乐（通常是说唱或嘻哈）或噪音。在Baram实验室，TLC的“粉丝邮件”（1999年）中的“傻乎乎的Ho”正在循环播放（Maras等人，2014年；Chen等人，2016年）。插入耳塞，打开音频，将分贝计或带有分贝计应用程序的手机放在震动器所在的位置。设置音量，使仪表读数在85-90分贝之间。这个数量可能会波动。平均读数应在85-90分贝之间。如果使用传统立体声系统，考虑用胶带或记号笔在音量旋钮上标记这一点，以便将来快速访问。音频应设置为在无限循环中重复。或者，在Lur实验室中，噪声由Arduino Uno产生，由0.5-3 s随机间隔的15-30 kHz范围内随机选择的0.5-1s长蜂鸣音组成（Libovner等人，2020），如第一部分第B节选项2所述。

5. 将每个约束管放在靠近盖子的柜台上，手边放一摞预先裁好的纸巾。还有一个笔记本方便地记录鼠标管分配，前，后MAS权重，开始和结束时间MAS。

B、启动和运行MAS

1. 把老鼠从它们的饲养室带到实验室，要么放在笼子里，要么放在运输笼里。当压力持续时，不要把控制老鼠带到这个房间。把控制老鼠放在房间里或者转移到另一个房间。

2. 为每个鼠标指定一个标记的管。这将允许你在压力下识别老鼠并做任何必要的记录。当鼠标受到约束时，耳夹或尾部标记将不清晰。记录每只老鼠被或将要被限制的顺序。

3. 限制前记录每只老鼠的重量。

4. 在预期的MAS开始时间前几分钟，插入耳塞，然后开始限制老鼠。开始限制的确切时间取决于你的经验/速度、鼠标的配合以及需要限制的老鼠数量。一个训练有素的实验者用一只手抓老鼠应该要花大约30秒到1分钟的时间来约束每只老鼠。

5. 当准备好约束时，抓住并抓住老鼠尾巴的底部，把它们举起来，使它们的后肢靠在笼子角落的墙壁上，前肢和鼻子靠在地板或床上用品上。用一两个手指抵住鼠标的背部以限制移动，并帮助将鼠标推入试管。将约束管的开口端放到他们的鼻子上。将鼠标的头插入试管，将试管朝上，同时将手指放在背部轻轻推动，将鼠标完全包裹在试管中。老鼠的鼻子应该靠在管子底部的呼吸孔上或者部分伸出。老鼠应该很容易放进管子里。如果鼠标太大，不要插入约束管。如果可能的话，用更大的管子做约束管，或者用不同的方法进行约束。

6. 把一个手指放在老鼠的尾端，保持在试管内。让尾巴掉进管子里或者轻轻地推动它使它在管子里卷曲。抓起一块半纸巾，把它推到鼠标后面的空间里，确保完全盖住尾巴，但用力不要太大，以免伤到老鼠。如果半纸巾后面还有很多空间，可以考虑再插一条四分之一毛巾。

7. 纸巾就位后，小心地拧上盖子。小心不要让老鼠的尾巴夹在盖子里（图4）。理想情况下，整个过程应该不超过一分钟，以避免实验者操作带来的任何额外压力。习惯于处理的老鼠会更快更容易控制，并且需要更少的“压力”处理。

图4。克制的老鼠。鼻子应该靠在鼻孔上或部分伸出鼻孔。纸巾应填满鼠标后面的剩余空间，以防止鼠标掉头。老鼠应该能够轻微蠕动。在约束过程中，胡须可能会从鼻孔伸出。

注意：在插入纸巾之前，鼠标的尾巴大部分应该折叠起来，这样一旦毛巾就位，尾巴就看不见了。这样可以防止尾巴被盖子夹住，这会导致出血和潜在的尾巴破裂。如果发现这样的伤害，监测老鼠的健康状况。如果出血没有停止，就进行干预。

