材料和试剂

1. 碟子，BioAssay®编号：111mm方形

2. PCR管（，VWR，目录号：52509-304）例如

3. 玻璃巴斯德吸管

4. 刮刀

5. 50毫升锥形管（例如，赛默飞世尔，目录号：14-432-22）

6. 高效电竞争性大肠杆菌细胞（必须是>109 CFU/g质粒DNA，例如安捷伦XL-1-蓝色电穿孔活性细胞）（安捷伦，目录号：200228）μ

7. 含有致突变寡核苷酸的寡核苷酸库（或人工混合的致突变寡核苷酸库），如安捷伦SurePrint寡核苷酸库

8. 与诱变寡聚体相比，在非诱变位置退火到模板链的单一引物（例如通过集成DNA技术合成）

9. 含有单个BbvCI限制位点的质粒诱变（只要所有位点都在同一个方向上，就可以接受多个BbvCI限制位点）

我们成功地诱变了长度达8kb的质粒。Wrenbeck等人描述的质粒pEDA5-GFPmut3-Y66H。（2016）（Addgene ID 80085）是一种有用的对照品（见注3）。

10. Monarch®PCR和DNA净化试剂盒（5μg）（新英格兰生物实验室，目录号：T1030S/L）

11. Miniprep试剂盒（例如，Monarch®质粒Miniprep试剂盒，新英格兰生物实验室，目录号：T1010S）

12. T4多核苷酸激酶（新英格兰生物实验室，目录号：M0201S/L）

13. 新台币BbvCI（新英格兰生物实验室，目录号：R0632S/L）

14. Nb.BbvCI公司（新英格兰生物实验室，目录号：R0631S/L）

15. 外切酶I（大肠杆菌）（新英格兰生物实验室，目录号：M0293S/L）

16. 外切酶III（大肠杆菌）（新英格兰生物实验室，目录号：M0206S/L）

17. 塔克DNA连接酶（新英格兰生物实验室，目录号：M0208S/L）

18. Phusion®高保真DNA聚合酶（新英格兰生物实验室，目录号：M0530S/L）

19. DpnI（新英格兰生物实验室，目录号：R0176S/L）

20. 无核酸酶水（例如，新英格兰生物实验室，目录号：B1500S/L）

21. 分子生物学级二硫苏糖醇（DTT）（例如，GoldBio，目录号：DTT10）.

22. 10x CutSmart®缓冲液（新英格兰生物实验室，目录号：B7204S）

23. SYBR安全DNA凝胶染色（Thermo Fisher，目录号：S33102）

24. 5x HF缓冲液（含Phusion®聚合酶）（新英格兰生物实验室，目录号：B0518S）

25. 10 mM腺苷5'-三磷酸盐（ATP）（例如，新英格兰生物实验室，目录号：P0756S/L），以10μL的一次使用小份制备

26. 10 mM脱氧核苷酸（dNTP）溶液混合物（例如，新英格兰生物实验室，目录号：N0447S）

27. β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）（50 mM）（例如，新英格兰生物实验室，目录号：B9007S），以10μl的一次性小份制备

28. 一次性小份（见配方）

10毫米ATP

50毫米NAD+

10毫米dNTPs

29. 50毫米DTT（见配方）

设备

1. -20 °C冷冻机

2. 微量加样器

3. 热循环器（例如，Eppendorf，型号：MastercyclerTM pro，目录号：950040025）

4. 微型离心机（例如，Fisher，型号：accuSpin微型离心机17，目录号13-100-675；不需要冷藏）

5. 电穿孔器（例如，Eppendorf Eporator®，目录号：4309000027）

软件

1. 蟒蛇

为了在许多不同的氨基酸位置进行大量的特异性突变，自动引物设计软件是必不可少的。我们在补充信息中提供了一个灵活的python脚本，用于自动入门设计。该脚本可以使用用户指定的简并密码子（例如NNK）设计诱变引物，或者使用特定生物体的公共密码子生成一个或多个突变特异引物。脚本的输出可以指定为制表符分隔或逗号分隔值（CSV）文件，并具有可编程的primer命名。最后，该脚本使用Rosetta大分子建模套件（Leaver-Fay et al.，2011）中的resfile格式促进了对哪些残基进行突变的精确规范。下面，我们将为脚本提供一些输入和命令行的基本示例。

