材料和试剂

氟化乙烯-丙烯（FEP）管1/16“ OD x .020” ID（IDEX Health＆Science，目录号：1548L）
聚醚醚酮（PEEK）管蓝色1/32“ OD x .010” ID（IDEX健康与科学，目录号：1581）
钢管23 G（Darwin Microfluidics，查看详细信息）
塑料称量盘（Fisher Scientific，目录号：08-732-113）
玻璃盖玻片，24 x 50 mm＃1.5（VWR，Menzel-Gläser ，目录号：631-9430）
培养皿100毫米（Fisher Scientific，目录号：FB0875713）
微量离心管1.5 ml（Fisher Scientific，目录号：05-408-129）
猎鹰圆底管14 ml（Fisher Scientific，目录号：14-959-1B）
Falcon锥形离心管50 ml（Fisher Scientific，目录号14-432-22）
玻璃瓶（Fisher Scientific，目录号：FB800500）
移液器吸头，标准实验室高压灭菌器，各种尺寸（Genesee Scientific）
镀铬光罩5''x 5''.09（Front Range PhotoMask ，https: //www.frontrangephotomask.com/ ）
塑料移液管（Fisher Scientific，目录号：13-680-50）
手术刀（Fisher Scientific，目录号：08-920B）
剃须刀（Fisher Scientific，目录号：12-640）
切割垫（Fisher Scientific，目录号：NC0671274）
洗涤瓶（Fisher Scientific，目录号：02-897-10）
透明魔术胶带（Scotch TM 品牌）
酵母菌株
压缩空气（内部压缩空气管线）
聚二甲基硅氧烷（PDMS，道康宁Sylgard 184硅橡胶弹性体套件）（Fisher Scientific，目录号：NC9285739）
70％乙醇（Fisher Scientific，目录号：NC9663244）
异丙醇（Fisher Scientific，目录号：A416-500）
丙酮（Fisher Scientific，目录号：A18-500）
蒸馏水
不含氨基酸的酵母氮碱基（Fisher Scientific，目录号：DF0919-15-3）
氨基酸的完整补充混合物（CSM）（Fisher Scientific，目录号：MP114500012）
D-（+）-葡萄糖（Sigma，目录号：G7021）
铝箔（Fisher Scientific，目录号：01-213-100）
SU-8 2005光刻胶（Microchem ）
SU-8 2025光刻胶（Microchem ）
SU-8显影剂（Microchem ）
95％（3-巯基丙基）三甲氧基硅烷（Sigma，目录号：175617）
Pluronic F-127（Sigma，目录号：P2443）
压缩N 2 （空气，目录号：NI 300）
合成完全（SC）培养基+ 2％w / vol葡萄糖（1 L）（请参阅食谱）

设备

1. 玻璃Erlenmyer 烧瓶250毫升（Fisher Scientific公司，目录号：FB500250）

2. 计时器（Fisher Scientific，目录号：06-664-252）

3. 硅片（University Wafers，目录号：783）

4. 活检打孔器1毫米（VWR，目录号：95039-092）

5. 电动倒置式荧光显微镜（奥林巴斯，型号IX81 ）

6. EMCCD相机（光度学，型号：Evolve 512）

7. X-Cite 精确荧光光源（流明动力学）

8. 光学滤光片ET-EGFP（Chroma Technology Corporation，目录号：U-N49002； Ex 470/40 nm Di495 Em 525/50 nm）

9. 光学滤光片ET- DsRed （Chroma Technology Corporation，目录号：U-N49005； Ex 545 / 30nm Di570 Em620 / 60 nm）

