材料和试剂

微流体供应
需要一个薄的微流体通道，该通道通常由聚二甲基硅氧烷（PDMS）顶部和玻璃盖玻片底部之间的夹层构造而成;但是，也使用了两个用胶带分开的玻璃盖玻片（Bottier ，2011）。覆盖本协议中PDMS的使用。底部的刚度也可以通过在PDMS上涂一层薄层来修改。遵循此协议，以包括定制PDMS芯片的制造（也可以购买（Bottier ，2011），则需要以下材料：

P rinted掩模，模具的（2D）阴性（FineLineImaging ，自行设计，可以设计与AutoCAD）
芯片的PDMS（Sylgard 184）
12.6 千帕PDMS 对于涂料（东丽道康宁公司，目录编号：CY52-276A和CY52-276B对于12.6千帕）（例如，SM Berge的ř Ť ë ：T的Al ，2016）
3 kPa PDMS涂层（Dow Corning Toray，目录号CY52-276A和CY52-276B）（Style 等，2014）
用于涂层的0.4kPa PDMS（硅酮量子，目录号QGel 920A和QGel 920B）（Gutierrez 等人，2011）
玻璃基板（50毫米玻璃底培养皿，FlouroDish 细胞培养皿； World Precision仪器）
钝尖的21号针头和注射器（McMaster Carr ，目录号：75165A681）。
异丙醇（IPA）
细胞培养用品
培养基和耗材在很大程度上是标准配置，主要的例外是荧光染料。该染料必须与能充分透过膜并能溶于水的物质结合，以使其在整个培养基中均匀分布并排除在细胞外。各种结合物，并沉淀在一个大的葡聚糖基团上。

DMEM（Corning）
PBS（磷酸盐缓冲盐溶液）
青霉素/链霉素（Gibco）
FBS（Sigma-Aldrich）
基质蛋白（50μg / ml I型鼠尾胶原蛋白）（Corning ，目录号354236）
Alexa Fluor 488葡聚糖分子量2,000 kD （Sigma - Aldrich ，目录号：FD2000S-1G）

设备

硅片（Wafer World，目录号：2886）
光刻胶（SU8-3000和Kayaku Advanced Materials显影剂）
烤箱（VWR，Gr Con 2.3CF）
等离子清洁剂（Harrick Plasma，pdc-32g）
显微镜/细胞培养
下面的方法获得了三种成像模式：共聚焦，落射荧光和微分干涉对比（DIC）显微镜技术。仅落射荧光显微镜对于该技术是必不可少的;但是，我们将强调共聚焦示波器在微流体通道高度测量中的价值。设备校准。在本协议中，其他透射光图像（例如，相衬对比度）可以代替DIC图像，尽管我们希望可以通过DIC轻松实现一些步骤。需要标准的细胞培养设备，具体取决于细胞类型。

微细加工
我们制造了PDMS使用标准光刻设备的芯片;然而，由于相对较大的特征尺寸，设备可以被组装到清洁室的一个令人满意的质量外（例如，一个生物安全水平1空间为宜）。新增，这种装置是单层，因此，其结构不需要掩模aligner.A简单UV lightsource ，旋涂机，并且热板应足够模具构造。在基底和PDMS芯片的键合是通过暴露一个或两个部件来实现氧气等离子体可使用多种等离子体源烤箱可用于快速固化PDMS并确保PDMS芯片与基板的粘合;但是PDMS最终将在室温下固化/粘合超声仪可用于清洁PDMS芯片在粘结到基板上之前，但如有必要，可以跳过此步骤。