软件的编写使得5′和3′臂的长度是恒定的，可以是用户定义的长度，也可以是30个碱基的默认长度。恒定的寡核苷酸长度会导致寡核苷酸池中单个成员的熔融温度不同，这是对寡核苷酸池合成的长度和成本限制的折衷。在固定长度的池中，具有最高预测熔融温度的底漆似乎比具有最低预测熔融温度的底漆的效率高出10倍（Medina-Cucurella等人，2019年），但偏差对于我们实验室的所有最终用途都是可容忍的。

脚本唯一需要的输入是包含三行的纯文本文件。第一行应包含要诱变的基因的编码序列（至少为5′同源臂长的长度），第二行应包含要诱变的编码序列（CDS），无需终止密码子，第三行应包含要诱变的编码序列（at最小3′同源臂长的长度）。为了设计诱变前、后几个氨基酸的引物，需要附加序列，附加序列的数量取决于诱变引物所需的5′和3′臂长。命令行标志的完整列表如表S1所示。

假设我们要诱变氨基酸序列MVTAGENSIS，它在以下DNA序列中编码（CDS；bold）：

阿塔加卡塔卡格特ATGGTGACGCGGGCGAAACGAAAGCAGAATGCTAG标签

输入文件(输入顺序)我们将使用以下脚本：

阿塔加卡格塔

ATGGTGACGCGGGCGAAACGAAAGCATATGC

标签ACAGTTG公司

（为清楚起见，中显示了CDS。）请注意，第三行包括标记停止密码子。粗体

例1：

使所有可能的氨基酸突变（包括野生型）在编码序列的每个位置。为每个突变生成两个引物，使用酵母中最常见的两个密码子作为突变氨基酸。在不匹配密码子前后，设计每个引物与模板有28个碱基对的同源性。将CSV输出到文件引物.csv.

python网络管理_底漆.zip--五素臂长28--三素臂长28--生物酵母--分隔符逗号--输出引物.csv输入顺序

例2：

用简并密码子NNK对每个残基进行突变。将制表符分隔的文件输出到底漆.tsv. 设计每个引物在突变上游有20个碱基对同源，在突变下游有30个碱基对同源。

python网络管理_底漆.zip--五素数臂长20--3素数臂长30--自定义密码子NNK--分隔符选项卡–输出底漆.tsv输入顺序

程序

协议步骤的可视化描述如图1所示，后面是每个步骤的详细书面描述。简而言之，步骤[A]（质粒DNA的制备）和[B]-[D]（寡核苷酸的设计、汇集和磷酸化）是提前执行的，可以并行进行。步骤[E]-[L]都在一天内执行。ssDNA由质粒dsDNA[E]制备，突变链由ssDNA模板[F]合成。异源双工被柱纯化[G]，模板链被特异性降解[H]。诱变链再生[I]，诱变DNA富集[J]，柱纯化[K]，转化大肠杆菌[L]。第二天从大肠杆菌转化子中制备含有用户定义突变的质粒[M]。

图1。缺口诱变程序。绿色方框中显示的步骤[A]-[D]独立于该方法的其余部分而准备。[A] 具有唯一BbvCI限制位点的突变模板质粒的制备；[B]突变引物的自动自定义设计；[C]（根据需要）诱变引物的汇集；[D]寡核苷酸磷酸化；[E]ssDNA模板制备；[F]诱变链合成；[G]柱纯化；[H]底模板链降解；[一] 突变链再生；[J]用DpnI去除输入质粒；[K]柱纯化；[L]转化；[M]质粒库制备。