10. 物镜10×（奥林巴斯，计划10x / 0.25 NA）

11. 物镜60×（奥林巴斯，PlanApo N 60x / 1.42 NA油）

12. 物镜100×（奥林巴斯，UPlanFL N 100x / 1.3 NA油）

13. 显微镜温度控制系统（生命成像服务，Cube和The Box）

14. 中高端计算机，用于控制显微镜和基于压力的微流体流量控制系统以及图像分析

15. 基于压力的微流控制系统（Flugent ，MFCS）

16. 流量平台（Fluigent ，Flowboard ）

17. 流量控制模块（Fluigent ，流量单位M）

18. 真空干燥器（SP Scienceware ，目录号：F42020-0000）

19. O 2 等离子清洁剂（Harrick等离子，型号：PDC-002）

20. 真空泵（Harrick等离子，型号：PDC-VPE-2）

21. 实验室烤箱（Fisher Scientific，目录号：51-028-113H）

22. 天平（梅特勒-托利多，目录号：ML4002T）

23. 台式离心机（Eppendorf，目录号：540500004 2 ，型号：5425 ）

24. 3D打印的持有人（打印文件位于https://github.com/Lab513/contrib）

25. 旋涂机（La urell ，型号：WS-650），用于通过特殊的3D打印支架装载单元

26. 振荡培养箱（Thermo Fisher Scientific，目录号：SHKE4000-1CE）

27. 分光光度计（Eppendorf，目录号：6133000010）

28. 热板（Fisher，目录号：S50462CH）

29. 镊子（Fisher Scientific，目录号：16-100-103）

30. 本生灯（Fisher Scientific，目录号：03-902Q）

31. Pipetman ，各种尺寸（Gilson）

32. 化学罩

33. 光掩模对准器（苏斯Microtec的，型号：MJB4）

34. MECANIC 表面光度仪（Veeco公司，DEKTAK 150）

35. 光学显微镜（尼康，型号：LV150）

36. 光刻胶旋涂机（布鲁尔科学公司，Cee Model 200x-F）

37. 2个热板（Fisher Scientific，目录号：90-691-11）

软件

ImageJ（Schneider 等人，2012，https：//imagej.nih.gov/ij/）
µManager （Edelstein 等，2014，https： //micro-manager.org/ ）
Matlab R2016b（MathWorks ，https: //www.mathworks.com/products/matlab.html ）
Adobe Illustrator 2015（Adobe，https://www.adobe.com/products/illustrator.html）
L-Edit软件（Tanner，https://www.mentor.com/tannereda/l-edit）
多合一（A- i -O，Fluigent ，https: //www.fluigent.com/ ）

程序

主晶圆微加工
微细加工可能是繁琐且复杂的过程，无尘室工作人员通常需要对其进行培训。每个洁净室可能配备有不同的仪器，这些仪器具有独特的设置和操作步骤，这些设置和操作步骤可能与以下微加工方案有所不同。请谨慎操作，并根据当地条件调整微细加工方案。一旦掌握了该工艺，就可以在4小时内生产出“酵母机”复杂度的母片（图2）。

打开面罩对准器，气体和真空管线以及紫外线灯。
将热板设置为65°C和95°C。
用铝箔覆盖旋涂机的表面，以最大程度减少SU-8污染。
依次用丙酮，异丙醇和水冲洗硅晶片的抛光面，以除去所有污垢。用每种溶液冲洗后，用压缩的N 2 吹扫晶片的两面，直到晶片完全干燥为止。
在6 mbar下用O 2 等离子清洁剂清洁并激活晶片表面6分钟。
将晶圆放在旋涂机的卡盘上居中，并使抛光面朝上。
打开真空管线以将晶圆固定在适当的位置，并确保其完全居中，否则SU-8不会均匀散开。
根据SU-8手册对旋涂机进行编程。我们以500 rpm的速度运转10 s，以6,000 rpm的速度运转30 s。这些设置在时间上不一定一致，因为它们取决于SU-8年龄和环境条件。
在硅晶片上铺上已知厚度的SU-8 2000环氧基树脂。SU-8 2000树脂有十二种变体，它们的粘度不同。通过它们，可以通过一次涂覆工艺制成厚度为0.5 µm至200 µm的树脂层。由于“酵母机”由两层重叠组成，一层用于细胞室，厚度为4.5 µm，另一层用于营养物质通道，厚度为25 µm，因此从较薄的一层开始。对于4.5 µm的厚度，请使用SU-8 2005树脂。
在中心倒入1毫升/英寸的晶圆直径（对于4英寸晶圆为4毫升），并通过将SU-8树脂倒在晶圆表面附近来避免气泡。
等待3-5分钟，以使气泡和气泡上升。
运行涂层微调器的预先准备的程序。
完成后，释放真空并从卡盘中取出晶片。如果SU-8层并不均匀，清洁用异丙醇晶片并重复从过程小号TEP 甲4。
用镊子将晶片直接转移到95°C的热板上，然后“软烘烤” 2分钟。
用镊子将晶片转移到掩模对准器上。环氧树脂基树脂是光敏性的，一旦从紫外线中暴露于高能光子中，它就会通过交联固化。将铬掩模放置在覆盖有树脂的硅晶片上方，并且仅通过掩模上的图案将硅晶片暴露于紫外线。掩模与晶圆之间的真空接触使用4.5 s的曝光时间。我们使用的紫外线灯的曝光能量接近20 mJ cm -2 s -1 。
从对准器上用镊子取出晶片，并将其放在95°C的热板上3分钟，以进行曝光后烘烤。
将带有镊子的晶片从加热板上取下，并在化学防护罩中将其冷却至室温。将晶片直接转移到显影剂中会导致破裂。
将SU-8显影剂倒入玻璃皿中，确保有足够的量完全覆盖晶片。
将晶片浸入SU-8显影剂中。这将除去在紫外线照射下未固化的树脂部分。
搅拌晶片2分钟。
用异丙醇洗瓶轻轻冲洗晶片，并用压缩的 N 2 小心干燥。
在光学显微镜下检查图案。如果可见一些微裂纹（亚微米细黑线），请将晶片放在95°C的热板上放置5-10分钟。这将完全治愈微裂纹。
对25 µm的营养通道层重复相同的步骤（S tep s A 6- A 22），并调整参数，如下所示：S teps A 24- A 32。
分两步旋转SU-8 2025，500 rpm持续10 s和4,000 rpm持续30 s。
在65°C下“软烘烤”晶片3分钟，在95°C下“烘烤6分钟”。
用镊子将水转移到掩模对准器上，注意将掩模上营养通道的图案与晶片上现有的细胞腔室图案正确对准。为此，请使用蒙版上的对齐十字。
在掩模和晶圆之间进行真空接触的情况下，将晶圆暴露在紫外线下8秒钟。
从对准器上用镊子取出晶片，并将其放在热板上，在65°C下放置1分钟，在95°C下放置6分钟，以进行曝光后烘烤。
将带有镊子的晶片从加热板上取下，并在化学防护罩中将其冷却至室温。
将晶片浸入SU-8显影剂中，并用手搅拌5分钟。
用异丙醇洗瓶轻轻冲洗晶片，并用压缩的N 2 小心干燥。
在光学显微镜下检查图案。如果可见一些微裂纹（亚微米细黑线），请将晶片放在95°C的热板上5-10分钟。这将完全治愈微裂纹。
使用Dektak 150表面轮廓仪检查主晶片上图案的尺寸。如果尺寸不正确（误差最高可达10％），请制作新的主晶圆。
最后，将主晶片在P ETRI皿中并与（3-巯基丙基）把它三甲氧基硅烷95％在1个小时蒸气通过将晶片放置靠近塑料杯硅烷几滴在被抽真空的阶段干燥器中。由于硅烷是有毒化合物，因此请在化学防护罩中小心执行此操作。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 1902881--1403 Pascal Hersen 810685 \ Figs jpg \图2.jpg

