材料和试剂

1. 1.7毫升微型离心管（托马斯Scientific，目录号：1159M35）

2. 96孔PCR微孔板（Thermo Scientific，目录号：AB0800）

3. TBS（Tris缓冲盐水）（150 mM NaCl，20 mM Tris pH 7.5）

4. SYPRO橙色蛋白质凝胶染色（Thermo Fisher Scientific，目录号：S6650）

5. 透明微孔板密封膜（汉普顿研究公司，Cleaseal，目录号：HR4-521）

6. 醋酸钠（Fisher Scientific，目录号：BP334）

7. 柠檬酸钠（Fisher Scientific，目录号：S279）

8. MES（Sigma-Aldrich，目录号：M2933）

9. 碳酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：C4945）

10. Bis Tris（费希尔科学公司，目录号：BP301）

11. 咪唑（Fisher Scientific，目录号：AC301872500）

12. MOPS（美国生物分析，目录号：AB01270）

13. HEPES（费希尔科学公司，目录号：BP310500）

14. Tris（Fisher Scientific，目录号：BP152）

15. 比辛（Sigma-Aldrich，目录号：B3876）

16. 甘氨酸（Fisher Scientific，目录号：BP381）

17. CHES（Sigma-Aldrich，目录号：C2885）

18. 乙醇胺（ACROS organics，目录号：AC149582500）

19. CAPS（Sigma-Aldrich，目录号：C2632）

20. 甘油（Chem Impex，目录号：30144）

21. 氯化钠（Fisher Scientific，目录号：S271）

22. 感兴趣的45微克蛋白质（24种条件下）。

笔记：

答。蛋白质应是均匀的（SDS-PAGE凝胶上的单一条带）和单分散的（大小排阻色谱上的单峰）。

乙。用于该方案的蛋白质包括伪狂犬病病毒（PRV-UL37 N，PRV-UL37 C）UL37同系物的N和C末端结构域和全长蛋白质（PRV-UL37FL）。使用两轮亲和层析和一轮大小排阻层析纯化所有蛋白质。有关纯化PRV UL37的详细说明，请参见Pitts等人。（2014）和Koenigsberg等人。（2018年）。多个蛋白质批次导致每个蛋白质具有可比的热稳定性曲线。

设备

1. 台式离心机（贝克曼库尔特，型号：Allegra X-15R）

2. qPCR机器（Roche，LightCycler 480，目录号：05015278001）

软件

1. ThermoQ（MATLAB，MathWorks，http://www.hotproteins.com网站)

程序

A、缓冲液和蛋白质制备

1. 制作1毫升以下缓冲液：

100毫米醋酸钠，pH值5.0

100毫米柠檬酸钠，pH值5.5

100毫米MES pH 6.0

100毫米碳酸钠，pH值6.5

100 mM双Tris pH 6.5

100毫米咪唑，pH值7.0

100 mM管道，pH值7.0

100毫米丙二酸钠，pH值7.0

100毫米拖把，pH值7.5

100毫米HEPES，pH值7.5

100毫米Tris pH 8.0

100毫米比辛pH值9.0

100毫米甘氨酸pH值9.0

100毫米CHES pH 9.5

100毫米瓶盖，pH值9.5

200毫米HEPES，pH值7.5

200毫米HEPES，pH值7.5，50毫米NaCl

200毫米HEPES，pH值7.5，150毫米NaCl

200毫米HEPES，pH值7.5，300毫米NaCl

200毫米HEPES，pH值7.5，500毫米NaCl

200 mM HEPES，pH 7.5，150 mM NaCl，5%甘油

200 mM HEPES，pH 7.5，150 mM NaCl，10%甘油

200毫米HEPES，pH 7.5，500毫米NaCl，5%甘油

注：缓冲液的浓度应为预期筛选浓度的2倍，因为按1:1的比例添加蛋白质溶液将使缓冲液稀释一半。可使用任何缓冲液（即pH、盐、洗涤剂等）。这里使用了一个pH范围在5.0-9.5之间的筛选，以及用于蛋白质纯化的缓冲液的有针对性的优化。优化包括增加盐和甘油的浓度，这两种物质都可以提高蛋白质的稳定性（Yamasaki等人。，1990年和Vagenende等人，2009年）。