A、制备突变模板质粒

模板质粒必须包含一个BbvCI位点（CCTCAGC）。只有当所有位点在同一个方向上时，质粒中含有多个BbvCI位点是可以接受的。如果不存在，则可以使用任何定点突变程序（例如，Q5®定点突变）轻松添加该位点。如果按照这里的顺序使用刻痕酶(新台币BbvCI第一，Nb.BbvCI公司第二），刻痕位点的定位将决定突变引物是否与质粒的正链或反义链相匹配。BbvCI是必要的，因为nickase版本只刻痕顶部或底部链。原则上，也可以使用其他nickase酶，但可能需要重新配制缓冲液，以便与核酸酶和其他DNA修饰酶相容。

刻痕质粒DNA在缺口诱变过程中会被降解，因此质粒制剂应在使用前立即制备，或提前不超过一个月。为了使共价闭合分子的比例最大化，质粒不应经历一个以上的冻融循环。可以使用制备的质粒并在非解冻-20°C的冰箱中冷冻长达一个月（见表1中的故障排除提示）。

B、设计致突变寡核苷酸

设计编码所需突变的引物。只要在第一个和最后一个突变的上游和下游分别包含与模板足够的同源性，引物就可以编码多个突变。我们通常有这些同源区域至少是24bp。使用软件可以快速地设计出数千个引物，即使是少量引物，也能最大限度地减少设计误差。在补充信息中提供了用Python编写的初级设计脚本（参见上面的软件）。

少量的引物可以在试管或96孔板中单独订购，但当产生数千个程序性突变（例如，大量近端双突变体）时，寡核苷酸池明显更经济。由于缺口突变使用的引物数量为女性（<0.05 pmol/反应），商业寡聚池可直接使用而无需PCR扩增。此外，存在于寡聚体中的非同源引物不会退火至模板或干扰该过程，使得在一个库中为多个基因合成致突变引物集成为可能。

C、池致突变寡核苷酸

如果使用来自寡核苷酸库的引物，根据制造商的说明重新使用该库，并计算含有该突变相关引物的寡聚物的分数。如果合并单个引物，则重新使用每个引物并汇集所有引物，使所有引物的最终浓度为10μM。例如，如果合并100个诱变引物，则每个单独引物的最终浓度应为100 nM，最终总引物浓度为10μM。

D、磷酸化寡核苷酸

1. 在PCR管中组装以下两个反应。

引物池磷酸化：

组分体积（μl）最终浓度或量

混合引物（10μM）20 8.2μM

10x T4多核苷酸激酶缓冲液2.44 1x

10毫米ATP 10.41毫米

T4多核苷酸激酶（10 U/μl）1 10 U

次级引物磷酸化：

组分体积（μl）最终浓度或量

无核酸酶H2O 18不适用

10x T4多核苷酸激酶缓冲液3 1x

二级底漆（100μM）7 23.3μM

10毫米ATP 10.33毫米

T4多核苷酸激酶（10 U/μl）1 10 U

2. 将这两个反应在37°C的温度下培养1小时。作为可选步骤，通过在65°C下培养20分钟使T4激酶失活。

E、上链降解（模板制备）

1. 在冰上的PCR管中组装以下反应：

组件

体积（μl）

最终浓度或量

无核酸酶H2O

至20μl最终体积

不适用

含BbvCI位点的新鲜质粒DNA

0.76 pmol*

0.76 pmol

10x CutSmart®缓冲器

2

1倍

核酸外切酶III（稀释10倍至10 U/μl）

1

库存10件

核酸外切酶I（20 U/μl）

1

库存20件

新台币BbvCI（10 U/μl）

1

库存20件

*0.76 pmol…3kb质粒=1.41μg；4kb质粒=1.88μg；5kb质粒=2.35μg等。为了将质粒体积限制在1-15μl，质粒浓度必须在51-760nm。（例如，3kb的质粒在95和1410ng/μl之间；5kb的质粒在157和2350ng/μl之间，等等）。