图2. 微流体装置的制造。环氧树脂基树脂散布在硅片上，并通过定制设计的镀铬掩模用紫外线照射。树脂的可溶性部分被洗掉，并且取决于微流体装置的层数，可以进行新的树脂沉积循环。将主晶片硅烷化，并用作可重复使用的负模以生产微流控芯片。然后将聚二甲基硅氧烷（PDMS）倒在原版晶圆上并固化，直到聚合为止。PDMS芯片通过等离子粘合与玻璃盖玻片粘合。最终的微流控芯片用于培养细胞并输送营养。较薄的部分是细胞室，较厚的部分是主要营养通道。这个数字是从原始文章（Marinkovic 等人，2019）修改而来的。

在聚二甲基硅氧烷（PDMS）中铸造“酵母机器”
现在在母盘上制作了所需的图案，借助PDMS，可以将其用作“酵母机”芯片的复制模制的底片。PDMS是一种可透过气体的透明生物相容性硅聚合物。当其为单体时为粘性流体，一旦在固化剂催化的反应中均聚即为弹性。

在塑料称量盘中以10：1的质量比混合PDMS基料和固化剂。首次浇铸整个PDMS模具时，请使用30 g PDMS基料和3 g固化剂。仅切掉“酵母机器”部分后，仅重新浇铸3克PDMS基料和0.3克固化剂就足够了。
用移液器吸头或类似装置充分混合。
在真空干燥器中将PDMS脱气，直到所有气泡消失，大约30分钟。
将脱气的PDMS倒入P tritri盘中的主晶圆上。如果再次出现气泡，则对整个晶片进行脱气，直到气泡消失。
将PDMS在65°C的温度下最少固化2小时，或在实验室烘箱中过夜。