软件

MATLAB（MathWorks）
ZEN 3.0（蔡司）

程序

构建模具（图案硅片）
设计掩模：我们的掩模，（2D）中示出的模具的负URE 1A），是直的通道的简单阵列，大约17毫米长，并用在其中用于媒体孔各端稍大圆圈1.5mm宽/细胞注射打孔。
将硅晶片放在旋涂机上，然后将其倒在晶片中心上，直到大约涂覆了晶片的2 / 3rds。如果需要，可以先将晶片暴露于氧等离子体中以帮助蒸发的附着力。旋转两次循环，首先在500 rpm以7 s的速度以100 rpm / s的加速度旋转，再以2,000 rpm的速度以30 rpm / s的加速度旋转30 s。这在使用S U8-3000螺旋灯和制造商时产生约15μm 的后曝光高度的建议。
在80℃的电炉上烤（软烤）约40分钟 ℃。
将掩模放在晶片顶部，并使晶片暴露于紫外线下（持续时间取决于光源的强度）。
在显影剂中洗涤晶片，冲洗（在SUA-3000的IPA中），然后干燥。
注意：使用时，模具的特性会降低，我们会将模具存放在阴凉干燥的地方，但不要限制暴露在空气中，可以采取其他步骤来减慢部件的退化；但是，无论采取什么步骤来保护模具，由于模具的特性，高度很可能会随时间而变化。因此，我们建议除了在制造后最初测量模具的高度（通过轮廓仪等）之外，还要使用以下方法来测量最终PDMS通道本身的高度：如下所述的共聚焦显微镜。此外，应注意的是，模具在最初的几次使用中很可能会粘附在PDMS上，因此应特别注意使用新模具以保持图案完整性。

构建微流控芯片
彻底混合（手动搅拌约1分钟）比例为10：1的PDMS（Sylgard 184）有机硅弹性体：固化剂，真空脱气，倒在模具上，并在80°C的烤箱中固化45分钟。
从模具中剥离PDMS并将设备切成所需的尺寸。我们通常将通道布置成可将2-4个独立的通道粘合到单个基板上并同时进行成像。
创建用于注入细胞/培养基的入口和出口。
注意：这可以通过使用21针钝头McMaster Carr 简单地打孔来完成。

清洗设备。W¯¯ Ë超声处理在100 Pasento IPA 15分钟，用清水冲洗干净，而干用压缩空气枪。我们找到了IPA清洗特别有用在清理渠道碎片相比，水洗当家（图1A）。

准备基材
用水冲洗玻璃基材并干燥。我们使用50毫米玻璃底部的培养皿（FlouroDish 细胞培养皿; World Precision Instruments），可以很好地用PDMS进行涂层。如果需要使用PDMS涂层，可以改变基材的硬度，将玻璃盘放在旋涂机上。
对于12.6 kPa的涂层，将0.952重量比的CY52-276A和CY52-276B混合。
对于3 kPa的涂料混合物，CY52-276A和CY52-276B的重量比为1：1 。
对于0.4 kPa的涂层，将1：1重量比的QGel 920A和QGel 920B混合。
用PDMS覆盖大约2/3的玻璃，然后旋转，旋涂机的持续时间和速度会因所使用的PDMS和玻璃基板的不同而不同。旋涂的目的是获得均匀，平坦，透明的透明层。该涂层的最终厚度仅需要足够薄，它并没有超过目标使用和足够厚底层玻璃的整体性质不影响单元的工作距离（即，细胞的机械环境相当于什么如果将其放在大量的涂料上）。
将PDMS芯片暴露在氧气等离子体中约1分钟（时间会随等离子体源而变化），以将PDMS表面从疏水性改变为亲水性，并使其能够与玻璃/ PDMS结合。在基材上，并且在粘合之前不要将涂覆的基材暴露于等离子体中。但是，除了PDMS芯片之外，未涂覆的玻璃基材也可能暴露于等离子体中以帮助粘合。
在80 °C 的烤箱中烘烤粘合的设备45分钟，以确保粘合（图1B）。