2. 制成300微升蛋白质溶液，最终浓度为0.15毫克/毫升（TBS）。

3. 将SYPRO橙色染料按1:1000稀释加入蛋白质溶液中。

4. 每孔96孔微孔板用移液管移取10微升筛网缓冲液（步骤A1）。

5. 向每个含有缓冲液（1:1）的孔中加入10微升蛋白质染料溶液。

注：最终蛋白质浓度为0.075 mg/ml，最终缓冲液浓度为步骤A1中所列的0.5倍。

6. 用缓冲液和染料（不含蛋白质）建立对照。

7. 用透明薄膜封板。

8. 室温下，在500 x g下旋转96孔微孔板1分钟。

B、在Roche LightCycler 480上创建Thermofluor方法

1. 将滤波器设置为465nm用于激发，610nm用于发射

2. 单击“新方法”图标，在“程序”窗口中选择“熔化曲线”作为分析模式

3. 创建两步方法：

a、步骤1：设定25个目标保持10秒（无数据采集）摄氏度

b、步骤2：设定95°C的目标，以每°C 3次荧光测量的速率连续采集

4. 将方法另存为模板

5. 插入含蛋白质染料缓冲液的96孔微孔板

6. 新方法模板>热氟树脂>应用模板

7. 单击开始运行，输入数据文件的名称

8. 运行完成后，将数据导出为.txt文件，保存到驱动器

数据分析

1. 将.txt文件导入计算机。

2. 打开MATLAB ThermoQ.m脚本（下载自www.hotproteins.com网站).

3. 单击Run>Roche>96 wells>Select File>choose.txt File>Next>Analyze。

4. 脚本将生成四个数字：

a、 ThermoQ图1：所有油井的原始荧光数据。

b、图2:ThermoQ图1中曲线的平滑多项式拟合。

c、 ThermoQ图3:ThermoQ图1中熔化曲线的一阶导数，其中峰值对应于展开转变。

d、 ThermoQ图4：所有油井熔化温度概述。

5. 要从ThermoQ图4中获得精确的熔化温度，请从顶部菜单中选择数据光标，然后单击正方形的左下角，Z坐标表示熔化温度（图2）。

6. ThermoQ图3可用于确定是否存在多个熔化事件（即多个峰值）。

使用UL37N、两种版本的UL37C和全长的UL37进行Thermofluor试验（图1）。UL37N蛋白在管道（pH7.0）或丙二酸钠（pH7.0）缓冲液、极低浓度NaCl和甘油中具有最高的热稳定性（图1C，表1）。因此，UL37N蛋白的所有后续纯化批次以及生化和结构分析（包括结晶）均在其最佳缓冲液（50 mM管道，pH 7.0、50 mM NaCl和0.5 mM TCEP）中进行。甘油被添加到细胞裂解缓冲液中，但在剩下的纯化和储存过程中被排除，因为它会阻碍结晶。

较长的UL37C结构物在HEPES缓冲液（pH7.5）中最稳定，HEPES中的最高熔融温度（TM）为pH7.5、150 mM NaCl和10%甘油（B11）（图1A，表1），用于随后所有UL37C结构物的纯化、表征和储存。全长UL37的熔化曲线导致两个不同的熔化事件，称为TM低和TM高，这与UL37C和UL37N的相应TM几乎相同（图1D，表1）。这表明UL37N和UL37C是UL37的两个独立折叠结构域。在UL37N和UL37C的情况下，热稳定性增加与溶解度增加相关。蛋白质溶解度的测定没有特异性。如果一种蛋白质结构物可以浓缩到更高的浓度，并且在溶液中不沉淀，则认为其溶解度增加。

图1。PRV-UL37的热荧光分析结果。ThermoQ脚本生成的图像（ThermoQ图3）表示熔化曲线的一阶导数（ThermoQ图1）。最大值表示展开转变或熔化温度（TM）。每一条彩色线代表一个与屏幕不同的缓冲区条件。黑线表示产生最高TM的缓冲区条件。结果显示PRV-UL37结构物含有（A）C末端半（UL37C），残基478-919；（B）UL37C，残基478-884；（C）N末端半（UL37N），残基1-496；（D）全长UL37，残基1-919。这项研究最初发表在《生物化学杂志》（Koenigsberg and Heldwein，2018）上。