8. 被束缚的老鼠可以被放在摇床上的笼子里，也可以在其他老鼠被束缚的时候呆在柜台上。

9. 对每只老鼠重复限制过程。

10. 一旦所有的老鼠都被束缚住，把老鼠放进实验室摇床上的笼子里。如果可能的话，换一只老鼠，让每只老鼠旁边都有一只不是它们笼子里的伴侣的老鼠，以增加社会压力。

11. 打开实验室摇床进行连续摇动并打开音频。启动计时器（计数）并记录MAS开始时间（图5）。

图5。老鼠挤来挤去。受约束的老鼠被安排在一个容器里，在一个有90分贝音乐或随机音调的实验室摇床顶部的容器中交替放置。

12. 继续运行MAS至所需的持续时间（例如，1、2或5小时）。

13. 所有老鼠必须在应激期间定期检查（每10或15分钟一次），以确保它们的健康和安全。在每个检查点，每次取一根管子。确保鼠标仍然温暖。当你把老鼠静止不动的时候，它们应该能够轻微地蠕动。重新对齐保持架中心的管。在此期间，转子应保持接通。

注意：如果鼠标已经转头或处于任何可能限制呼吸或可能造成伤害的位置，则在返回振动筛之前，拧下盖子，取下纸巾并调整鼠标。小白鼠在束缚管里会小便。

14. 在鼠标检查过程中，确保房间内的灯光一直亮着，尤其是在灯光可能被激活的房间中。

C、结束MAS和分解

1. 在MAS的预期持续时间结束后，关闭旋转器和立体声系统。如果需要的话，保持定时器计数以供以后的实验参考。

2. 按照插入的顺序把老鼠从试管中取出。理想情况下，你移除老鼠的速度应该与你限制老鼠的速度相似，这样每只老鼠的总限制时间是相等的。

3. 要移除鼠标：拧下约束管帽并拔出纸巾（粪便会随附）。抓住尾巴尽可能靠近底部，轻轻地拖拉。鼠标应该会滑出，并可能开始自行后退。如果老鼠的鼻子或牙齿卡在鼻孔里，用手指轻轻推鼻子，让老鼠自由活动。不要用力过猛，否则会伤到老鼠。除非老鼠太大而无法容纳，否则老鼠应该很容易出来。以一个流体运动的方式移动鼠标，否则它们可能会钻到管子里更远的地方来躲避你。对于一个训练有素的实验者来说，移除一只老鼠的时间不应超过每只老鼠30秒。

4. 将老鼠从试管中取出后称重。在这段时间内，老鼠通常会减掉少量的体重（体重的1-4%，通常为1克或更少），并且在离开试管时会出现非常皱褶的外观。任何显著的体重减轻都可能是由于脱水，老鼠的健康状况应该得到监控。老鼠可能会继续看起来皱巴巴的几个小时，但应该在第二天进行适当的梳理。如果老鼠没有恢复正常的梳理，就应该监测它们的健康状况。

5. 将鼠标放回外壳或运输笼中。

6. 对所有老鼠重复这个过程。

7. 根据你的实验，老鼠可以被立即处死进行分析，也可以被带回居住区或行为套件等待以后的测试（见“行为测试注意事项”的注释）。

8. 动物排泄物的空约束管。再次，用蒸馏水冲洗试管和瓶盖的内外部，并用手指或适当大小的瓶刷擦洗。特别注意可能积聚污垢的气孔。用95%的乙醇大量冲洗，倒置晾干。将带盖的管子存放在无尘袋或容器中。如果管子损坏或无法清洁，则予以处理。

这就完成了MAS的一个会话。为了研究慢性MAS的影响，在预期的时间内重复上述程序，每天在大致相同的时间开始MAS。

笔记

A、 MAS协议的变化

1. 对于某些实验，您可能只能接触到几只老鼠和/或在给定时间内只有几只老鼠可供测试。我们同时使用了两只老鼠，复制了空间记忆缺陷。一次使用一只鼠标将消除范式中的“社会压力”成分。这可能会产生缺陷，但我们建议您在实验分析中考虑这一点。

2. 建议的约束管设计可容纳未经手术的小鼠或手术后完全用胶水/缝线密封的小鼠。植入插管、光生探针、电极等的小鼠将无法按原样放入试管。有这种植入物的老鼠可以不受约束，但彼此之间被紧紧地隔在一起，或者以一种不遮住头部的方式加以约束。同样的想法也适用于身体其他部位的植入物（例如导管）。

3. MAS范式可以执行一次（Maras et al.，2014；Chen et al.，2016），也可以在几天内重复（Libovner et al.，2020）。

4. 在青少年（Libovner等人，2020年）或成人（Maras等人，2014年；Chen等人，2016年）对C57BL/6小鼠或C57BL/6背景的小鼠进行了MAS。你可能需要在其他基因背景或年龄上进行试验。