带细胞和图像的种子设备
将设备暴露于氧气等离子体中30秒钟，以帮助胶原蛋白/基质蛋白沉积;但是，如上所述，它会使PDMS涂覆的基材起皱。
注入基质蛋白溶液并孵育，我们在37°C 下使用50μg / ml type I大鼠尾胶原（Corning ）分子1 h。
注入PBS冲洗。
准备细胞培养基。可以将细胞接种在标准细胞培养基（补充有10％FBS和1％抗生素溶液，10,000单位/ ml青霉素和10,000μg / ml链霉素[P / S]的DMEM ）中或准备用于成像的培养基中其中包括染料0.1μg / ml的Alexa Fluor 488 Dextran分子量2,000 kD 。如果在初始接种过程中未包含该染料，则必须在以后引入，这可能会干扰并可能去除粘附在通道上的细胞。如果需要长时间进行，则需要在细胞粘附后进行预成像处理，否则会在发生明显的内吞作用时保持不完整。此外，可能会注意到，虽然染料浓度的增加会增加信噪比，但染料浓度趋向于快速光漂白，缺乏这种光漂白的均匀性可能会影响体积计算。
计数细胞并每个通道注入约5万个细胞。此估计需要知道注入介质中的细胞浓度以及通道的近似体积。
将设备浸入细胞培养基中以防止蒸发并孵育（在37°C，5％的CO 2 和90％的相对湿度下），直到细胞粘附为止，应尽快进行成像以避免内吞作用引起的并发症。播种后5小时内成像。
对于每个感兴趣的区域（ROI），都会拍摄两张图像-一幅DIC图像和一张落射荧光图像。在选择所使用的物镜时必须格外小心，聚焦来自狭窄垂直区域（距基板的距离）的物镜可能不会准确地报告由ROI指定的通道的列中包含的染料发出的总荧光。换句话说，所需的总荧光信号包括“散焦”光。这对于较高放大倍率的物镜是有问题的。碰巧，下面的通道和像元高度的计算将是准确的。我们测试了三个蔡司物镜，并使用了三种不同的放大倍率（63x油，0.8 NA，20x空气，0.45 NA和10x空气，0.25 NA），并发现使用20x空气客观而言，我们的体积计算对焦平面的变化相对不敏感，这表明我们正在捕获由ROI指定的整列发射的光。直径和数值孔径（NA）足以进行稳健的形状重建（图1C）。
如果需要，请设置延时摄影实验。请注意，成像频率可能会受到光漂白或光毒性的限制。
在实验完成后，我们建议您以间隔为1μm的z堆栈捕获快速扫描（足够短的像素停留时间）共聚焦图像，并以一些极端的ROI覆盖通道的整个深度。我们通常选择4 ROI位于通道的四个“角”。这些堆栈可用于更好地测量PDMS通道本身的通道高度，该高度可能与模具的原始高度不同。

数据一nalysis

注意：使用的软件：MATLAB（MathWorks）和ZEN 3.0（Zeiss）。

1. 从共聚焦堆栈测量通道高度，对于每个Z平面上的每个ROI，求和总强度，找到代表强度的第二个导数的上下局部最大值的Z值，该值是高度的函数。在这些局部最大值之间，它们与通道高度一致。此外，我们发现每个ROI 的计算通道高度之间存在明显差异，以表明通道几何形状（粘结，碎屑等）存在问题，并且通常从这些有问题的通道中丢弃数据（图1E）。

2. 识别细胞的ROIs我们对背景的处理首先需要确定局部的边界矩形，每个矩形仅包含一个（整个）细胞，我们通过将每个单元格裁剪成单个矩形来完成半自动操作，通常需要花费一秒钟的时间每个单元工作，并允许对结果进行简短的视觉检查；但是，如果需要，可以轻松地将平滑的落射荧光图像中的局部最小值识别为自动生成的边界框的质心。

3. 每个ROI的平滑落射荧光图像。原始图像非常嘈杂并且不可视化。我们发现二维高斯图像滤镜（MATLAB中的“ Immaussfilt ”）可以快速有效地提供一个合理的小标准偏差已选择。

4. 从每个DIC ROI中减去背景由于DIC图像的强度在该协议中未进行量化（在后续工作中，请参见“未来方向”），因此任何可提高像元内部对比度和像元外部均匀性的方法都可以使用。我们通常适合整个DIC ROI到2 次或3 次阶多项式，并从原始图像中减去该表面或可替代地使用具有大的标准偏差的2 d高斯图像滤波器平滑图像DIC和减去经平滑的图像。

5. 从平滑的落射荧光图像中识别出粗糙的细胞边界。使平面适合于与图像背景相对应的像素。这可以通过将平面仅适合于亮像素（顶部20％，50％）或反之排除暗像素来完成。根据强度分布创建一个代表该平面上方/下方像素的二进制图像（遮罩），并标识该二进制图像中最大的“斑点”。

注意：仅给出落射荧光图像，此粗糙的细胞边界可用于体积计算，因为将包括大部分细胞体积；但是，细胞的细小突出区域可能会丢失，这会影响形状重建，并可能导致在某些细胞类型中总体积分数显着。

6. 识别DIC图像的高对比度区域以扩大细胞边界并包括较薄的突出区域。这可以通过识别高局部标准偏差的区域或欧几里德距离变换（例如，MATLAB中的“ bwdist ”）来完成。

7. 合并DIC和落射荧光面具。Connect和修剪“斑点”酌情（例如，应用“ strel ”，“ imerode 在MATLAB”）。取出小“斑点”独立的，以最大的“斑点”和填孔（例如，“ bwareaopen ”，‘ imfill ’在MATLAB）。在这些形态功能被实现会影响最终的mask.Identify小区的边界，从该初级的顺序‘斑点’ （图1D）。