2. 在热循环器上运行以下程序：

37°C下60分钟

65°C下20分钟

保持在4°C

F、上链合成

1. 在冰上转移20μl链制备反应，并添加以下物质：

组件

体积（μ）

最终浓度或量

无核酸酶H2O

26.7

不适用

5x Phusion HF缓冲器

20

1倍

1： 1000稀释磷酸化寡核苷酸池（最终浓度8.2nm总引物）

4.3

0.035 pmol

50毫米DTT

20

10毫米

50毫米NAD+

1

0.5毫米

10毫米dNTPs

2

0.2毫米

聚合酶（2U/μl）

1

库存2件

塔克DNA连接酶（40 U/μl）

5

库存200件

2. 然后在热循环器上运行以下协议：

a、 98°C下2分钟

b、 15个周期：

98°C下30秒

55°C下30秒

72°C时为30 s/kb

在循环5和10结束时，添加额外的4.3μl 1:1000稀释磷酸化低聚物池。为了方便这一点，在上述步骤b的第五个和第十个循环之后添加暂停。在丸中添加引物可产生大量的转化子，同时保持质粒与引物的摩尔比较低。

c、 45°c下20分钟

d、保持在4°C

G、柱净化

1. 按照制造商的说明，使用Monarch®PCR和DNA清理试剂盒（新英格兰生物实验室）清理反应，但使用五体积的结合缓冲液而不是两体积的缓冲液。

2. 在室温下用15μl无核酸酶的H2O洗脱，在将洗脱液涂在柱上后等待5分钟，然后离心。

H、底股退化

1. 将14μl柱纯化反应洗脱液转移到新鲜的PCR管中，并置于冰上。向试管中添加以下物质（最终体积为20μl）：

组件

体积（μl）

最终浓度或量

10倍CutSmart缓冲器®

2

1倍

2 U/μl稀释外切酶III

（将100 U/μl的储备浓度稀释至1倍CutSmart）®

2

库存4件

核酸外切酶I（20 U/μl）

1

库存20件

1单位/微升BbvCI编号

（从股票中稀释10倍至1倍CutSmart）®

1

1个U

2. 在热循环器上运行以下程序：

37°C下60分钟

65°C下20分钟

保持在4°C

一、底链合成

1. 将20μl底链降解反应置于冰上，并添加以下物质：

组件

体积（μl）

最终浓度或量

无核酸酶H2O

27.7

5x Phusion HF缓冲器

20

1倍

1： 20稀释磷酸化二级引物

4.3

5 pmol

50毫米DTT

20

10毫米

50毫米NAD+

1

0.5毫米

10毫米dNTPs

2

0.2毫米

聚合酶（2U/μl）

1

库存2件

塔克DNA连接酶（40 U/μl）

5

库存200件

2. 在热循环器上运行以下程序：

a、 98°C下30秒

b、 55°C下30秒

c、 72°c下10分钟

d、 45°C下20分钟

e、保持在4°C

J、去除输入质粒

向100μl底链合成PCR中添加2μl DpnI（20 U/μl），并在37°C下在热循环器中培养1小时。

K、柱净化

1. 根据制造商的说明，使用Monarch®PCR和DNA清理试剂盒（新英格兰生物实验室）清理反应。

2. 使用五个卷的绑定缓冲区（而不是两个）。

3. 在室温下用6μl无核酸酶的H2O洗脱，在将洗脱液涂在柱上后等待5分钟，然后离心。

五十、转化

1. 按照制造商的说明，将整个纯化产品转化为高效的电子竞争性大肠杆菌。

2. 使用高效细胞（>109 CFU/μg质粒DNA）是该方案成功的关键。在适当的选择性介质上进行连续稀释（例如，完全转化的10−4、10−5和10−6），以确定效率。