5. 压力过大的“同龄人”可以是笼子里的伙伴，不同笼子里的老鼠，或者是混合体。我们建议对雄性和雌性分别施压。

B、住房考虑因素

1. MAS应发生在住宅区外，且距离足够远，使住宅区内听不到噪音。如果需要消声，可使用质量负载乙烯基（例如，质量负载乙烯基（MLV）-1lb.-声屏障）建造声障盒，亚马逊网站)泡沫块和大小合适的纸板箱。在这种情况下，一个光源被放置在带有实验室振动器和笼子的盒子中进行MAS。

2. 受MAS影响的小鼠应与不受MAS影响的小鼠分开安置，因为应激小鼠的嗅觉和其他线索可以被其他老鼠感知，并反过来受到应激（Brechbühl等人，2013年）。理想情况下，一个完整的外壳框架应该一起受力。如果这是不可行的，在把老鼠带进实验室之前或几天前，应将它们分开并保持分离。我们使用了在MAS之前被分离的小鼠，但是这应该与最近分离的对照小鼠相平衡。如果可以预先计划好分居，那么在MAS之前和任何行为习惯化训练之前提前分居的天数是最好的。为你的实验分析记录这些住房情况。

3. 根据我们的经验，笼子里的伴侣（包括雄性和雌性）在压力过后的几天、几周或几个月内不会变得更具攻击性。不过，应该定期检查老鼠，以确保不会出现任何问题。

C、行为测试注意事项

1. MAS不应该出现在同一只老鼠将被测试的行为套件中。

2. 许多行为范式（如物体位置记忆、物体识别记忆）在测量感兴趣的行为结果之前都涉及到广泛的处理或习惯化阶段。为了观察MAS对这些措施的直接影响，可以在MAS之前进行处理或习惯化。例如，在Chen等人中，2016只小鼠在MAS之前的五到六天内习惯于使用测试仪器。然后在最后一次习惯化训练后的第二天将小鼠暴露于MAS中，然后在“休息期”后进行训练。为了研究MAS的长期影响，这些程序可以在MAS之前和/或之后根据需要进行。处理得当的老鼠更容易受到约束，因此需要较少的“压力”处理。

3. 为了研究MAS对行为任务的直接影响，任务可以在同一天进行，但应该在短暂的“休息期”后进行。Baram实验室的研究表明，应激结束两小时后，应激组和对照组小鼠的皮质酮水平相似。重要的是，在这个时间点，老鼠探索的环境和物体与对照组相似（Chen等人，2016）。

4. 几只小鼠可以同时受到MAS的影响。如果在MAS和一个一次只能容纳少数受试者的行为任务（或剔除）之间需要一个一致的时间段，那么可以考虑在整个范式中错开老鼠。用一只或几只老鼠开始MAS。在稍后的时间点，可以将额外的老鼠限制在房间外或隔音容器外，然后迅速将其运送到摇床上。一旦最初的小鼠达到预期的MAS持续时间，取下试管，并将这些小鼠从房间外松开。确保每只老鼠在从摇床和约束装置上取下之前，在所需的时间内暴露于MAS中。

致谢

我们感谢Hollis Rhodes的编辑见解和Aidan Pham的技术援助。这项工作由NS28912和MH73136资助给TZB，Hewitt生物医学研究基金会资助给JLB和TZB，白厅基金会（2018-12-09）资助给GL。本方案改编自TZB（Maras等人，2014；Chen等人，2016）和GL（Libovner等人，2020）实验室发表的研究成果。

相互竞争的利益

作者声明没有利益冲突。

伦理学

上述协议按照美国国立卫生研究院实验动物福利指南执行，并已获得UCI机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准：AUP-18-183有效期为2018年12月至2021年12月，AUP-17-145有效期为2017年9月至2020年9月。

工具书类

1. Brechbühl，J.，Moine，F.，Klaey，M.，Nenniger Tosato，M.，Hurni，N.，Sporkert，F.，Giroud，C.和Broillet，M.C.（2013年）。老鼠报警信息素与捕食者的气味结构相似。美国科学院学报110（12）：4762-4767。

2. Brivio，P.，Sbrini，G.，Riva，M.A.和卡拉布里斯，F.（2020年）。急性应激通过短暂调节雄性大鼠前额叶皮层的bdnf，诱导其认知功能的改善。细胞分子神经生物学。

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