表1。用热氟测定UL37熔化温度

温度（摄氏度）

嗯

缓冲器

UL37N 1-496标准

UL37C 478-919-StII标准

UL37C 478-884标准

UL37FL（低）

UL37FL（高）

A1号

100 mM醋酸钠，pH值5.0

49.6

41.28

34.94

28.7

44.8

A2型

100 mM柠檬酸钠pH值5.5

57.38

41.28

34.94

41.8

55.8

A3号

100毫米MES pH 6.0

55.88

41.28

34.94

43.1

59.5

A4格式

100 mM碳酸钠pH值6.5

59.71

44.98

41.94

41.2

53.5

A5条

100 mM双Tris pH 6.5

58.06

42.64

39.61

44.1

59.5

A6型

100毫米咪唑，pH值7.0

57.57

42.96

40.95

42.1

58.5

A7级

100 mM管道，pH值7.0

59.54

45.32

41.57

42.8

59.5

A8级

100 mM丙二酸钠，pH值7.0

59.54

45.32

40.6

43.1

59.5

A9号

100毫米拖把，pH值7.5

57.91

45.64

42.27

43.5

57.5

A10号

100毫米HEPES，pH值7.5

58.21

45.98

42.27

45.1

58.9

A11号

100毫米Tris pH 8.0

57.19

45.64

42.64

43.1

60.1

A12号

100毫米比辛pH值9.0

57.57

45.32

41.94

45.8

59.2

地下一层

100毫米甘氨酸pH值9.0

57.91

45.32

43.93

43.5

58.2

地下二层

100毫米CHES pH 9.5

52.41

41.66

40.6

43.1

44.4

地下三层

100毫米乙醇胺，pH 9.5

56.19

44.63

42.92

42.1

43.1

B4级

100毫米瓶盖，pH值10.0

54.39

41.66

39.91

44.1

58.2

B5型

200毫米HEPES，pH值7.5

59.37

43.96

41.57

43.1

58.9

B6型

200毫米HEPES，pH值7.5，50毫米NaCl

59.05

44.63

41.57

45.1

44.4

B7型

200毫米HEPES，pH值7.5，150毫米NaCl

58.38

45.98

42.64

42.1

55.1

B8型

200毫米HEPES，pH值7.5，300毫米NaCl

57.74

46.32

43.24

41.8

55.8

B9型

200毫米HEPES，pH值7.5，500毫米NaCl

57.19

46.99

41.94

43.8

59.9

B10号

200 mM HEPES，pH 7.5，150 mM NaCl，5%甘油

59.54

47.32

43.24

44.1

59.9

B11号

200 mM HEPES，pH 7.5，150 mM NaCl，10%乙醇

60.55

48.64

44.59

45.1

58.9

B12型

200毫米HEPES，pH 7.5，500毫米NaCl，5%甘油

58.38

48.31

44.59

45.5

59.9

使用数据分析步骤5中所述的方法确定具有相应熔化温度的所有UL37结构的准确缓冲条件。

图2。根据ThermoQ图4确定准确的熔化温度。ThermoQ脚本将熔化温度显示为热图（ThermoQ图4），以显示不同缓冲条件之间的相对熔化温度。要确定准确的熔化温度，请单击图2A中用粉红色圈起来的“数据光标”选项。选择“数据光标”后，鼠标显示为横杆。确定热图上与板上感兴趣井相对应的正方形，然后单击图2B中粉红色箭头指示的正方形左下角。将出现一个带有XYZ坐标的黄色小框。Z坐标表示该正方形的熔化温度，单位为°C。灰色背景上的蓝色正方形不包含缓冲区，也不属于屏幕的一部分。注：这是与图1或表1所示数据不对应的示例数据。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）拨款R01 AI056346（给E.E.H.）、Burroughs Wellcome Fund（给E.E.H.）颁发的传染病发病机制研究者奖以及霍华德休斯医学院（给E.E.H.）颁发的教员学者奖。A、 L.K.得到国家卫生研究院培训拨款T32 AI007422的资助。最初的研究论文中也提到了该协议，其中也包含了此处报告的一些数据（Pitts等人，2014年和Koenigsberg等人，2018年）。

相互竞争的利益

E、 E.H.是Thyreos，LLC.的科学联合创始人。J.D.P.目前是Gilead Sciences的员工。作者声明他们与本文内容没有利益冲突。

工具书类

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