3. 将转化的剩余部分置于适当的选择性培养基的方形大平板上。

4. 将培养皿在37°C下培养过夜。

M、质粒库制备

一个成功的转化应该在大的生物测试板上产生大量的菌落。一个大刮刀，可以通过弯曲加热的玻璃巴斯德移液管来制备，对于回收菌落用于质粒制备是有用的。

1. 将5-7毫升液体培养基（如LB）涂在生物测定板上，用刮刀刮去琼脂表面的菌落。

2. 稍微倾斜平板，使细胞悬浮液聚集在一个角落，然后用1ml移液管或10ml血清学移液管将悬浮液转移到一个50 ml的无菌锥形管中。通常，1-2ml分配到平板的第一液体培养基被琼脂吸收。

3. 继续添加培养基，刮去菌落，转移悬浮液，直到琼脂上没有细菌生长。

4. 通过剧烈涡流和/或用血清学移液管研磨细胞悬浮液，以完全分散聚集的生物量。如果生物量悬浮在大约10毫升中，培养物将完全不透明，其密度将明显高于饱和大肠杆菌液体培养物（磅）。

5. 最后，使用miniprep试剂盒（例如，New England BioLabs Monarch®质粒miniprep kit T1010S），从少量悬浮液中回收质粒DNA。对于生物测定板上的草坪，再悬浮在10ml LB中，300μl通常足以获得15μg高拷贝数质粒DNA。

数据分析

突变后，通过计数平板稀释系列中的菌落数来近似计算转化子的数量。具体而言，确定菌落数在10-100之间的稀释因子，并根据下式将每个平板上的菌落数乘以相应的稀释度：

为了接近所需突变集的完全覆盖，一般的指导方针是至少恢复比库变体多10倍的转化子。恢复更多的转化子是可取的。如果库中变异频率的分布是均匀的，则99%的覆盖率需要大约4.6倍的覆盖率（Bosley等人，2005年）。然而，刻痕突变的变异频率通常呈对数正态分布，这就需要更高的倍数覆盖率（Wrenbeck等人，2016年；Medina-Cucurella等人，2019年）。图2显示了模拟覆盖结果，表明100倍覆盖是一个更好的目标。实际覆盖率可以通过下一代测序来衡量，这在别处有描述（Kowalsky等人，2015b）。

图2。用均匀或对数正态分布模拟1000个成员库的覆盖率分布。每个数据点显示10万个模拟实验的库覆盖率的平均值和标准差。对于大多数点，标准差太小，无法在这个尺度上看到。对数正态分布频率是通过归一化实验数据集中的对数正态分布（μ=4.6，σ=1.15）而生成的（Wrenbeck等人，2016）。对于日志正常分布的库，每个库成员100个转换器是一个很好的目标。

笔记

1. 用于诱变的质粒制备

制备高质量的环状封闭dsDNA是该方案成功的关键。与切痕酶靶向相反的链上刻痕的质粒DNA将被完全降解而不是闭合的ssDNA。因此，重要的是作为输入的质粒DNA不被划伤，这最好是使用未经冻融循环的新制备的质粒。质粒质量可通过凝胶电泳进行评价。超螺旋质粒DNA应该是高质量样品中的优势种。

2. 效率

利用这里描述的综合诱变程序，我们通常发现20-50%的转化子是野生型质粒。有趣的是，较小的质粒模板导致野生型转化子的分数低得多（而且，正如典型的那样，转化子的数量通常要大得多）。如果需要大量的转化子，只需在最小载体中诱变基因的相关片段，然后再亚克隆得到的文库是有帮助的。如果该文库最终转化为酵母，那么利用线性载体骨架线性诱变片段库转化酵母并依靠体内同源重组尤其有用。

3. 故障排除

表1给出了执行协议时经常观察到的问题。通常，排除缺口突变的第一步应该是尝试使用Wrenbeck等人所述的GFP控制质粒pEDA5-GFPmut3-Y66H。（2016年）（Addgene ID 80085）。质粒中编码的Y66H突变消除了编码的GFP荧光，突变恢复了这种荧光，使筛选成功变得容易。