组装“酵母机”
对于每个实验，请始终使用新组装的微流体芯片。“酵母机”无法回收用于其他实验。

将矩形周围的PDMS轻轻切成矩形。注意不要通过对手术刀施加太大的压力来使主晶圆破裂。还建议让固化的PDMS冷却至室温，以避免损坏主晶圆。
小心地从主晶片上剥离PDMS。
在显微镜下检查PDMS及其图案，以检测可能的缺陷。如果缺陷是由损坏的主晶圆引起的，请制作新的主晶圆。
将切好的PDMS朝上放在切割垫上。
用活检打孔器在营养通道的两端仔细打孔。始终使用锋利的活检打孔器，并在显微镜下检查孔中是否有裂纹，否则介质可能会泄漏。
使用胶带清洁PDMS的表面和玻璃盖玻片。
将PDMS图案的一面朝上，并将玻璃盖滑入等离子清洁器中。
打开真空泵，然后关闭等离子清洁器。
将功率设置为高以点燃等离子体。
出现粉红色的发光等离子体后，请等待1分钟，然后关闭电源。
轻轻打开等离子清洁器的阀门以允许空气流入。现在可以安全地关闭真空泵。
立即并小心地将PDMS图案的一面朝下放在暴露于等离子的玻璃盖玻片上。
使用镊子轻轻触摸PDMS的顶部，以利于粘合。注意，按下图案可能会使它们塌陷。
在芯片顶部放一块胶带，以防止灰尘粘结到芯片上。
将键合的设备在65°C下烘烤1小时或过夜以固化键合。
注入10 µl溶于蒸馏水的灭菌的1％Pluronic F-127过滤器，并在室温下等待30分钟以钝化内表面。请注意，在使用移液器将液体注入通道之前，将一滴液体倒在入口上，以防止气泡进入通道。
用无菌蒸馏水或SC介质冲洗通道，以去除Pluronic F-127。再次注意不要将气泡注入通道中。首先将一滴液体倒入入口。
现在，微流体芯片已准备好装载酵母。

细胞培养和上样
在实验前一天将酵母细胞在30 ml 振荡培养箱中的5 ml含有2％w / vol 葡萄糖的合成完全（SC）培养基中进行实验前一天的过夜培养。
在实验当天，将细胞稀释50倍至50 ml SC + 2％w / vol 葡萄糖中。
将它们在30°C的振荡培养箱中培养5-6小时，直到达到OD 600 为0.2-0.4。
将1 ml细胞放入1.5 ml Eppendorf管中，以300 xg的RCF离心1分钟。
将细胞重悬于20 µl SC培养基+ 2％w / vol 葡萄糖中。
用移液管将10 µl重悬细胞装入通道。为确保没有气泡进入，请先将一滴液体倒入进样口，然后装入样品池。
将芯片用胶带固定在定制的3D打印固定器（图3）上，并使细胞腔面向外，以便离心力可以将细胞从培养基通道推入细胞腔。如图3A所示，必须将芯片牢固地压在支架上，并在一侧粘贴。贴带后，芯片应完全固定。
将3D打印的支架连接到Laurell WS-650旋涂机上，并以110 xg 离心2分钟。
或者，将芯片用胶带绑在离心机上，以确保将力将细胞推入细胞室。
在显微镜下检查是否有细胞已装入细胞室。通常，将两层细胞推向细胞室的死角（最远离培养基通道的一端）。
用SC培养基+ 2％w / vol 葡萄糖将剩余的细胞冲洗出培养基通道，确保没有气泡进入系统。为防止气泡进入，请先将一滴液体倒入入口，然后冲洗细胞。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 1902881--1403 Pascal Hersen 810685 \ Figs jpg \图3.jpg

图3 。电池装载设备。A. 3D 打印的芯片固定器，用于在其上安装了“酵母机器”的情况下进行离心（通道用不同的染料着色，以实现更好的可视化）。B.用于将细胞离心进入细胞室的旋涂机。这个数字是从原始文章（Marinkovic 等人，2019）修改而来的。

媒体灌注和成像
有多种选择可使用静水压力，蠕动泵，注射泵或基于压力的泵在微流控芯片中灌注介质。我们选择基于压力的泵，因为它们可以无缝控制通过系统的介质流量。流量控制模块可确保恒定的介质流量，无论系统中是否有堵塞或气泡。当控制系统试图及时保持相同的流速时，通常会消除这些现象。