8. 单元高度计算。要计算体积和后续表面积以及形状重建，需要确定每个像素的单元高度。单元的高度在任何点都非常简单。

由于每个像素的荧光强度I （x，y ）与染料量成正比，因此我们可以将其重写为：

通过共聚焦成像获得了通道的高度，并且对落射荧光图像进行了平滑处理，现在剩下的是背景强度的计算以及整个ROI所需的任何归一化。

9. 荧光强度归一化。我们发现在整个ROI上保持均匀的背景强度是不切实际的。通道高度本身以及显微镜光路内的任何物体（实际上是场中的碎屑）的变化都可能导致不均匀。移动染料，弄脏玻璃，在PDMS杂质，等等。）。由于这个原因，我们集中在小区边界之外建立的最佳邻域用于平均背景intensity.We选择了一个环形空间与由通过扩大小区边界指定的内边界10像素，外边界乘以25像素，并将该环带内的平均强度设为I 背景。转换后，平面可能适合于该环带，并且I 背景可能被指定为空间的函数；但是，我们发现情况下，指定我背景这种方式产生了一个显著不同计算量，凹凸的ROI（大碎片等）常常观察到和这些投资回报率被丢弃。

10. 体积计算。给定每个像素的像元高度，只需将高度相加并乘以像素“面积”即可计算出像元的体积，边界内的所有像素都从像元边界扩展了20个像素。求和以解决光散射问题。

11. 表面积计算：首先给定表面上已知的每个点的3D坐标，即（x，y ）和z的高度（例如MATLAB中的“ surfnorm ”），然后计算表面法线：

其中，theta是法向矢量（N x ，N y ，N z ）和其z分量之间的夹角。每个像素的“表面积”是按此值滚动的每个像素的“面积”。，并在z方向上的法向矢量分，θ= 0,1 / COS（θ）= 1。这些值可在小区边界或数值积分方案可以应用于内求和（例如。，“ trapz 在MATLAB” ），以提高准确性（就像我们所做的那样。）请注意，此计算中应排除对应于单元“边缘”的外围像素的法线向量。

12. 单元格形状的重构：给定单元格高度图和DIC图像，可以为每一帧构建单元格的3D插图，以及用于延时摄影的GIF。例如，可以在MATLAB中使用“表面”功能，指定高度图针对z数据，“ texturemap ”为“ FaceColor ”，“无”为“ EdgeColor ”，而对于“的DIC图像Cdata的”。照顾到稳定ROI的中心和DIC亮度随着时间的推移可以创建引人注目的视觉效果使用此方法的细胞迁移和形状变化的变化（图1F）。

13. 细胞形状统计。除了二维投影区域的标准细胞形状统计（例如，周长与面积之比）外，给定高度图，还可以在整个种群中对细胞的顶表面进行类似的分析。我们发现，对于具有足够圆形2D投影形状的细胞类型，将平均高度报告为与细胞体积中心（相当于质心）的距离，可用于比较表型。二维投影形状中的圆形或圆形，具有从质心开始缓慢或快速衰减高度函数的细胞更平坦（更像“薄饼状”）或更半球形。

未来发展方向

如今，实施FXm 的最大挑战仍然是由于内吞作用而导致的延时实验的持续时间有限，由于光漂白/光毒性而导致的延时实验的时间步伐有限以及在微型设备中可能实现的实验方案的范围有限。为了扩大可能使用FXm研究的问题的范围，我们小组的当前工作（Yao 等人，2019）提出了一种新方法，该方法利用通过该协议收集的数据来训练能够直接从中预测细胞高度图的神经网络。 DIC图像（图1G）。尽管在此阶段可能仍需要收集特定于实验或特定于细胞类型的训练数据，但我们希望这种方法的进一步发展可以降低对增加细胞体积感兴趣的小组的进入门槛测量值纳入他们的实验曲目。

的图1中所示漫游FXM 。用微细加工开始，并用图像分析和今后的方向终止。

Acknowledg 发言：

该工作已资助部分由全国学院健康教育资助R01GM114674而U54CA210172。“动态测量的高度和体积迁移细胞的一种新的荧光显微技术”是一个主要的影响为发展本议定书Bottier 等。（ 2011）。

利益争夺

作者没有利益冲突或利益冲突的报道。

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