4. 下一步应该是确认ssDNA模板制备（程序E）和再生（程序F）使用您独特的质粒和引物集新台币BbvCI以及Nb.BbvCI公司. 用切痕酶、核酸外切酶I和外切酶III进行放大消化。使用20μl该反应进行100μl聚合/连接反应。最后，用琼脂糖凝胶电泳分析未切割质粒、切痕/降解质粒和再生模板。使用SYBR安全DNA凝胶染色（Thermo Fisher S33102）是有帮助的，因为在蓝光透照下，它会使ssDNA呈现橙色，dsDNA呈现绿色。

表1。常见问题列表及故障排除建议

发行

意见和建议

转化子数量少

当使用低转换效率的单元或协议时，通常会出现少量的转化子。优化后的NM反应可产生1-10ng的再生文库dsDNA，这足以使用标准方法产生至少106个转化子。使用商业化制备的细胞，每μg质粒DNA>109 CFU，并使用控制质粒如pUC19来确认这种转化。

转化子数量少的其他常见原因包括模板制备和顶链再生效率低下。请遵循下面的故障排除建议。

我们注意到随着质粒大小的增加，转化子数量减少，野生型比例增加。虽然我们在没有修改3-9kb范围内的质粒大小的情况下执行了该程序，但我们建议将您的插入物放入尽可能小的质粒大小中，特别是当最终质粒大于7.5kb时。

模板制备过程中质粒DNA的完全消化

建议在两个方向测试模板ssDNA制备步骤（步骤E）以进行故障排除。一个常见的问题是输入质粒DNA的完全降解。这可能有几个原因。最常见的错误是BbV.CI公司在相反方向的位置-酶会切开两条链，导致DNA被核酸外切酶完全消化。另一个常见的错误是使用从反复冻融循环中切出的输入DNA。运行输入质粒DNA作为对照是有帮助的。一个不太常见的错误是使用exoI/III进行过度消化。必须使用这些酶的准确目录号，并注明稀释度。

模板制备过程中质粒DNA的有限消化

建议在两个方向测试模板ssDNA制备步骤（步骤E）以进行故障排除。另一个常见的问题是质粒DNA的有限消化。在这种情况下，我们可以在没有核酸外切酶的情况下进行反应，这将导致与超螺旋dsDNA不同的质粒DNA出现缺口。在我们的实验室冷冻室中，BbvCI镍币在规定的有效期内保持稳定。

顶股有限再生（程序D）

故障排除后，偶尔没有观察到顶部钢绞线的再生（程序F）。重要的是要明白，人们并不期望定量再生，但预计回收率在5-10%之间。在这里，与绿色荧光蛋白控制质粒pEDA5-GFPmut3-Y66H的交叉比较特别有指导意义：用绿色荧光蛋白控制质粒重述程序，可确保酶、缓冲液和一般试剂仍足以进行该程序。在这种情况下，可能的罪魁祸首是引物与模板不匹配，当引物与ssDNA模板具有相同的取向时，或者当引物在反应条件下不能退火到模板时，就会发生这种情况。

食谱

1. 一次性小份

10毫米ATP

50毫米NAD+

10毫米dNTPs

储存于-20°C

ATP和NAD+不应冻融

2. 50毫米DTT

在无核酸酶的水中进行50 mM DTT，并在-20°C下储存等分试样

致谢

本出版物中报告的研究由美国国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所支持，授予T.A.W.编号R01AI141452。内容完全由作者负责，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。作者希望感谢艾米莉·雷贝克、贾斯汀·克莱斯密斯、吉姆·史泰普顿和安吉丽卡·麦迪娜·库库雷拉对本研究方案的原创研究。

相互竞争的利益

T、 A.W.正在申请美国专利16/115.029，其中包括刻痕突变方法。P、 J.S和Z.T.B.没有相互竞争的利益。

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