打开显微镜并将其加热到30°C。
在50 ml Falcon管中准备50 ml具有适当葡萄糖浓度的SC培养基。
根据系统随附的说明，组装基于压力的微流控系统（MFCS，Fluigent ），并与流率平台（Flugent ）和流率控制模块（Flugent ）耦合。有关详细信息，请参见图4。
将输入和输出管连接到芯片。在将介质连接到芯片之前和同时，请确保介质从管中流出的速度非常缓慢，以防止气泡进入系统。
在所有功能于一体的流动（A-设定我-O，Fluigent ）软件以最大冲洗掉从营养物通道的所有剩余的细胞，然后设定流量恒定5微升/分钟。
将输出保持在高于大气压100 mbar的恒定压力下，以最大程度地减少营养通道内气泡的形成。
在将其安装到显微镜之前，请检查芯片是否存在潜在泄漏。
将芯片放在显微镜载物台上，并用胶带将其固定到位。
设置与实验相关的图像采集参数。理想情况下，以最低的强度和曝光和尽可能短的时间间隔对尽可能多的位置成像。如果要在一帧中观察一组完整的细胞室，请使用10倍物镜。如果要在单个单元格级别观察细节，请使用60倍或100倍油浸式物镜。一个典型的实验的持续时间是24 - 72小时。但是，我们确实进行了长达一周的实验，而没有出现重大中断。
检查成像的前几个间隔，以确保焦点稳定且视野没有漂移。
偶尔检查是否没有堵塞或泄漏妨碍正在进行的实验。堵塞主要发生在系统中形成气泡的情况下，泄漏主要发生在入口或出口破裂的情况下。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 1902881--1403 Pascal Hersen 810685 \ Figs jpg \图4.jpg

图4 。微流体设备设置。A.用Fluigent MFCS压力泵对储液罐加压，导致流过流量传感器进入切屑，然后浪费。流量传感器和压力泵连接到流量控制模块，该模块可保持通过系统的恒定流量。营养供应和培养基条件可以实时更改。B.安装在显微镜上的微流控芯片。这个数字是从原始文章（Marinkovic 等人，2019）修改而来的。

数据分析

有关数据处理和分析的信息，Matlab 代码，统计信息，数据包含/排除的条件，重复次数的详细信息，每个图形的确切数据集以及有关可重复性和可变性的注释，请参见此处（Marinkovic 等，2019）。）。

为了优化采集时间和图像分析，显微图像通常是用10倍物镜拍摄的。这允许整个细胞腔室集合适合单个图像，而无需填充多个图像。使用开源的µManager显微镜软件（Edelstein 等，2014）控制显微镜的组件并建立图像采集。通过特定的滤光器获取的一堆延时图像被保存到单个图像中。tif （标记图像文件格式）文件，并使用开源ImageJ（1.51p）软件进行分析（Schneider 等人，2012）。

正面和局部速度
原始文章的方法部分在“图像分析”下介绍了用于计算前沿速度和局部速度的图像分析（Marinkovic 等，2019）。

基因表达
在图像分析过程中，使用感兴趣区域（ROI）管理器（ImageJ软件包）跟踪了每个细胞腔，该区域覆盖了单个细胞腔的50 µm宽度和800 µm长度。获得的像素强度的所有值以“酵母机”背景的值（归一化，即，背景噪声）用于沿800微米长室的每个位置。通过使用ROI管理器中的Multi Plot功能，可以为每个纵向位置计算感兴趣时间点处堆叠图像的平均像素强度。要将位置和强度数据从ImageJ导出到Excel，使用了“配置文件”窗口中的“保存”功能。然后将Excel工作表中的数据导入到Matlab中进行进一步处理。这样，我们获得了有关腔室每个区域平均细胞荧光的信息，并使用原始文章中可用的定制Matlab 脚本对其进行了处理（Marinkovic 等人，2019）。

笔记

可以在原始文章中的人物和电影中看到代表性的结果（Marinkovic 等，2019）。
可以在以下链接https://doi.org/10.7554/eLife.47951.005上查看使用“酵母机器”获得的典型结果的综合视频。
主晶片的产量从“步骤”的部分A可以外包给商业微细加工公司（例如，https://www.micruxfluidic.com）。

菜谱

合成完全（SC）培养基+ 2％w / vol 葡萄糖（1 L）
6.7克不含氨基酸的酵母氮碱

0.79克氨基酸完全补充混合物（CSM）

20克葡萄糖

蒸馏高压灭菌水至1 L

将各成分作为过滤器在蒸馏水中灭菌10倍的溶液

致谢

这项工作得到了支持法新社国立，大学索邦大学巴黎的跨学科计划;德拉RECHERCHE（ANR-16 CE12-0025-01冰山ANR-10 BINF-06-01）太阳城中，我是谁？卓越实验室（ANR-11-LABX-0071和ANR-11-IDEX-0005-01）和欧盟研究计划（Horizon 2020）研究与创新计划下的欧洲研究委员会（ERC）（授权协议号724813）。该协议改编自Marinkovic 等。（2019）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考资料

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